Abstract
Ischämie-Reperfusion (IR) Verletzung bekannt ist, wesentlich zur Morbidität und Mortalität bei ischämischen Schlaganfällen assoziiert beitragen. Ischämische Schlaganfälle machen 80% aller Schlaganfälle. Eine häufige Ursache für IR Verletzungen ist der schnelle Zustrom von Flüssigkeiten nach einer akuten / chronischen Verschluss von Blut, Nährstoffe, Sauerstoff zum Auslösen der Bildung von freien Radikalen Gewebe.
Ischämischen Schlaganfall wird durch Blut-Hirn-Schranke (BBB) Dysfunktion und vasogenic Hirnödem gefolgt. Strukturell Tight Junctions (TJs) zwischen den Endothelzellen spielen eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Integrität der Blut-Hirn-Schranke (BHS). IR Verletzungen ist eine frühe Sekundärverletzung führt zu einer unspezifischen Entzündungsreaktion. Oxidativen und metabolischen Stress folgenden Entzündung auslöst sekundären Hirnschäden einschließlich BBB Lässigkeit und Unterbrechung der Tight Junction (TJ) Integrität.
Unser Protokoll stellt ein in vitro </ Em> Beispiel von Sauerstoff-Glukose Deprivation und Reoxygenierung (OGD-R) auf Rattenhirn Endothelzellen TJ Integrität und Stressfaserbildung. Derzeit mehreren experimentellen in vivo-Modelle werden benutzt, um die Effekte von IR Schädigung zu untersuchen; sie haben jedoch mehrere Einschränkungen auf, wie die technischen Herausforderungen bei der Durchführung von Operationen, Gens abhängige Molekular Einflüsse und Schwierigkeiten bei der Untersuchung mechanistische Beziehungen. Jedoch kann in vitro Modellen in der Überwindung vieler dieser Einschränkungen zu unterstützen. Das vorgestellte Protokoll verwendet, um die verschiedenen molekularen Mechanismen und mechanistische Beziehungen zu studieren, um potentielle therapeutische Strategien bereitzustellen. Allerdings können die Ergebnisse der in-vitro-Studien von Standard-in-vivo-Studien unterscheiden und sollten mit Vorsicht interpretiert werden.
Introduction
Ischämie-Reperfusions (IR) Verletzung festgestellt wird, das häufige Ursache verschiedener schwächende Komplikationen und Todesfälle im Zusammenhang mit Schlaganfall, Myokardinfarkt, Trauma, periphere Gefäßkrankheit und traumatischer Hirnverletzung 1,2 zugeordnet werden. IR Verletzungen in Hirngefäße ist eine frühe sekundäre Verletzungen, die zu Entzündungen und Ödeme 3. Einer der schwerwiegenden Komplikationen, die als Folge der oxidativen und metabolischen Stress folgenden Entzündung auftritt ist der Verlust der homöostatischen Gleichgewicht, was zu Bildung von freien Radikalen, Veränderungen in der Blut-Hirn-Schranke (BHS) Tight Junctions (TJs) und mikrovaskuläre Permeabilität 4,5.
Derzeit werden in-vivo-Modellen verwendet werden, um die Auswirkungen von IR Verletzung am BBB Studie sind mittleren Hirnarterie (MCAO), Mikroembolien und transgenen oder Knockout-Tieren. Jedoch hat jede ihre Nachteile und Einschränkungen durch Hossmann 6 diskutiert. MCAO-Modell verwendet die effec zu studierents von Redox-Stress, Veränderungen in der Junction-Kommunikation des BBB und die Interaktionen zwischen Gehirn und Immunzellen. Jedoch weisen sie verschiedene technische Herausforderungen, wie die Notwendigkeit für eine präzise Mikrochirurgie und die Schwierigkeiten darin. Mikroembolie sofort bricht die BBB, während die Verwendung von transgenen oder Knockout-Tieren zu zerebraler Ischämie studieren können Herausforderungen wie Gen-abhängige Molekular Einflüsse auf Infarktbildung, Veränderungen in der Gefäßanatomie und unterschiedlichen Körpergewichte 6 haben. Daher wird in vitro-Modellen von Ischämie haben gefunden zunehmendes Interesse in der letzten Zeit vor allem aufgrund ihrer Eignung bei der Durchführung mechanistische Studien für Medikamente. Allerdings können die Ergebnisse der in-vitro-Studien nicht vollständig repräsentieren eine in-vivo-Studie und müssen mit Vorsicht interpretiert werden 6.
Gegenläufig wirkte der geringe Sauerstoffkonzentrationen auf die endotheliale Zellmonoschichten und mikrovaskuläre Permeabilität wurdenstudierte von Ogawa 7. Rattenhirn-mikrovaskulären Endothelzellen (RBMECs) wurden verwendet, um die in vitro BBB entwickeln. Die Sauerstoff-Glukose Deprivation und Reoxygenierung (OGD-R-Technik) in diesem Protokoll vorgestellt wurde von Studien, die von Zulueta et al und Zhu et al 8,9 angepasst. Wir exponierten Hirnendothelzellen auf OGD-R, indem sie in einer Hypoxie / Anoxie Raum mit 0% O 2, 5% CO 2 und 95% N 2. Die Zellen wurden später für die Veränderungen in TJ Integrität und Stressfaserbildung mittels Immunfluoreszenz-Lokalisierung und Rhodamin-Phalloidin Kennzeichnung bzw. beurteilt. Immunfluoreszenzfärbung für das Zonula-occludens-1 (ZO-1) durchgeführt, um festzustellen, TJ Integrität als ZO-1 eine wichtige Gerüst Membran gebunden TJ Protein. Rhodamin-Phalloidin Kennzeichnung bestimmt die filamentöse Aktin (F-Actin) in der Zelle Zytoskeletts und ist ein deutliches Zeichen von Aktin-Stressfaserbildung in Endothelzellen.
<p class = "jove_content"> Das Ziel dieses Verfahrens ist, um einen Einblick in die Entwicklung OGD-R als in vitro-Modell zum Studium IR BBB Endothelzellen TJ Integrität und F-Actin Spannungsfaserbildung bereitzustellen. Die Ergebnisse werden Informationen über das Schicksal der TJ-Protein liefern, ZO-1 und Stressfaserbildung nach OGD-R. Das Verständnis dieser Zusammenhänge wird die Möglichkeit, die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen, die ausgelöst folgenden OGD-R sind zu ermitteln und entwickeln mögliche therapeutische Strategien, um die Störung BBB folgenden OGD-R Behandlung zu verbessern.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Seeding von Endothelzellen
- Erhalten Primärkulturen von RBMEC die von erwachsenen Sprague Dawley Ratten (oder erhalten sie im Handel).
- Kulti RBMECs in 100 cm Fibronectin (50 ug / ml) beschichtete Petrischalen unter Verwendung des Rattenhirn endothelialen Zellwachstumsmedium. Ändern Sie das Medium alle zwei Tage, bis Konfluenz erreicht ist.
- Bei Erreichen von 80 bis 90% Konfluenz, vorsichtig waschen Sie die Zellen in 5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) durch Schwenken. Die Zellen werden dann, indem man sie 1 ml warmem 0,25% Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) -Lösung, auf 37 ° C äquilibriert abgelöst.
- Inkubieren der Zellen bei 37 ° C für 2-5 min, bis die Zellen abgelöst und dispergiert.
HINWEIS: Tippen Sie auf die Kulturschale, um die Zellen zu lösen. Ansicht Zellen unter dem Mikroskop, um eine vollständige Ablösung der Zellen von der Oberfläche der Schale zu bestätigen. - 5 ml vollständigem Medium in eine Petrischale, um Trypsin zu neutralisieren.Pipettieren Sie das Medium, das abgelösten Zellen und sammeln sie in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen. .
- Zentrifugieren Sie die Medien, die Endothelzellen bei 220 xg für 5 min.
- Saugen Sie den Überstand und die Erhaltung der Pellet, das cells.Suspend das Pellet in 3-5 ml frischem Rattenhirn endothelialen Zellwachstumsmedium durch sanftes Mischen nach oben und unten mit Pipette Zellen werden dann unter Verwendung von automatisierten Zellzählers oder einer Zählkammer gezählt werden.
- Übertragen Sie die Zellsuspension in Fibronektin (50 ug / ml) vorbeschichtet 8 auch sterile Kammer Schlittensystem, 0,7 cm 2 / gut mit einer Aussaatdichte im Bereich von 10.000-15.000 Zellen pro Vertiefung. Wachsen die Zellen bei 37 ° C bis zur Konfluenz erreicht ist
HINWEIS: Für die Durchführung Western Blots oder anderen Experimenten Zellen in 10 cm Zellkulturschalen oder spezielle Gerichte wie durch das Experiment erforderlich gehalten werden.
2. Sauerstoff und Glukose-Entzug-Reoxygenierung In-vitro-Modell
HINWEIS: Das folgende Protokoll wurde von Zulueta et al angepasst. 1997; Zhu H et al. 2012 8,9.
- Verwenden Sie die Hypoxie Zellkultursystem, um die Auswirkungen der OGD-R auf RBMECs in (siehe Abbildung 1) zu studieren. Eingestellt und justiert die Hypoxie Zellkultursystem vor Beginn des Experiments gemß den Anweisungen des Herstellers.
- Entfernen der zusammenlaufenden Kammerobjektträgern (Schritt 1.8) von dem 37 ° C Inkubator. Ersetzen die Vollmedium in der Kammer Schlitten mit desoxygeniertem, keine Glucose, Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) und Hypoxie Kammer mit 95% N 2 und 5% CO 2 für 2 h bei 37 ° C vorgelegt, auf OGD Zustand darzustellen.
- Verschieben Sie die Zellen zurück in den Inkubator mit 95% O 2, 5% CO 2 bei 37 ° C und mit frischem Rattenhirn Endothelzellenkomplettmedium vorgesehen und inkubiere für 1 weitere Stunde bei 37 ° C.
Hinweis: Dieser Schritt stellt eine Reoxygenierung Situation. - Mithilfe der Kammer-Objektträgern für Immunfluoreszenzlokalisierung und Rhodamin-Phalloidin Kennzeichnung (siehe Kapitel 3).
3. Immunfluoreszenz Lokalisierung von ZO-1 und f-Actin-Labeling Mit Rhodamin Phalloidin
- Setzen Sie das Kammer-Objektträgern enthalten RBMEC Monoschichten zu 100 ul opti-MEM / reduzierter Serum Medien / well 1 h. 3-mal in 100 ul phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,0 bis 7,2) Waschen Sie die Kammer-Objektträgern.
- Fixieren die Zellen unter Verwendung von 100 ul 4% Paraformaldehyd in PBS (pH 7,0-7,2) für 15 min und Waschen der Kammer-Objektträgern für 3 weitere Male in PBS (pH 7,0-7,2).
- Permeabilisierung der Zellen unter Verwendung von 100 ul 0,5% Triton X-100 in PBS (pH 7,0-7,2) für weitere 15 min. Blockieren mit 100 ul 2% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS für eine Stunde. Nach diesem Schritt entweder Fleck / Label Zellen entweder für ZO-1 oder F-Actin.
- Für die Immunfluoreszenz staining Inkubieren der Zellen mit einem Anti-Kaninchen primären Antikörper gegen ZO-1 in 1: 150 in 2% BSA-PBS für O bei 4 ° C hergestellt / N. In PBS Waschen Sie die Zellen 3-mal, (pH 7,0 bis 7,2). Inkubieren mit 100 & mgr; l Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) -markierten anti-Kaninchen Sekundär-Antikörper für 1 h bei RT.
- Rhodamin Phalloidin Kennzeichnung, nach Blockierung, setzen die Zellen zu 100 ul von Rhodamin-Phalloidin 1:50 Verdünnung in 2% BSA-PBS für 20 min.
- Waschen Sie die Zellen von Immunfluoreszenzfärbung und Rhodamin-Phalloidin Kennzeichnung in PBS (pH 7,0 bis 7,2). Montieren Sie die Kammern mit Montage Medien, die anti-fade-Reagens mit DAPI.
- Visualisierung der Zellen unter Verwendung eines 60 X Wasser-Immersionslinse und die Zellen werden in einer einzigen optischen Ebene unter einem konfokalen Mikroskop gescannt.
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Representative Results
Zellen auf Fibronektin vorbeschichteten Nunc II Kammer-Objektträgern kultiviert wurden OGD-R, indem Sie in einem Biospherix ProOx Modell 110 Kammer unterzogen. Nach Aussetzen Zellen OGD-R, die sie für ZO-1 junctional Färbung mit Immunfluoreszenztechnik verarbeitet wurden, wie in Abbildung 2 und Zytoskelett Anordnung gezeigt anzeigt F-Aktin Bildung von Stressfasern mit Rhodamin-Phalloidin-Färbung Etikett, wie in Fig. 3 gezeigt, die Kontrollzellen waren nicht OGD-R unterzogen zeigte kontinuierliche junctional Integrität während Endothelzellen OGD-R unterzogen zeigte diskontinuierliche Übergänge, was den Verlust von TJ Integrität 2. Kontrollzellen, die nicht mit OGD-R-Behandlung unterzogen wurden, zeigten keine oder nur minimale f-Actin-Stress-Faser Bildung beim Endothelzellen OGD-R unterworfen gezeigt erhöhten f Actin-Spannungsfaserbildung, die die Veränderungen in der Aktin Zytoskelett Anordnung Figur 3; Vertreter rint mit Genehmigung aus Lit. # 13
Abbildung 1. Typische Konfiguration des Hypoxie-System ProOx Modell 110. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Immunfluoreszenz Lokalisierung von Tight Junction Protein (TJP) ZO-1 Nachweis Disruption der Tight Junctions folgenden OGD-R in RBMECs, wie Weiße Pfeile dargestellt. Maßstabsbalken = 10 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version davon zu sehen Abbildung.
Abbildung 3. Rhodamin Phalloidin Labeling für f-Actin Bildung von Stressfasern Demonstration Veränderungen im Zytoskelett-Assembly Nach OGD-R in RBMECs, wie Weiße Pfeile dargestellt. Maßstabsbalken = 10 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
OGD-R als ein in vitro Modell für Ischämie-Reperfusion wurde auch für die Untersuchung Neuronen 10,11 hergestellt. Es gibt auch Studien, die die Wirkung auf OGD Hirnendothelzellen und Veränderungen der Permeabilität und TJ Integrität 9. Unsere Studie zeigt jedoch, die Wirkung von OGD und Reoxygenierung, die eine nähere Darstellung des ischämischen Reperfusionsschaden in In-vivo-Bedingungen, die folgende ischämischen Schlaganfalls auftreten.
Hypoxisch-ischämischen Bedingungen ist bekannt, daß eine Entzündung im zentralen Nervensystem zu induzieren, was zu einer Störung durch die Erhöhung der parazellulären Permeabilität und vasogenes Ödem 4 BHS. Reperfusionsverletzung ist ein sehr komplexer und dynamischer Prozess, bei dem es übermäßige Produktion reaktiver Sauerstoffspezies, ATP-Mangel, Anstieg der extrazellulären Kalium Freisetzung exzitatorischer Neurotransmitter, Endothelzellen und neuronalen Schwellung, Immunzellaktivierung. Dies wiederum causes Aktivierung verschiedener Entzündungswege, was zu einer Produktion, die Induktion von Nukleasen und Proteasen Cytokin, was zu Ödemen, die alle dargestellt sind, verschiedene Caspasen zu aktivieren, was zu einer Störung der Integrität BBB 5,12. Endothelzellen sind besonders anfällig für ischämische Verletzung, aufgrund der Anwesenheit einer großen Anzahl von Mitochondrien. Die benachbarten Endothelzellen sind miteinander durch feste Verbindungen von tight junction-Proteine beibehalten verbunden.
ZO-1 gezeigt ist, eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Integrität TJ durch seine Wechselwirkung mit den anderen tight junction-Proteine spielen und das Aktin Zytoskelett-Montage. Auch ist eine präzise Regelung von Aktin-Zytoskelett notwendig für viele Entwicklungs- und physiologischen Prozessen einschließlich Zell-Zell-Adhäsion. In Endothelzellen wird Aktin Spannungsfaserbildung als mit Barrierefunktionsstörungen und Hyperpermeabilität 13,14 zugeordnet sein. Rhodamin phalloidin Markierungstechnik in der vorliegenden Studie verwendet, um F-Aktin Stressfaserbildung zu beobachten ist eine Endpunkt-Studie. Allerdings kann dynamisch und Live-Bildgebung des Stressfaserbildung auch von Doggett und Breslin 15 gezeigt durchgeführt werden.
Die aktuelle Studie betont majorly den Beitrag der ZO-1 in Richtung des BBB tight junction Integrität. Jedoch können andere Moleküle wie tight junction Claudin- 5, Occludin, junctional Adhäsionsmoleküle (JAM) etc auch als Marker verwendet, um die BBB tight junction Integrität folgenden OGD-R untersuchen. In dieser Studie verwendeten wir Immunlokalisierung und F-Actin Kennzeichnung als qualitative Technik, um die Tight Junction-Integrität zu bestimmen. Wir können aber auch studieren die andere wichtige Eigenschaften des BBB wie quantitative Messung der Durchlässigkeit unter Verwendung von fluoreszierenden Markern und transendotheliale elektrischen Widerstand (TEER).
Der OGD-R-Technik präsentiert in dieser Studie mit derBiospherix System kann nur für Hypoxie / Anoxie Studium an einer festen Konzentration von Sauerstoff verwendet werden; jedoch können wir dieses System nicht verwenden zur Untersuchung der Wirkung von unterschiedlichen Konzentrationen von Sauerstoff an Endothelzellen. Für die Untersuchung der Wirkungen verschiedener Konzentrationen von Sauerstoff auf Endothelzellen müssen wir weitere Modelle für diesen Zweck geeignet zu verwenden.
Diese Technik kann für die Untersuchung der mechanistischen Zusammenhänge zwischen verschiedenen zellulären und molekularen Ereignisse, die BBB Hyperpermeabilität und TJ Integrität regulieren verwendet werden. Verstehen sie wird einen Einblick für die Entwicklung von verschiedenen Molekular Strategien, um BBB-Störung und mikrovaskuläre Permeabilität zu dämpfen.
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Acknowledgments
Wir erkennen an, Scott and White Hospital Research Grants Program für die finanzielle Unterstützung und die Texas A & M Health Science Center College of Medicine Integrated Imaging Laboratory für die Verwendung des konfokalen Lasermikroskop. Wir erkennen an, Mr. Glen Cryer für die Hilfe bei Manuskriptbearbeitung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Proox model 110 | Biospherix | Model 110 | |
| DMEM, no glucose | Gibco, Life technologies | 11966-025 | |
| Rhodamine Phalloidin | Life technologies | R415 | |
| ZO-1 Rabbit Polyclonal Antibody | Life technologies | 617300 | |
| Nunc Lab Tek II-CC 8 well sterile, glass slides | Thermo scientific | 177402 | |
| FITC-tagged anti-rabbit secondary antibody | Santa cruz | sc-2090 | |
| DPBS 1X | Thermo scientific | SH 30028.03 | Any other PBS available can be used |
References
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