Abstract
איסכמיה reperfusion פציעה (IR) ידועה לתרום באופן משמעותי לתחלואה ותמותה הקשורים בשבץ איסכמי. תאונות כלי דם במוח איסכמי מהוות 80% מכל מקרי השבץ. סיבה שכיחה לפגיעה IR היא הזרימה המהירה של נוזלים הבאים חסימה אקוטית / כרונית של דם, חומרים מזינים, חמצן לרקמה מפעילה ההיווצרות של רדיקלים חופשיים.
שבץ איסכמי ואחריו מחסום דם-מוח בתפקוד (BBB) ובצקת מוחית vasogenic. מבחינה מבנית, צמתים הדוקים (TJS) בין תאי האנדותל ממלאים תפקיד חשוב בשמירה על שלמות מחסום דם-המוח (BBB). פציעת IR היא פגיעה משנית מוקדמת שהובילה לתגובה הלא ספציפית, דלקתית. חמצוני ולחץ מטבולים הבאים דלקת גורם לניזק מוחי המשני כוללים חדירות BBB ושיבוש צומת הדוקה יושר (TJ).
הפרוטוקול שלנו מציג במבחנה </ Em> דוגמא למחסור בחמצן גלוקוז וreoxygenation (OGD-R) בתא האנדותל מוח החולדה שלמות TJ והיווצרות מתח סיב. נכון לעכשיו, כמה ניסויים במודלי vivo משמשים כדי לחקור את ההשפעות של פגיעת IR; עם זאת יש להם כמה מגבלות, כגון אתגרים הטכניים בביצוע ניתוחים, השפעות מולקולריות תלויות גן וקושי בלימוד יחסים מכניסטית. עם זאת, במבחנה מודלים עשויים לסייע בהתגברות על מגבלות רבות של אלה. הפרוטוקול שהוצג יכול לשמש כדי לחקור את המנגנונים מולקולריים השונים ומערכות יחסים מכניסטית לספק אסטרטגיות טיפוליות פוטנציאליות. עם זאת, התוצאות של מחקרים במבחנה עשויות להיות שונות מרגילות במחקרי vivo ויש לפרש בזהירות.
Introduction
איסכמיה reperfusion פציעה (IR) נמצאת להיות הסיבה השכיחה לסיבוכים שונים מתישים ומקרי מוות הקשורים לאירוע מוחי, אוטם שריר לב, טראומה, מחלת כלי דם היקפית ופגיעה מוחית טראומטית 1,2. פציעת IR בכלי מוח היא פגיעה משנית מוקדמת וגורמת לדלקת ובצקת 3. אחד הסיבוכים החמורים המתרחשים כתוצאה מחמצון ולחץ מטבולים הבאים דלקת הוא אובדן שיווי משקל homeostatic המוביל להיווצרות של רדיקלים חופשיים, שינויים במחסום דם-המוח (BBB) צמתים הדוקים (TJS) וחדירות כלי דם 4,5.
נכון לעכשיו, במודלי vivo משמשים כדי לחקור את ההשפעות של פגיעת IR על BBB כוללים עורקים התיכון ספיגה מוחין (MCAO), microembolism, ובעלי חיים מהונדסים או נוק אאוט. עם זאת, לכל אחד יש חסרונות ומגבלות שלה כפי שפורט על ידי Hossmann 6. מודל MCAO משמש ללמוד effecTS של מתח חיזור, שינויים בתקשורת junctional של BBB ויחסי הגומלין בין המוח ותאי חיסון. עם זאת, הם מציגים אתגרים טכניים שונים כגון צורך בנהלים מדויקים מייקר והקשיים בהם. Microembolism שובר באופן מיידי את BBB תוך שימוש בבעלי החיים מהונדסים או נוק אאוט ללמוד איסכמיה מוחית עשוי להיות אתגרים כמו השפעות גן תלוי מולקולריות על היווצרות אוטם, שינויים באנטומיה של כלי דם ומשקל גוף שונה 6. מכאן, במבחנה מודלים של איסכמיה שמצאו עניין גובר בתקופה האחרונה בעיקר בבגלל תחולתם בביצוע מחקרים מכניסטית לסמים. עם זאת, התוצאות של מחקרים במבחנה לא יכולות לייצג באופן מלא מחקר in vivo ויש לפרש בזהירות 6.
פעולה נוגדת של ריכוזי חמצן נמוכים בmonolayers תא אנדותל וחדירות כלי דם הייתהלמד על ידי 7 Ogawa. תאי כלי דם במוח חולדה אנדותל (RBMECs) שמשו לפיתוח במבחנה BBB. טכניקת המחסור בחמצן גלוקוז וreoxygenation (OGD-R) הוצגה בפרוטוקול זה הותאמה ממחקרים על ידי אל Zulueta et וג'ו ואח '8,9. אנו נחשפים לתאי אנדותל מוח לOGD-R על ידי הצבת אותם בתא היפוקסיה / אנוקסיה המכיל 0% O 2, 5% CO 2 ו -95% N 2. תאים מאוחר יותר נבדקו לשינויים במבנה סיבי יושרה ולחץ TJ באמצעות לוקליזציה immunofluorescence ותיוג phalloidin rhodamine בהתאמה. מכתים immunofluorescence לoccludens-1 zonula (ZO-1) מבוצע כדי לקבוע שלמות TJ, כZO-1 הוא קרום פיגומים חשוב מחויב חלבון TJ. תיוג Rhodamine Phalloidin קובע אקטין פילמנטיות (-actin ו) בשלד תא התא והוא אינדיקציה ברורה של היווצרות מתח סיב אקטין בתאי אנדותל.
<p class = "jove_content"> מטרתה של שיטה זו היא לספק תובנה פיתוח OGD-R כבמבחנת מודל IR ללימוד שלמות BBB תא האנדותל TJ והיווצרות מתח סיב F- אקטין. התוצאות תספק מידע על גורלו של חלבון TJ, ZO-1 והיווצרות מתח סיב הבא OGD-R. הבנת יחסים אלה מספקת הזדמנות כדי לקבוע את המנגנונים מולקולריים שבבסיס שמופעלים הבאים OGD-R ולפתח אסטרטגיות טיפוליות פוטנציאליות כדי לשפר את ההפרעה BBB לאחר טיפול OGD-R.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. זריעה של תאי האנדותל
- להשיג תרבויות עיקריות של RBMEC של חולדות ספראג Dawley מבוגרות (או לקבל אותם באופן מסחרי).
- לטפח RBMECs בפיברונקטין 100 סנטימטר (50 מיקרוגרם / מיליליטר) צלחות פטרי מצופים באמצעות מדיום צמיחת תאי אנדותל במוח החולדה. לשנות את המדיום כל יומיים, עד שהוא הגיע confluency.
- כשהגיע confluency 80-90%, לשטוף בעדינות את התאים שבנאגרו מלוח 5 מיליליטר פוספט (PBS) על ידי מתערבל. לאחר מכן התאים מנותקים על ידי חשיפתם ל1 מיליליטר של תמיסת 0.25% חמים trypsin- חומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA), equilibrated עד 37 ° C.
- דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 2-5 דקות, עד שהתאים מנותקים ומפוזר.
הערה: לחץ על צלחת התרבות לנתק את התאים. צפה בתאים מתחת למיקרוסקופ כדי לאשר ניתוק של תאים מלאים מפני שטח של הצלחת. - הוסף מדיה 5 מיליליטר מלא לצלחת פטרי כדי לנטרל טריפסין.פיפטה את המדיום המכיל תאים מנותקים ולאסוף אותו לתוך צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר. .
- צנטריפוגה מדיה המכילה תאי אנדותל ב 220 XG במשך 5 דקות.
- לשאוב supernatant ולשמר את גלולה המכילה cells.Suspend גלולה ל3-5 בינוני צמיחת תאי אנדותל מוח החולדה מיליליטר טרי בעדינות על ידי ערבוב אותו ואת עם תאי פיפטה יהיה אז ייספר באמצעות דלפק תא אוטומטי או hemocytometer.
- מעבירים את ההשעיה התא לפיברונקטין (50 מיקרוגרם / מיליליטר) precoated 8 מערכת קאמרי שקופיות גם סטרילי, 0.7 סנטימטר 2 / היטב עם צפיפות זריעה הנעה בין 10,000-15,000 תאים בכל טוב. לגדול התאים ב 37 מעלות צלזיוס עד המפגש מושגת
הערה: לביצוע כתמים מערביים או ניסויים אחרים, ניתן לגדל תאים בצלחות תרבית תאי 10 סנטימטרים או מנות מיוחדות כנדרש בניסוי.
2. חמצן וגלוקוז קיפוח Reoxygenation במבחנהדגם
הערה: הפרוטוקול הבא הותאם מאל Zulueta et. 1997; ג'ו H et al. 2,012 8,9.
- השתמש במערכת תרבות תא היפוקסיה כדי לחקור את ההשפעות של של OGD-R על RBMECs ב( ראה איור 1). התקנה ולכייל את מערכת תרבית תאי היפוקסיה לפני תחילת הניסוי, על פי הוראות יצרן.
- הסר את השקופיות קאמריות ומחוברות (שלב 1.8) מחממת 37 ° C. החלף את המדיום השלם בשקופית הקאמרית עם deoxygenated, אין גלוקוז, בינוני השתנה Dulbecco של הנשר (DMEM) והניח בתא היפוקסיה עם 95%, N 2, 5% CO 2 עבור 2 שעות על 37 מעלות צלזיוס, כדי לייצג מצב OGD.
- הזז את התאים בחזרה לחממה עם 95% O 2, 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס ומסופק עם מדיום תא האנדותל טרי מוח חולדה מלא ודגירה עבור שעה 1 אחרת על 37 מעלות צלזיוס.
הערה: שלב זה מייצג מצב reoxygenation. - השתמש בשקופיות קאמריות ללוקליזציה immunofluorescence ותיוג phalloidin rhodamine (ראה סעיף 3).
3. Immunofluorescence לוקליזציה של תיוג -actin ZO-1 ו- F שימוש Rhodamine Phalloidin
- לחשוף את השקופיות קאמריות המכילות monolayers RBMEC לתקשורת של Opti-ממ / סרום מופחת / 100 μl גם עבור שעה 1. שטוף את השקופיות קאמריות 3 פעמים בשל פוספט שנאגרו מלוח (PBS, pH 7.0-7.2) 100 μl.
- תקן את התאים באמצעות של paraformaldehyde 4% 100 μl בPBS (pH 7.0-7.2) במשך 15 דקות ולשטוף את השקופיות קאמריות לפי 3 יותר בPBS (pH 7.0-7.2).
- Permeabilize התאים באמצעות של 0.5% Triton X-100 ב PBS 100 μl, (pH 7.0-7.2) לעוד 15 דקות. לחסום עם של 2% אלבומין בסרום שור (BSA) בPBS 100 μl לשעה. לאחר שלב זה או תאי כתם / תווית או לתקטין ZO-1 או זיונים.
- לSTA immunofluorescenceining דגירה התאים עם נוגדן נגד ארנב עיקרי נגד ההסתדרות ציונית-1 ב 1: 150, שהוכן ב 2% BSA-PBS לO / N ב 4 מעלות צלזיוס. שוטפים את התאים 3 פעמים PBS, (pH 7.0-7.2). דגירה עם של isothiocyanate והעמסת (FITC) 100 μl -tagged נוגדנים משני נגד ארנב עבור שעה 1 ב RT.
- לתיוג Rhodamine Phalloidin, הבאים חסימה, לחשוף את התאים לשל phalloidin rhodamine 100 μl ב01:50 דילול, שהוכן ב 2% BSA-PBS, במשך 20 דקות.
- שוטפים את התאים ממכתים immunofluorescence ותיוג rhodamine phalloidin ב PBS, (pH 7.0-7.2). הר התאים באמצעות תקשורת הרכבה המכילה מגיב אנטי לדעוך עם DAPI.
- דמיינו את התאים באמצעות עדשת טבילה במי 60 X ותאים נסרקים במטוס אופטי בודד תחת מיקרוסקופ confocal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תאים בתרבית בשקופיות Precoated פיברונקטין Nunc השני קאמריות היו נתונים לOGD-R על ידי הנחת בתא 110 מודל Biospherix ProOx. לאחר חשיפת תאים לOGD-R, הם עובדו לצביעת junctional ZO-1 באמצעות טכניקת immunofluorescence כפי שמוצג באיור 2 והרכבת cytoskeletal מצביע היווצרות מתח סיב F- אקטין באמצעות תווית כתם phalloidin rhodamine כפי שמוצגים באיור 3. תאי בקרה שהיו לא נתון לOGD-R הראה שלמות junctional מתמשכת תוך תאי האנדותל נתון OGD-R הראו צמתים רציפים, המצביעים על הפסד של איור שלמות TJ 2. תאי בקרה שלא נחשפו לטיפול OGD-R הראו סיבי מתח מינימאליים F -actin לא או היווצרות תוך תאי האנדותל נתון OGD-R הפגינו היווצרות F מתח -actin סיבים מוגברת המציינת את השינויים באיור ההרכבה cytoskeletal אקטין 3; נציג דפס באישור הפניה # 13
איור 1. תצורה אופיינית של דגם ProOx מערכת היפוקסיה 110. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. Immunofluorescence לוקליזציה של חלבון צומת הדוק (TJP) ZO-1 הדגמת שיבוש של צומת הדוקים הבאים OGD-R בRBMECs, כפי שמוצג על ידי לבנים חצים. סרגל = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של זה דמות.
איור 3. Rhodamine Phalloidin תיוג לגיבוש ו סיבי מתח -actin הדגמת שינויים בCytoskeletal העצרת בעקבות OGD-R בRBMECs, כפי שמוצגים על ידי לבנים חצים. בר סולם = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
OGD-R כמודל במבחנה לפגיעה איסכמיה reperfusion כבר מבוסס היטב ללימוד נוירונים 10,11. ישנם גם מחקרים המראים את ההשפעה של OGD על תאי האנדותל מוח ושינויים בחדירות וTJ יושרה 9. עם זאת, המחקר שלנו מראה את ההשפעה של OGD כמו גם reoxygenation, אשר היא ייצוג קרוב של פגיעת reperfusion איסכמי בתנאי in vivo המתרחשים שבץ איסכמי הבא.
תנאי חוסר חמצן-איסכמי ידועים לגרום לדלקת במערכת העצבים המרכזית, שהובילה לשיבוש BBB על ידי הגדלת חדירות paracellular ובצקת vasogenic 4. פגיעת reperfusion היא תהליך מאוד מורכב ודינמי, שבו יש ייצור מיני חמצן מגיבים מוגזם, דלדול ATP, לעלות באשלגן תאי, שחרור של שליחים עצביים מעוררים, אנדותל ונפיחות עצביות, הפעלת תאים חיסונית. זה, בתורו גauses הפעלה של מסלולים דלקתיים שונים, שמוביל לייצור ציטוקינים, אינדוקציה של nucleases ופרוטאזות, שמוביל לבצקת, אשר כולם מוצגים להפעיל caspases השונים, שהוביל לשיבוש שלמות BBB 5,12. תאי האנדותל נוטים במיוחד לפגיעת איסכמית, בשל נוכחותם של מספר הגדול של מיטוכונדריה. תאי האנדותל השכנים צמודים זה לזה על ידי צמתים הדוקים מתוחזק על ידי חלבוני צומת הדוקים.
ZO-1 מוצג לשחק תפקיד חשוב בשמירה על שלמות TJ על ידי האינטראקציה שלה עם חלבוני צומת הדוקה האחרים ו ההרכבה cytoskeletal אקטין. כמו כן, רגולציה מדויקת של cytoskeleton אקטין היא חיונית לתהליכים רבים התפתחותיים ופיסיולוגיים כוללים הידבקויות תא-תא. בתאי האנדותל, היווצרות מתח סיב אקטין נמצאת להיות קשורים לבעיות בתפקוד המחסום וhyperpermeability 13,14. phalloi rhodamineדין טכניקת תיוג השתמשה במחקר הנוכחי להתבונן היווצרות מתח סיב F- אקטין הוא מחקר נקודת סיום. עם זאת, הדמיה דינמית וחייה של היווצרות מתח הסיבים יכולה גם להתבצע כפי שמוצגת על ידי דוגט ו -15 ברסלין.
המחקר הנוכחי מדגיש את התרומה majorly של ההסתדרות ציונית-1 לכיוון שלמות הצומת ההדוקה BBB. עם זאת, מולקולות אחרות הדוקות צומת כמו claudin-5, occludin, מולקולות הידבקות junctional (JAM) וכו 'יכולות לשמש גם כסמנים ללמוד על שלמות הצומת ההדוקה BBB הבא OGD-R. במחקר זה, אנחנו עובדים לוקליזציה immunofluorescence ותיוג F- אקטין כטכניקה איכותית כדי לקבוע את יושרת הצומת ההדוקה. עם זאת, אנחנו יכולים גם ללמוד את המאפיינים חשובים האחרים של BBB כמו מדידת כמותית של חדירות באמצעות סמני ניאון והתנגדות Transendothelial חשמלי (Teer).
טכניקת OGD-R שהוצגה במחקר זה באמצעותמערכת Biospherix יכולה לשמש רק ללימודי היפוקסיה / אנוקסיה בריכוז קבוע של חמצן; עם זאת, אנחנו לא יכולים להעסיק את המערכת ללימוד ההשפעה של ריכוזים שונים של חמצן בתאי האנדותל. לחקר ההשפעות של ריכוזים שונים של חמצן בתאי האנדותל אנחנו צריכים להעסיק דגמים זמינים אחרים המתאימים למטרה זו.
טכניקה זו יכולה לשמש ללימוד היחסים מכניסטית בין אירועים תאיים ומולקולריים השונים המסדירים hyperpermeability BBB ויושרה TJ. הבנתם תספק תובנה לפיתוח אסטרטגיות מולקולריות שונות כדי להחליש הפרעה BBB וחדירות כלי דם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
אנו מכירים סקוט ולבן בית החולים תכנית מענקי מחקר לתמיכה כספית וטקסס A & M למדעי בריאות מרכז מכללה למעבדת הדמיה רפואה משולבת לשימוש במיקרוסקופ לייזר confocal. אנו מכירים מר גלן קרייר לעזרה עם עריכת כתב יד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Proox model 110 | Biospherix | Model 110 | |
| DMEM, no glucose | Gibco, Life technologies | 11966-025 | |
| Rhodamine Phalloidin | Life technologies | R415 | |
| ZO-1 Rabbit Polyclonal Antibody | Life technologies | 617300 | |
| Nunc Lab Tek II-CC 8 well sterile, glass slides | Thermo scientific | 177402 | |
| FITC-tagged anti-rabbit secondary antibody | Santa cruz | sc-2090 | |
| DPBS 1X | Thermo scientific | SH 30028.03 | Any other PBS available can be used |
References
- Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation. Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).
- Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. Cell biology of ischemia/reperfusion injury. Int Rev Cell Mol Biol. 298, 229-317 (2012).
- Yang, X., et al. Lycium barbarum polysaccharides reduce intestinal ischemia/reperfusion injuries in rats. Chem Biol Interact. 204 (3), 166-172 (2013).
- Kaur, C., Ling, E. A. Blood brain barrier in hypoxic-ischemic conditions. Curr Neurovasc Res. 5 (1), 71-81 (2008).
- Khatri, R., McKinney, A. M., Swenson, B., Janardhan, V. Blood-brain barrier, reperfusion injury, and hemorrhagic transformation in acute ischemic stroke. Neurology. 79 Suppl 1. (13), S52-S57 (2012).
- Hossmann, K. A. Experimental models for the investigation of brain ischemia. Cardiovasc Res. 39, 106-120 (1998).
- Ogawa, S., Gerlach, H., Esposito, C., Pasagian-Macaulay, A., Brett, J., Stern, D. Hypoxia modulates the barrier and coagulant function of cultured bovineendothelium. Increased monolayer permeability and induction of procoagulant properties. J Clin Invest. 85 (4), 1090-108 (1990).
- Zulueta, J. J., Sawhney, R., Yu, F. S., Cote, C. C., Hassoun, P. M. Intracellular generation of reactive oxygen species in endothelial cellsexposed to anoxia-reoxygenation. Am J Physiol. 272 (5 Pt 1), L897-L902 (1997).
- Zhu, H., et al. Baicalin reduces the permeability of the blood-brain barrier during hypoxia in vitro by increasing the expression of tight junction proteins in brain microvascular endothelial cells. J Ethnopharmacol. 141 (2), 714-720 (2012).
- Abramov, A. Y., Scorziello, A., Duchen, M. R. Three distinct mechanisms generate oxygen free radicals in neurons and contribute to cell death during anoxia and reoxygenation. J Neurosci. 27 (5), 1129-1138 (2007).
- Gundimeda, U., et al. Green tea polyphenols precondition against cell death induced by oxygen-glucose deprivation via stimulation of laminin receptor, generation of reactive oxygen species, and activation of protein kinase Cepsilon. J Biol Chem. 287 (41), 34694-34708 (2012).
- Mehta, S. L., Manhas, N., Raghubir, R. Molecular targets in cerebral ischemia for developing novel therapeutics. Brain Res Rev. 54 (1), 34-66 (2007).
- Alluri, H., et al. Reactive Oxygen Species-Caspase-3 Relationship in Mediating Blood-Brain Barrier Endothelial Cell Hyperpermeability Following Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation. Microcirculation. 21 (2), 187-195 (1111).
- Sun, H., Breslin, J. W., Zhu, J., Yuan, S. Y., Wu, M. H. Rho and ROCK signaling in VEGF-induced microvascular endothelial hyperpermeability. Microcirculation. 13 (3), 237-247 (2006).
- Doggett, T. M., Breslin, J. W. Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP actin. J Vis Exp. (57), (2011).
