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Medicine

एक के रूप में ऑक्सीजन ग्लूकोज अभाव और Reoxygenation Published: May 7, 2015 doi: 10.3791/52699
Automatic Translation
1,2, 2, 1,2, 1,2
1Department of Surgery, Texas A&M University Health Science Center College of Medicine, 2Department of Surgery, Baylor Scott & White Health

Abstract

Ischemia-reperfusion (आईआर) चोट इस्कीमिक स्ट्रोक के साथ जुड़े रुग्णता और मृत्यु दर में महत्वपूर्ण योगदान करने के लिए जाना जाता है। इस्केमिक मस्तिष्कवाहिकीय दुर्घटनाओं सभी स्ट्रोक के 80% के लिए खाते। आईआर चोट का एक आम कारण मुक्त कण के गठन को ट्रिगर के ऊतकों को रक्त, पोषक तत्वों, ऑक्सीजन की भारी / पुरानी रोड़ा निम्नलिखित तरल पदार्थ के तेजी से आमद है।

Ischemic स्ट्रोक रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) ​​के रोग और vasogenic मस्तिष्क शोफ द्वारा पीछा किया जाता है। संरचनात्मक, endothelial कोशिकाओं के बीच तंग जंक्शनों (TJS) रक्त मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) की अखंडता को बनाए रखने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। आईआर चोट एक गैर विशिष्ट, भड़काऊ प्रतिक्रिया के लिए अग्रणी एक प्रारंभिक माध्यमिक चोट है। सूजन निम्नलिखित ऑक्सीडेटिव और चयापचय तनाव बीबीबी पारगम्यता और तंग जंक्शन (टीजे) अखंडता के विघटन सहित माध्यमिक मस्तिष्क क्षति हो सके।

हमारी प्रोटोकॉल एक में इन विट्रो प्रस्तुत करता है </ उन्हें> चूहे के मस्तिष्क endothelial सेल टी जे अखंडता और तनाव फाइबर गठन पर ऑक्सीजन ग्लूकोज अभाव और reoxygenation (OGD-आर) के उदाहरण। वर्तमान में, विवो मॉडल में कई प्रयोगात्मक आईआर चोट के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं; हालांकि वे इस तरह के यंत्रवत रिश्तों का अध्ययन करने में सर्जरी, जीन निर्भर आणविक को प्रभावित करती है और कठिनाई का प्रदर्शन करने में तकनीकी चुनौतियों के रूप में कई सीमाएं हैं, कर सकते है। हालांकि, इन विट्रो मॉडल उन सीमाओं में से कई पर काबू पाने में सहायता कर सकते हैं। प्रस्तुत प्रोटोकॉल संभावित चिकित्सीय रणनीतियों प्रदान करने के लिए विभिन्न आणविक तंत्र और यंत्रवत रिश्तों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, इन विट्रो अध्ययन के परिणामों के vivo अध्ययन में मानक से भिन्न हो सकती है और सावधानी के साथ व्याख्या की जानी चाहिए।

Introduction

Ischemia-reperfusion (आईआर) चोट स्ट्रोक, रोधगलन, आघात, परिधीय रोग और घाव मस्तिष्क चोट 1,2 के साथ जुड़े विभिन्न दुर्बल करने वाली जटिलताओं और मौतों की लगातार कारण हो पाया है। मस्तिष्क वाहिकाओं में आईआर चोट सूजन और शोफ 3 के लिए अग्रणी एक प्रारंभिक माध्यमिक चोट है। ऑक्सीडेटिव और सूजन को निम्नलिखित चयापचय तनाव का एक परिणाम के रूप में होता है कि गंभीर जटिलताओं में से एक समस्थिति मुफ्त कट्टरपंथी गठन के लिए अग्रणी संतुलन, रक्त मस्तिष्क बाधा में परिवर्तन (बीबीबी) तंग जंक्शनों (TJS) और microvascular पारगम्यता 4,5 का नुकसान हुआ है।

वर्तमान में, बीबीबी पर आईआर चोट के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल विवो मॉडल में मध्य मस्तिष्क धमनी रोड़ा (MCAO), microembolism, और ट्रांसजेनिक या पीटा जानवरों शामिल हैं। Hossmann 6 से चर्चा के रूप में हालांकि, प्रत्येक अपनी कमियां और सीमाएं हैं। MCAO मॉडल effec अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता हैरेडॉक्स तनाव के टीएस, बीबीबी की junctional संचार में परिवर्तन और मस्तिष्क और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच बातचीत। हालांकि, वे इस तरह उसमें सटीक microsurgical प्रक्रियाओं और कठिनाइयों के लिए जरूरत के रूप में विभिन्न तकनीकी चुनौतियों प्रस्तुत करते हैं। मस्तिष्क ischemia अध्ययन करने के लिए ट्रांसजेनिक या पीटा जानवरों के इस्तेमाल रोधगलितांश गठन पर जीन पर निर्भर आणविक को प्रभावित करती है, नाड़ी शरीर रचना में परिवर्तन और बदलती शरीर के वजन 6 जैसी चुनौतियों हो सकता है, जबकि Microembolism तत्क्षण बीबीबी टूट जाती है। इसलिए, ischemia के इन विट्रो मॉडल दवाओं के लिए यंत्रवत अध्ययनों प्रदर्शन में होने के कारण उनके लागू करने के लिए मुख्य रूप से हाल के दिनों में बढ़ती रुचि मिल गया है। हालांकि, इन विट्रो अध्ययन के परिणामों को पूरी तरह से एक में vivo अध्ययन का प्रतिनिधित्व नहीं कर सकते हैं और सावधानी 6 के साथ व्याख्या की जानी चाहिए।

Endothelial सेल monolayers और microvascular पारगम्यता पर कम ऑक्सीजन सांद्रता का प्रतिरोधी प्रभाव किया गया हैओगावा 7 से अध्ययन किया। चूहा मस्तिष्क microvascular endothelial कोशिकाओं (RBMECs) में इन विट्रो बीबीबी विकसित करने के लिए इस्तेमाल किया गया। इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत ऑक्सीजन ग्लूकोज अभाव और reoxygenation (OGD-आर) तकनीक Zulueta एट अल और झू एट अल 8,9 द्वारा अध्ययन से अनुकूलित किया गया है। हम 0% ओ 2, 5% सीओ 2 और 95% एन 2 युक्त हाइपोक्सिया / अनॉक्सिता कक्ष में उन्हें रखने के द्वारा OGD-आर को मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं से अवगत कराया। प्रकोष्ठों बाद में क्रमशः इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्थानीयकरण और rhodamine phalloidin लेबलिंग का उपयोग टी जे अखंडता और तनाव फाइबर गठन में परिवर्तन के लिए मूल्यांकन किया गया। Zonula occludens -1 (ZO -1) के लिए immunofluorescence धुंधला ZO-1 के रूप में, टी जे अखंडता को निर्धारित करने के लिए किया जाता है टी जे प्रोटीन के लिए बाध्य एक महत्वपूर्ण मचान झिल्ली है। Rhodamine Phalloidin लेबलिंग सेल cytoskeleton में filamentous एक्टिन (च -actin) निर्धारित करता है और endothelial कोशिकाओं में actin तनाव फाइबर के गठन का एक स्पष्ट संकेत है।

<पी वर्ग = "jove_content"> इस पद्धति का लक्ष्य बीबीबी endothelial सेल टी जे अखंडता और एफ actin तनाव फाइबर के गठन का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो आईआर मॉडल के रूप में OGD-आर के विकास में अंतर्दृष्टि प्रदान करना है। परिणामों टी जे प्रोटीन के भाग्य के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं, ZO-1 और OGD-आर निम्न तनाव फाइबर गठन होगा। इन रिश्तों को समझना OGD-आर निम्नलिखित ट्रिगर कर रहे हैं कि अंतर्निहित आणविक तंत्र का निर्धारण और OGD-आर इलाज के बाद बीबीबी विघटन को बढ़ाने के लिए संभावित चिकित्सीय रणनीति विकसित करने का अवसर प्रदान करेगा।

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Protocol

Endothelial कोशिकाओं के 1. सीडिंग

  1. वयस्क Sprague Dawley चूहों से RBMEC के प्राथमिक संस्कृतियों प्राप्त (या व्यावसायिक रूप से उन्हें प्राप्त)।
  2. 100 सेमी फ़ाइब्रोनेक्टिन (50 माइक्रोग्राम / एमएल) चूहे के मस्तिष्क endothelial सेल वृद्धि माध्यम का उपयोग कर लेपित पेट्री डिश में RBMECs खेती। Confluency तक पहुँच जाता है, हर दो दिन मध्यम बदलें।
  3. 80-90 confluency% पहुंचने पर धीरे घूमता द्वारा 5 मिलीलीटर फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में कोशिकाओं को धो लें। कोशिकाओं तो 37 डिग्री सेल्सियस के लिए equilibrated गर्म 0.25% trypsin- ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) समाधान के 1 मिलीलीटर, करने के लिए उन्हें उजागर द्वारा अलग कर रहे हैं।
  4. कोशिकाओं को अलग और बिखरे हैं जब तक 2-5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं।
    नोट: कोशिकाओं को अलग संस्कृति डिश टैप करें। खुर्दबीन के नीचे देखें कोशिकाओं पकवान की सतह से कोशिकाओं की पूरी टुकड़ी पुष्टि करने के लिए।
  5. ट्रिप्सिन को बेअसर करने के क्रम में पेट्री डिश के लिए 5 मिलीलीटर पूरा मीडिया जोड़ें।अलग कोशिकाओं से युक्त मध्यम बाहर पिपेट और एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में इसे इकट्ठा। ।
  6. 5 मिनट के लिए 220 XG पर endothelial कोशिकाओं से युक्त मीडिया अपकेंद्रित्र।
  7. सतह पर तैरनेवाला Aspirate और फिर स्वचालित सेल काउंटर या एक hemocytometer का उपयोग गिना जा किया जाएगा पिपेट कोशिकाओं के साथ धीरे यह मिश्रण से और नीचे 3-5 मिलीलीटर ताजा चूहे के मस्तिष्क endothelial सेल मध्यम विकास में cells.Suspend गोली युक्त गोली रक्षा करता है।
  8. अच्छी तरह से प्रति 10,000-15,000 कोशिकाओं के बीच लेकर एक बोने घनत्व के साथ / खैर, 8 अच्छी तरह से बाँझ चैम्बर स्लाइड प्रणाली precoated फ़ाइब्रोनेक्टिन (50 माइक्रोग्राम / एमएल) में 0.7 सेमी 2 सेल निलंबन स्थानांतरण। संगम हासिल की है, जब तक 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को विकसित
    नोट: प्रयोग द्वारा अपेक्षित के रूप में पश्चिमी दाग ​​या अन्य प्रयोगों प्रदर्शन के लिए, कोशिकाओं 10 सेमी सेल संस्कृति व्यंजन या विशेष व्यंजनों में उगाया जा सकता है।

2. ऑक्सीजन और इन विट्रो में ग्लूकोज अभाव-Reoxygenationमॉडल

नोट: निम्न प्रोटोकॉल Zulueta एट अल से अनुकूलित किया गया है। 1997; झू एच एट अल। 2012 8,9।

  1. में RBMECs पर OGD-आर के के प्रभाव (चित्रा 1 देखें) का अध्ययन करने के हाइपोक्सिया सेल संस्कृति प्रणाली का उपयोग करें। सेटअप और निर्माता के निर्देशों के अनुसार, प्रयोग की शुरुआत से पहले हाइपोक्सिया सेल संस्कृति प्रणाली जांचना।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर से मिला हुआ चैम्बर स्लाइड्स (कदम 1.8) निकालें। ऑक्सीजन रहित साथ चैम्बर स्लाइड में पूरा मध्यम बदलें, कोई ग्लूकोज, Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) और 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए 95%, एन 2 और 5% सीओ 2 के साथ हाइपोक्सिया कक्ष में रखा गया, OGD हालत प्रतिनिधित्व करने के लिए।
  3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 95% 2 हे, 5% सीओ 2 के साथ वापस इनक्यूबेटर में कोशिकाओं ले जाएँ और ताजा चूहे के मस्तिष्क endothelial सेल पूरा माध्यम से प्रदान की जाती है और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक और 1 घंटे के लिए सेते हैं।
    नोट: इस कदम के लिए एक reoxygenation स्थिति का प्रतिनिधित्व करता है।
  4. इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्थानीयकरण और rhodamine phalloidin लेबलिंग के लिए चैम्बर स्लाइड्स का उपयोग करें (धारा 3 देखें)।

Rhodamine Phalloidin का प्रयोग ZO-1 और च -actin लेबलिंग की 3. इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्थानीयकरण

  1. अच्छी तरह से 1 घंटे के लिए Opti- सदस्य / कम सीरम मीडिया / के 100 μl को RBMEC monolayers युक्त कक्ष स्लाइड्स बेनकाब। फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस, पीएच 7.0-7.2) के 100 μl में चैम्बर स्लाइड 3 बार धोएं।
  2. (पीएच 7.0-7.2) 15 मिनट के लिए पीबीएस में (पीएच 7.0-7.2) 4% paraformaldehyde के 100 μl का उपयोग कोशिकाओं को ठीक करें और पीबीएस में 3 गुना अधिक के लिए चैम्बर स्लाइड्स धो लें।
  3. एक और 15 मिनट के लिए पीबीएस में 0.5% ट्राइटन X-100 के 100 μl, (पीएच 7.0-7.2) का उपयोग कोशिकाओं permeabilize। एक घंटे के लिए पीबीएस में 2% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) के 100 μl के साथ ब्लॉक। ZO -1 या एफ actin के लिए यह कदम या तो दाग / लेबल कोशिकाओं या तो बाद।
    1. इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेशन के लिए150, 4 डिग्री सेल्सियस पर एन / O के लिए 2% बीएसए पीबीएस में तैयार: ining 1 में ZO-1 के खिलाफ एक विरोधी खरगोश प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को सेते हैं। पीबीएस में कोशिकाओं (पीएच 7.0-7.2) 3 बार धोएं। Fluorescein आइसोथियोसाइनेट (FITC) के 100 μl के साथ सेते आरटी पर 1 घंटे के लिए विरोधी खरगोश माध्यमिक एंटीबॉडी -tagged।
    2. Rhodamine Phalloidin लेबलिंग के लिए, अवरुद्ध के बाद, 20 मिनट के लिए, 2% बीएसए पीबीएस में तैयार, 1:50 कमजोर पड़ने में rhodamine phalloidin के 100 μl के लिए कोशिकाओं को बेनकाब।
    3. Immunofluorescence धुंधला और पीबीएस में rhodamine phalloidin लेबलिंग, (पीएच 7.0-7.2) से कोशिकाओं को धो लें। DAPI के साथ विरोधी फीका अभिकर्मक युक्त बढ़ते मीडिया का उपयोग कर कक्षों माउंट।
  4. एक 60 x पानी विसर्जन लेंस का उपयोग कोशिकाओं कल्पना और कोशिकाओं को एक confocal खुर्दबीन के नीचे एक ऑप्टिकल विमान में स्कैन कर रहे हैं।

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Representative Results

फ़ाइब्रोनेक्टिन प्रीकोटेड Nunc द्वितीय चैम्बर स्लाइड्स पर संवर्धित कोशिकाओं एक Biospherix ProOx मॉडल 110 कक्ष में रखकर OGD-आर के अधीन थे। Rhodamine phalloidin दाग लेबल का उपयोग एफ actin तनाव फाइबर के गठन का संकेत चित्रा 2 और cytoskeletal विधानसभा में दिखाया गया के रूप में 3 चित्र में दिखाया के रूप में OGD-आर कोशिकाओं को subjecting के बाद, वे इम्यूनोफ्लोरेसेंस तकनीक का उपयोग कर ZO-1 junctional धुंधला के लिए प्रोसेस किया गया। रहे थे कि नियंत्रण कोशिकाओं OGD-आर के अधीन endothelial कोशिकाओं टी जे अखंडता चित्रा 2 के नुकसान का संकेत है, असंतत जंक्शनों से पता चला है, जबकि OGD-आर के अधीन नहीं नित्य junctional अखंडता दिखाया। OGD-आर उपचार के अधीन नहीं किया गया है कि नियंत्रण कक्षों नहीं है या कम से कम च -actin तनाव फाइबर से पता चला गठन OGD-आर के अधीन endothelial कोशिकाओं एक्टिन cytoskeletal विधानसभा चित्रा 3 में परिवर्तन का संकेत वृद्धि की एफ -actin तनाव फाइबर के गठन का प्रदर्शन करते हुए; प्रतिनिधि संदर्भ # 13 से अनुमति के साथ प्रिंट करें

चित्र 1
Hypoxia सिस्टम ProOx मॉडल 110 1. विशिष्ट विन्यास चित्रा। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
सफेद तीर द्वारा दिखाया गया के रूप में तंग जंक्शन प्रोटीन की चित्रा 2. इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्थानीयकरण (TJP) ZO-1, RBMECs में OGD-आर निम्नलिखित तंग जंक्शनों के विघटन का प्रदर्शन है। स्केल बार = 10 माइक्रोन। इस का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें आंकड़ा।

"> चित्र तीन
सफेद तीर द्वारा दिखाया गया है RBMECs में OGD-आर के बाद cytoskeletal विधानसभा में परिवर्तन दिखाते च -actin तनाव फाइबर संरचना, के लिए चित्रा 3. Rhodamine Phalloidin लेबलिंग। स्केल बार = 10 माइक्रोन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

Ischemia-reperfusion की चोट के लिए इन विट्रो मॉडल के रूप में OGD-आर अच्छी तरह से न्यूरॉन्स 10,11 के अध्ययन के लिए स्थापित किया गया है। पारगम्यता और टी जे अखंडता 9 में मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं और परिवर्तन पर OGD का प्रभाव दिखा अध्ययन भी कर रहे हैं। हालांकि, हमारे अध्ययन निम्नलिखित इस्कीमिक स्ट्रोक होती है कि इन विवो परिस्थितियों में इस्कीमिक reperfusion की चोट के करीब प्रतिनिधित्व है जो OGD के प्रभाव के रूप में अच्छी तरह से reoxygenation को दिखाती है।

Hypoxic इस्कीमिक शर्तों paracellular पारगम्यता और vasogenic शोफ 4 बढ़ाने के द्वारा व्यवधान BBB के लिए अग्रणी, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में सूजन उत्पन्न करने के लिए जाना जाता है। Reperfusion चोट कोशिकी पोटेशियम, उत्तेजक न्यूरोट्रांसमीटर, endothelial और न्यूरोनल सूजन, प्रतिरक्षा सेल सक्रियण की रिहाई में वृद्धि, अत्यधिक प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पादन, एटीपी कमी है जो वहाँ में एक बहुत ही जटिल और गतिशील प्रक्रिया है। इस में बारी ग, उत्पादन, न्युक्लिअसिज़ और प्रोटिएजों की प्रेरण साइटोकाइन के लिए अग्रणी विभिन्न caspases को सक्रिय करने के लिए दिखाए जाते हैं, जो सभी के शोफ, के लिए अग्रणी, बीबीबी अखंडता 5,12 के विघटन के लिए अग्रणी विभिन्न भड़काऊ रास्ते के सक्रियण auses। Endothelial कोशिकाओं के कारण माइटोकॉन्ड्रिया की बड़ी संख्या की उपस्थिति के लिए, इस्कीमिक चोट करने के लिए विशेष रूप से ग्रस्त हैं। पड़ोसी endothelial कोशिकाओं तंग जंक्शन प्रोटीन द्वारा बनाए रखा तंग जंक्शनों के द्वारा एक दूसरे से जुड़ी हैं।

ZO-1 अन्य तंग जंक्शन प्रोटीन के साथ अपनी बातचीत के द्वारा टी जे अखंडता को बनाए रखने में एक महत्वपूर्ण भूमिका अदा करने के लिए दिखाया गया है और   एक्टिन cytoskeletal विधानसभा। इसके अलावा, एक्टिन cytoskeleton की सटीक विनियमन सेल सेल adhesions सहित कई विकासात्मक और शारीरिक प्रक्रियाओं के लिए आवश्यक है। Endothelial कोशिकाओं में, एक्टिन तनाव फाइबर गठन बाधा शिथिलता और hyperpermeability 13,14 के साथ जुड़ा होना पाया जाता है। Rhodamine phalloiएफ actin तनाव फाइबर गठन का पालन करने के लिए वर्तमान अध्ययन में इस्तेमाल लेबलिंग तकनीक din एक अंत बिंदु अध्ययन है। Doggett और Breslin के 15 से दिखाया गया है लेकिन, जैसा कि तनाव फाइबर गठन के गतिशील और जीने इमेजिंग भी किया जा सकता है।

वर्तमान अध्ययन किराए बीबीबी तंग जंक्शन अखंडता के प्रति ZO-1 के योगदान पर जोर दिया। हालांकि, claudin -5, occludin, junctional आसंजन अणु (जाम) जैसे अन्य तंग जंक्शन अणुओं आदि भी OGD-आर निम्नलिखित बीबीबी तंग जंक्शन अखंडता का अध्ययन करने के लिए मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। इस अध्ययन में, हम तंग जंक्शन अखंडता को निर्धारित करने के लिए एक गुणात्मक तकनीक के रूप में इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्थानीयकरण और एफ actin लेबलिंग कार्यरत हैं। हालांकि, हम भी फ्लोरोसेंट मार्करों और transendothelial विद्युत प्रतिरोध (Teer) का उपयोग पारगम्यता के मात्रात्मक माप की तरह BBB के अन्य महत्वपूर्ण विशेषताओं का अध्ययन कर सकते हैं।

OGD-आर तकनीक का उपयोग कर इस अध्ययन में प्रस्तुतBiospherix प्रणाली केवल ऑक्सीजन की एक निश्चित एकाग्रता में हाइपोक्सिया / अनॉक्सिता अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है; हालांकि, हम endothelial कोशिकाओं पर ऑक्सीजन की सांद्रता में परिवर्तन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस प्रणाली को काम पर नहीं कर सकते हैं। Endothelial कोशिकाओं पर ऑक्सीजन की अलग सांद्रता के प्रभावों के अध्ययन के लिए हम उद्देश्य के लिए अनुकूल अन्य उपलब्ध मॉडलों को रोजगार की जरूरत है।

इस तकनीक को बीबीबी hyperpermeability और टी जे अखंडता को नियंत्रित करने वाले विभिन्न सेलुलर और आणविक घटनाओं के बीच यंत्रवत रिश्तों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। उन्हें समझ बीबीबी विघटन और microvascular पारगम्यता attenuate करने के लिए विभिन्न आणविक रणनीति विकसित करने के लिए अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा।

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Acknowledgments

हम वित्तीय सहायता के लिए स्कॉट और व्हाइट अस्पताल रिसर्च ग्रांट कार्यक्रम को स्वीकार करते हैं और टेक्सास ए एंड लेजर confocal खुर्दबीन के उपयोग के लिए चिकित्सा एकीकृत इमेजिंग प्रयोगशाला के एम स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र कॉलेज। हम पांडुलिपि संपादन के साथ मदद के लिए श्री ग्लेन Cryer स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Proox model 110 Biospherix Model 110
DMEM, no glucose Gibco, Life technologies 11966-025
Rhodamine Phalloidin Life technologies R415
ZO-1 Rabbit Polyclonal Antibody Life technologies 617300
Nunc Lab Tek II-CC 8 well sterile, glass slides  Thermo scientific 177402
FITC-tagged anti-rabbit secondary antibody  Santa cruz sc-2090
DPBS 1X Thermo scientific SH 30028.03 Any other PBS available can be used

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References

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चिकित्सा अंक 99 ऑक्सीजन ग्लूकोज अभाव और reoxygenation ischemia-reperfusion चोट रक्त मस्तिष्क बाधा मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं तंग जंक्शनों इम्यूनोफ्लोरेसेंस,
एक के रूप में ऑक्सीजन ग्लूकोज अभाव और Reoxygenation<em&gt; इन विट्रो</em&gt; Ischemia-reperfusion चोट मॉडल का अध्ययन रक्त मस्तिष्क बाधा शिथिलता के लिए
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Alluri, H., Anasooya Shaji, C.,… More

Alluri, H., Anasooya Shaji, C., Davis, M. L., Tharakan, B. Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction. J. Vis. Exp. (99), e52699, doi:10.3791/52699 (2015).

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