Abstract
Ишемии (ИК) травмы, как известно, в значительной мере способствовать заболеваемости и смертности, связанной с ишемических инсультов. Ишемические нарушения мозгового кровообращения приходится 80% всех инсультов. Распространенной причиной повреждения ИК является быстрое поступление жидкости после проведения острой / хронической окклюзии крови, питательных веществ, кислорода к ткани вызывая образование свободных радикалов.
Ишемический инсульт сопровождается гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) дисфункции и вазогенного отека мозга. Конструктивно плотные соединения (ТТ) между эндотелиальными клетками, играют важную роль в поддержании целостности гематоэнцефалического барьера (ГЭБ). ИК травмы рано вторичное повреждение приводит к неспецифической, воспалительной реакции. Окислительный стресс и метаболические следующие воспаления вызывает вторичное повреждение головного мозга в том числе BBB проницаемости и нарушение плотного контакта (TJ) целостности.
Наш протокол представляет в пробирке </ EM> пример кислорода-глюкозы лишения и реоксигенации (OGD-R) на мозг крыс эндотелиальных клеток TJ целостности и формирования стресс волокна. В настоящее время, несколько экспериментальных моделей в естественных условиях, используются для изучения влияния ИК травмы; Однако они имеют ряд ограничений, таких, как технические проблемы при выполнении операций, генные зависимые молекулярные влияния и трудности в изучении механистические отношения. Тем не менее, модели, в пробирке, может помочь в преодолении многих из этих ограничений. Представлены протокол может быть использован для изучения различных молекулярных механизмов и механических связей для обеспечения потенциальных терапевтических стратегий. Тем не менее, результаты исследований в пробирке, может отличаться от стандартных в естественных исследований и их следует интерпретировать с осторожностью.
Introduction
Ишемии (ИК) травма оказалась частой причиной различных изнурительных осложнений и смертей, связанных с инсультом, инфарктом миокарда, травмы, заболевания периферических сосудов и черепно-мозговой травмой 1,2. ИК травмы в мозговых сосудах в начале вторичное повреждение приводит к воспалению и отеку 3. Одним из серьезных осложнений, которые происходит в результате окислительной и метаболического стресса следующей воспаления является потеря гомеостаза баланса, ведущего к образованию свободных радикалов, изменения в гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) плотные соединения (ТТ) и микрососудов проницаемости 4,5.
В настоящее время в естественных условиях модели, используемые для изучения последствий ИК травмы на BBB включают окклюзии средней мозговой артерии (MCAO), микроэмболии и трансгенных или нокаутом животных. Тем не менее, каждый из них имеет свои недостатки и ограничения, как описано в Hossmann 6. МСАО модель используется для изучения эфТС окислительно-восстановительного стресса, изменения в соединительных коммуникаций BBB и взаимодействия между мозгом и иммунных клеток. Тем не менее, они представляют различные технические проблемы, такие как необходимость точных микрохирургических операций и трудности в нем. Микроэмболии мгновенно разрушает BBB, а использование трансгенных животных или нокаут, чтобы изучить церебральной ишемии может иметь проблемы, как ген-зависимым молекулярных воздействий на формирование инфаркта, изменения в сосудистой анатомии и различных масс тела 6. Следовательно, модели в пробирке ишемии нашли повышенный интерес в последние времена в основном за счет их применимости в выполнении механистические исследования на наркотики. Тем не менее, результаты исследований в пробирке не может в полной мере представляют собой исследование в естественных условиях и должны быть интерпретированы с осторожностью 6.
Противодействующий эффект низких концентраций кислорода на поверхности эндотелиальных клеток монослоя и микрососудов проницаемости былиизучены Огава 7. Крыса мозг микрососудистых эндотелиальных клеток (RBMECs) были использованы для разработки в пробирке BBB. Лишение кислород глюкозы и реоксигенации техника (OGD-R), представленные в этом протоколе была адаптирована из исследований Зулуэта др и Чжу и др 8,9. Мы разоблачили эндотелиальных клеток головного мозга в OGD-R, помещая их в гипоксия / аноксии камеру, содержащую 0% O 2, 5% СО 2 и 95% N 2. Клетки позже оценивали изменения в целостности и стресс формирования волокна с использованием иммунофлюоресценции TJ локализации и родамин фаллоидином маркировку соответственно. Иммунофлуоресценции окрашивание блокатора малой зоны 1 (ZO-1) выполняется для определения целостности TJ, а ZO-1 является важным леса мембраной т белка. Родамин фаллоидином маркировка определяет нитчатые актин (F-актина) в клеточной цитоскелета и четкое указание актина формирования стресс волокна в эндотелиальных клетках.
<р = класс "jove_content"> Цель данного метода является дать представление разработки OGD-R в качестве экстракорпорального ИК модели для изучения ВВВ эндотелиальных клеток целостность TJ и образование Ф-актина стресс волокна. Результаты будут предоставлять информацию о судьбе TJ белка, ZO-1 и формирование стресс волокна следующие OGD-R. Понимание этих отношений даст возможность, чтобы определить основные молекулярные механизмы, которые запускаются следующие OGD-R и развивать потенциальные терапевтические стратегии по повышению нарушения ВВВ после лечения OGD-R.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Посев эндотелиальных клеток
- Получить первичных культур RBMEC-х от взрослых Спрэг Dawley крыс (или получить их в коммерческих целях).
- Выращивают RBMECs в 100 см фибронектина (50 мкг / мл) покрытые чашки Петри с использованием мозга крысы среду роста эндотелиальных клеток. Изменение среды каждые два дня, до конфлюентности пока не будет достигнута.
- По достижении 80-90% слияния, осторожно промыть клетки в 5 мл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS), вращая. Затем клетки отделяют путем воздействия на них 1 мл теплого 0,25% трипсино этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) раствор, уравновешенных до 37 ° С.
- Инкубируйте клетки при 37 ° С в течение 2-5 мин, пока клетки не будут отделены и рассеяны.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нажмите культуры блюдо отделяться клетки. Посмотреть клетки под микроскопом, чтобы подтвердить полное отделение клеток от поверхности тарелки. - Добавить 5 мл полной среды в чашке Петри, чтобы нейтрализовать трипсина.Внесите из среды, содержащей отдельные клетки и собирать его в 15 мл центрифужную пробирку. ,
- Центрифуга носитель с эндотелиальные клетки при 220 мкг в течение 5 мин.
- Аспирируйте супернатант и сохранить осадок, содержащий cells.Suspend осадок в 3-5 мл свежего мозга крыс среде роста эндотелиальных клеток, мягко смешивая его вверх и вниз с пипетки клеток затем будет считаться использованием автоматизированного счетчика клеток или гемоцитометра.
- Передача клеточной суспензии в фибронектина (50 мкг / мл), предварительно покрытый 8 и стерильной системы камера слайд, 0,7 см 2 / а с плотностью посева в диапазоне от 10000-15000 клеток на лунку. Выращивают клетки при 37 ° С до слияния не будет достигнута
Примечание: Для выполнения вестерн-блоттинга или других экспериментов, клетки могут быть выращены в 10 см чашки для культивирования клеток или специальных блюд в соответствии с требованиями эксперимента.
2. Кислород и глюкоза Лишение-реоксигенации In VitroМодель
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол был адаптирован с Зулуэта др. 1997; Чжу Н и др. 2012 8,9.
- Используйте систему культивирования клеток гипоксия изучить эффекты от OGD-R на RBMECs в (рисунок 1). Настройка и калибровка системы для культивирования клеток гипоксия до начала эксперимента, в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Снимите сливной камеры слайды (шаг 1.8) от 37 ° C инкубатора. Заменить полную среду в камере слайд с дезоксигенированную, не глюкоза, модифицированной среде Дульбекко Игла (DMEM), и помещают в гипоксии камеру с 95%, N 2 и 5% CO 2 в течение 2 ч при 37 ° С, не представляют OGD состояние.
- Перемещение клеток обратно в инкубаторе с 95% O 2, 5% СО 2 при 37 ° С и при условии, со свежими мозга крыс эндотелиальных клеток полной среде и инкубируют в течение еще 1 часа при 37 ° С.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг представляет собой реоксигенации ситуацию. - Используйте камеры слайды для иммунофлуоресценции локализации и родамин фаллоидином маркировки (раздел 3).
3. Иммунофлуоресценции Локализация ZO-1 и ф-актина маркировки Использование родамин фаллоидином
- Expose камеры слайды, содержащие RBMEC монослоев 100 мкл Opti-MEM / пониженной сыворотки СМИ / а в течение 1 часа. Промыть камере слайды 3 раза в 100 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS, рН 7,0-7,2).
- Фиксации клеток с использованием 100 мкл 4% параформальдегида в PBS (рН 7,0-7,2) в течение 15 мин и мыть камере слайды в течение еще 3 раза в PBS (рН 7,0-7,2).
- Клетки проницаемыми с использованием 100 мкл 0,5% Тритона Х-100 в PBS, рН (7,0-7,2) еще в течение 15 мин. Блок 100 мкл 2% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в PBS в течение часа. После этого шага либо клеток пятно / этикетки либо для ZO-1 или f-актина.
- Для иммунофлюоресценции ГНАоцен- ками инкубировать клетки с первичным антителом против кролика против ZO-1 в соотношении 1: 150, который был подготовлен в 2% BSA-PBS в течение O / N при 4 ° С. Вымойте клетки 3 раза в PBS (рН 7,0-7,2). Инкубируют 100 мкл флуоресцеин изотиоцианат (FITC) -tagged анти-кролик вторичного антитела в течение 1 часа при комнатной температуре.
- Для родамина фаллоидином маркировки, после блокировки, подвергать клетки в 100 мкл родамина фаллоидином в разведение 1:50, получают 2% BSA-PBS, в течение 20 мин.
- Вымойте клетки от иммунофлюоресценции окрашивания и родамина фаллоидином маркировки в PBS, рН 7,0-7,2 (). Установите камер, используя крепежные средства массовой информации, содержащие анти-выцветанию реагента с DAPI.
- Визуализация клеток с использованием 60 х погружения в воду линзы и клетки сканируются в одном оптическом плоскости под конфокальной микроскопии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Клетки, культивируемые на фибронектина с предварительно нанесенным покрытием камеры слайдов Nunc II подвергались OGD-R, помещая в Biospherix ProOx модели 110 камеры. После подвергая клетки к OGD-R, они были обработаны для ZO-1 соединительного окрашивания с использованием техники иммунофлюоресценции, как показано на рисунке 2 и цитоскелета сборки указывает образование F-актина стресс волокна использованием родамин-фаллоидином пятна этикетку, как показано на рисунке 3. Контрольными клетками, которые были не подвергается OGD-R не показали постоянное Junctional целостности, а эндотелиальные клетки подвергаются OGD-R показали, разрывные переходы, указывая на потерю целостности TJ рисунке 2. Контрольные клетки, которые не были подвергнуты обработке OGD-R показали отсутствие или минимальное ф-актина стресс волокна пласта в процессе эндотелиальные клетки, подвергнутые OGD-R показали, повышенное образование F-актина стресс волокна с указанием изменений в актин цитоскелета сборки фиг.3; Репутация RINT с разрешения Reference # 13
Рисунок 1. Типичная конфигурация системы Гипоксия ProOx модели 110. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Иммунофлуоресценции Локализация плотного контакта белка (TJP) ZO-1 Демонстрация разрушение плотных контактов следующих OGD-R в RBMECs, как показано белыми стрелками. Масштаб бар = 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этого фигура.
Рисунок 3. Родамин фаллоидином Маркировка для ф-актина стресс волокна образования показа изменений в цитоскелета Ассамблеи После OGD-R в RBMECs, как показано белыми стрелками. Масштаб бар = 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
OGD-R как модель в пробирке для ишемии реперфузии была хорошо известна для изучения нейроны 10,11. Есть также исследования, показывающие влияние OGD на эндотелиальных клетках головного мозга и изменения в проницаемости и целостности TJ 9. Тем не менее, наше исследование показывает эффект OGD а также реоксигенация, который ближе представление ишемического реперфузионного повреждения в условиях в естественных условиях, которые возникают следующие ишемический инсульт.
Гипоксии-ишемии, как известно, вызывают воспаление в центральной нервной системе, что приводит к нарушению ВВВ путем увеличения проницаемости и парацеллюлярного Вазогенный отек 4. Реперфузионными является очень сложным и динамичным процессом, в котором есть чрезмерное производство активных форм кислорода, истощение АТФ, повышение внеклеточной калий, выпуск возбуждающих нейротрансмиттеров, эндотелиальной и нейрональной опухоль, активации иммунной клетки. Это, в свою очередь, сauses активацию различных воспалительных путей, что приводит к продукции цитокинов, индукции нуклеаз и протеаз, что приводит к отеку, все из которых показаны для активации каспазы различные, что приводит к нарушению целостности BBB 5,12. Эндотелиальные клетки особенно подвержены ишемического повреждения, из-за наличия большого числа митохондрий. Соседние эндотелиальные клетки связаны друг с другом с помощью плотных контактов, поддерживаемых с помощью плотных белков соединительных.
ZO-1 показано, играют важную роль в поддержании целостности TJ его взаимодействием с другими белками плотного контакта и актина цитоскелета в сборе. Кроме того, точное регулирование актина цитоскелета имеет важное значение для многих развития и физиологических процессов, включая межклеточных спаек. В эндотелиальных клеток, образование актин стресс волокна установлено, что связано с барьерной дисфункции и повышенной проницаемостью 13,14. Родамин phalloiдин технологии маркировки, используемой в настоящем исследовании наблюдать образование Ф-актина стресс волокна точка исследования конец. Тем не менее, динамичный и живой визуализации формирования напряженно волокна также могут быть выполнены, как показано на Доггетом и Бреслин 15.
Нынешнее исследование главно подчеркивает вклад ZO-1 в сторону BBB целостности плотного контакта. Тем не менее, другие жесткие молекулы, такие как соединительные Claudin-5, occludin, соединительного молекулы адгезии (JAM) и т.д. также могут быть использованы в качестве маркеров для изучения ВВВ плотно целостность распределительной следующую OGD-R. В этом исследовании мы использовали иммунофлюоресценции локализации и F-актин маркировке качественного техники, чтобы определить плотный целостность перехода. Тем не менее, мы также можем изучать другие важные характеристики, как BBB количественного измерения проницаемости, используя флуоресцентные маркеры и трансэндотелиальную электрическое сопротивление (Тир).
OGD-R методика представлена в данном исследовании, используяBiospherix система может быть использована только для гипоксии / аноксии исследований при фиксированной концентрации кислорода; Однако, мы не можем использовать эту систему для изучения влияния различных концентраций кислорода на эндотелиальных клетках. Для изучения влияния различных концентраций кислорода на эндотелиальных клетках, мы должны использовать другие доступные модели подходят для этой цели.
Этот метод может быть использован для изучения механистической взаимосвязи между различными клеточных и молекулярных событий, которые регулируют ВВВ проницаемостью и целостность TJ. Понимание их обеспечит понимание для разработки различных молекулярных стратегий для ослабления ВВВ нарушения и капилляров проницаемости.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы признаем, Скотт и Белый больницы программу исследовательских грантов для финансовой поддержки и Техас & M Научного центра здоровья Медицинского колледжа интегрированной лаборатории изображений для использования конфокальной лазерной микроскопии. Мы признаем, г-н Глен Крайер за помощь в рукописи редактирования.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Proox model 110 | Biospherix | Model 110 | |
| DMEM, no glucose | Gibco, Life technologies | 11966-025 | |
| Rhodamine Phalloidin | Life technologies | R415 | |
| ZO-1 Rabbit Polyclonal Antibody | Life technologies | 617300 | |
| Nunc Lab Tek II-CC 8 well sterile, glass slides | Thermo scientific | 177402 | |
| FITC-tagged anti-rabbit secondary antibody | Santa cruz | sc-2090 | |
| DPBS 1X | Thermo scientific | SH 30028.03 | Any other PBS available can be used |
References
- Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation. Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).
- Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. Cell biology of ischemia/reperfusion injury. Int Rev Cell Mol Biol. 298, 229-317 (2012).
- Yang, X., et al. Lycium barbarum polysaccharides reduce intestinal ischemia/reperfusion injuries in rats. Chem Biol Interact. 204 (3), 166-172 (2013).
- Kaur, C., Ling, E. A. Blood brain barrier in hypoxic-ischemic conditions. Curr Neurovasc Res. 5 (1), 71-81 (2008).
- Khatri, R., McKinney, A. M., Swenson, B., Janardhan, V. Blood-brain barrier, reperfusion injury, and hemorrhagic transformation in acute ischemic stroke. Neurology. 79 Suppl 1. (13), S52-S57 (2012).
- Hossmann, K. A. Experimental models for the investigation of brain ischemia. Cardiovasc Res. 39, 106-120 (1998).
- Ogawa, S., Gerlach, H., Esposito, C., Pasagian-Macaulay, A., Brett, J., Stern, D. Hypoxia modulates the barrier and coagulant function of cultured bovineendothelium. Increased monolayer permeability and induction of procoagulant properties. J Clin Invest. 85 (4), 1090-108 (1990).
- Zulueta, J. J., Sawhney, R., Yu, F. S., Cote, C. C., Hassoun, P. M. Intracellular generation of reactive oxygen species in endothelial cellsexposed to anoxia-reoxygenation. Am J Physiol. 272 (5 Pt 1), L897-L902 (1997).
- Zhu, H., et al. Baicalin reduces the permeability of the blood-brain barrier during hypoxia in vitro by increasing the expression of tight junction proteins in brain microvascular endothelial cells. J Ethnopharmacol. 141 (2), 714-720 (2012).
- Abramov, A. Y., Scorziello, A., Duchen, M. R. Three distinct mechanisms generate oxygen free radicals in neurons and contribute to cell death during anoxia and reoxygenation. J Neurosci. 27 (5), 1129-1138 (2007).
- Gundimeda, U., et al. Green tea polyphenols precondition against cell death induced by oxygen-glucose deprivation via stimulation of laminin receptor, generation of reactive oxygen species, and activation of protein kinase Cepsilon. J Biol Chem. 287 (41), 34694-34708 (2012).
- Mehta, S. L., Manhas, N., Raghubir, R. Molecular targets in cerebral ischemia for developing novel therapeutics. Brain Res Rev. 54 (1), 34-66 (2007).
- Alluri, H., et al. Reactive Oxygen Species-Caspase-3 Relationship in Mediating Blood-Brain Barrier Endothelial Cell Hyperpermeability Following Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation. Microcirculation. 21 (2), 187-195 (1111).
- Sun, H., Breslin, J. W., Zhu, J., Yuan, S. Y., Wu, M. H. Rho and ROCK signaling in VEGF-induced microvascular endothelial hyperpermeability. Microcirculation. 13 (3), 237-247 (2006).
- Doggett, T. M., Breslin, J. W. Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP actin. J Vis Exp. (57), (2011).
