Abstract
La isquemia-reperfusión (IR) lesión se sabe que contribuyen significativamente a la morbilidad y la mortalidad asociadas con accidentes cerebrovasculares isquémicos. Accidentes cerebrovasculares isquémicos representan el 80% de todos los accidentes cerebrovasculares. Una causa común de lesión IR es el rápido flujo de entrada de fluidos después de una oclusión crónica / aguda de sangre, nutrientes, oxígeno al tejido desencadenar la formación de radicales libres.
El ictus isquémico es seguido por la barrera hematoencefálica (BBB) y la disfunción edema cerebral vasogénico. Estructuralmente, las uniones estrechas (TJS) entre las células endoteliales juegan un papel importante en el mantenimiento de la integridad de la barrera hematoencefálica (BBB). IR lesión es una lesión secundaria temprana que conduce a una respuesta no específica, inflamatoria. Oxidativo y estrés metabólico después de la inflamación desencadena el daño cerebral secundario que incluye la acreditación de la permeabilidad y la interrupción de uniones estrechas (TJ) integridad.
Nuestro protocolo presenta in vitro </ Em> ejemplo de la privación de oxígeno y glucosa reoxigenación (OGD-R) en las células endoteliales de cerebro de rata integridad TJ y la formación de fibras de estrés. Actualmente, varios experimental en modelos in vivo se utilizan para estudiar los efectos de la lesión IR; sin embargo, tienen varias limitaciones, como los desafíos técnicos en la realización de cirugías, gen influencias moleculares dependientes y dificultad en el estudio de las relaciones mecanicistas. Sin embargo, los modelos in vitro puede ayudar a superar muchas de esas limitaciones. El protocolo presentado puede ser usado para estudiar los diversos mecanismos moleculares y relaciones mecanicistas para proporcionar estrategias terapéuticas potenciales. Sin embargo, los resultados de los estudios in vitro pueden diferir de serie en estudios in vivo y deben ser interpretados con cautela.
Introduction
-Isquemia-reperfusión (IR) lesión se encuentra que es la causa frecuente de diversas complicaciones debilitantes y muertes asociadas con el accidente cerebrovascular, infarto de miocardio, trauma, enfermedad vascular periférica y lesión cerebral traumática 1,2. IR lesión en los vasos cerebrales es una lesión secundaria temprana conduce a la inflamación y el edema 3. Una de las complicaciones graves que se produce como resultado de estrés oxidativo y metabólica después de la inflamación es la pérdida de equilibrio homeostático conduce a la formación de radicales libres, alteraciones en la barrera hematoencefálica (BBB) uniones estrechas (TJs) y la permeabilidad microvascular 4,5.
Actualmente, en modelos in vivo utilizados para estudiar los efectos de la lesión por IR en la BBB incluir oclusión de la arteria cerebral media (MCAO), microembolismo, y transgénicos o knockout animales. Sin embargo, cada uno tiene sus inconvenientes y limitaciones como se comenta por Hossmann 6. Modelo MCAO se utiliza para estudiar la effects de estrés redox, cambios en las comunicaciones de unión de la acreditación y las interacciones entre el cerebro y las células inmunes. Sin embargo, presentan varios desafíos técnicos, como la necesidad de procedimientos de microcirugía precisas y las dificultades en el mismo. Microembolismo instantáneamente rompe la acreditación mientras que el uso de transgénicos o knockout animales para estudiar la isquemia cerebral puede tener retos como influencias de genes dependientes moleculares sobre la formación del infarto, los cambios en la anatomía vascular y diferentes pesos corporales 6. Por lo tanto, los modelos in vitro de isquemia han encontrado un interés creciente en los últimos tiempos debido principalmente a su aplicabilidad en la realización de estudios mecanísticos de drogas. Sin embargo, los resultados de los estudios in vitro no pueden representar plenamente un estudio in vivo y deben ser interpretados con cautela 6.
Efecto contraproducente de bajas concentraciones de oxígeno en monocapas de células endoteliales y la permeabilidad microvascular haber sidoestudiado por Ogawa 7. Células endoteliales microvasculares de cerebro de rata (RBMECs) se utilizaron para desarrollar in vitro BBB. La técnica de la privación y la reoxigenación con oxígeno glucosa (OGD-R) se presenta en este protocolo ha sido adaptado de estudios de Zulueta y otros y Zhu et al 8,9. Se expuso células endoteliales cerebrales a OGD-R colocándolos en una cámara de hipoxia / anoxia que contiene 0% de O 2, 5% de CO 2 y 95% N 2. Las células fueron posteriormente evaluados por alteraciones en la formación de fibras integridad y el estrés TJ utilizando la localización de inmunofluorescencia y el etiquetado rodamina phalloidin respectivamente. La tinción de inmunofluorescencia para occludens-1 zonula (ZO-1) se realiza para determinar la integridad de TJ, como ZO-1 es una membrana andamios importante obligado proteínas TJ. Etiquetado rodamina faloidina determina la actina filamentosa (F-actina) en el citoesqueleto celular y es una clara indicación de la formación de fibras de estrés de actina en las células endoteliales.
<p class = "jove_content"> El objetivo de este método es para proporcionar una visión en el desarrollo de OGD-R como un modelo in vitro para el estudio de IR BBB células endoteliales integridad TJ y la formación de fibras de estrés de actina-f. Los resultados proporcionarán información sobre la suerte de proteínas TJ, ZO-1 y la formación de fibras de estrés después de la OGD-R. La comprensión de estas relaciones será una oportunidad para determinar los mecanismos moleculares subyacentes que se activan siguiendo OGD-R y desarrollar posibles estrategias terapéuticas para mejorar la interrupción acreditación después del tratamiento OGD-R.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Siembra de las células endoteliales
- Obtener cultivos primarios de RBMEC de de ratas Sprague Dawley adultas (u obtener comercialmente).
- Cultivar RBMECs en 100 cm fibronectina (50 mg / ml) placas de Petri recubiertas utilizando el medio de crecimiento de células endoteliales de cerebro de rata. Cambiar el medio cada dos días, hasta que se alcanza la confluencia.
- Al llegar a 80-90% de confluencia, lavar suavemente las células en 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) por agitación. Las células se separaron entonces al exponerlos a 1 ml de solución caliente 0,25% tripsina ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), equilibrada a 37 ° C.
- Se incuban las células a 37 ° C durante 2-5 min hasta que las células se separan y se dispersan.
NOTA: Toque en la placa de cultivo para separar las células. Ver las células bajo el microscopio para confirmar desprendimiento completo de células de la superficie del plato. - Añadir 5 ml de medios completa a la placa de Petri con el fin de neutralizar la tripsina.Pipetear el medio que contiene células desprendidas y recoger en un tubo de centrífuga de 15 ml. .
- Centrifugar el medio que contiene las células endoteliales a 220 xg durante 5 min.
- Aspirar el sobrenadante y el sedimento que contiene preservar cells.Suspend el sedimento en 3-5 medio de crecimiento de células endoteliales de cerebro de rata fresco por ml de mezcla suavemente arriba y abajo con pipeta células serán entonces ser contado usando un contador de células automatizado o un hemocitómetro.
- Transferir la suspensión celular en la fibronectina (50 mg / ml) pre-revestido 8 sistema de diapositiva cámara de pocillo estéril, 0,7 cm 2 / pocillo con una densidad de siembra varía entre 10.000-15.000 células por pocillo. Cultivar las células a 37 ° C hasta que se logra la confluencia
NOTA: Para la realización de transferencias Western u otros experimentos, las células se pueden cultivar en placas de 10 cm de cultivo de células o platos especiales como es requerido por el experimento.
2. El oxígeno y glucosa Privación-Reoxigenación In VitroModelo
NOTA: El siguiente protocolo se ha adaptado de Zulueta et al. 1997; Zhu H et al. 2012 8,9.
- Utilice el sistema de cultivo celular hipoxia para estudiar los efectos de de la OGD-R en RBMECs en (ver Figura 1). Configuración y calibrar el sistema de cultivo celular hipoxia antes de comenzar el experimento, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Retire los portaobjetos de cámara confluentes (paso 1.8) de la 37 ° C incubadora. Sustituir el medio completo en el portaobjetos de cámara con desoxigenada, no glucosa, Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) y se coloca en la cámara de hipoxia con 95%, N 2 y 5% de CO 2 durante 2 horas a 37 ° C, para representar condición OGD.
- Mover las células de nuevo a la incubadora con 95% O 2, 5% de CO2 a 37 ° C y provisto de medio completo de células endoteliales de cerebro de rata fresco y se incuba durante otra 1 hora a 37 ° C.
NOTA: Este paso representa una situación reoxigenación. - Utilice los portaobjetos de cámara para la localización de inmunofluorescencia y el etiquetado rodamina phalloidin (ver sección 3).
3. Inmunofluorescencia localización de ZO-1 y F-actina Etiquetado Usando Rodamina faloidina
- Exponer los portaobjetos de cámara que contienen monocapas RBMEC a 100 l de Opti-MEM / suero reducida medios de comunicación / pocillo durante 1 hr. Lavar los portaobjetos de cámara 3 veces en 100 l de solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,0 a 7,2).
- Fijar las células utilizando 100 l de paraformaldehído al 4% en PBS (pH 7,0-7,2) durante 15 min y se lavan los portaobjetos de cámara de 3 veces más en PBS (pH 7,0-7,2).
- Permeabilizar las células usando 100 l de 0,5% de Triton X-100 en PBS, (pH 7,0-7,2) durante otros 15 min. Bloquear con 100 l de 2% de albúmina de suero bovino (BSA) en PBS durante una hora. Después de este paso, ya sea células mancha / etiqueta, ya sea para ZO-1 o f- actina.
- Para sta inmunofluorescenciacaniza incuban las células con un anticuerpo anti-conejo primaria contra ZO-1 en 1: 150, preparado en 2% BSA-PBS durante O / N a 4 ° C. Lavar las células 3 veces en PBS, (pH 7,0-7,2). Incubar con 100 l de isotiocianato de fluoresceína (FITC)-etiquetados anti-conejo anticuerpo secundario durante 1 hr a RT.
- Para el etiquetado rodamina faloidina, tras el bloqueo, exponer las células a 100 l de rodamina faloidina en dilución 1:50, preparado en 2% BSA-PBS, durante 20 min.
- Lavar las células de la tinción de inmunofluorescencia y rodamina faloidina etiquetado en PBS, (pH 7,0-7,2). Montar las cámaras que utilizan medios de fijación que contienen reactivo anti-fade con DAPI.
- Visualizar las células usando una lente de inmersión en agua 60 X y las células se escanean en un solo plano óptico bajo un microscopio confocal.
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Representative Results
Las células cultivadas en portaobjetos prerrevestidas fibronectina cámara Nunc II fueron sometidos a OGD-R mediante la colocación en un modelo de cámara de 110 Biospherix ProOx. Después de someter las células a OGD-R, que se procesaron para ZO-1 tinción de unión utilizando la técnica de inmunofluorescencia como se muestra en la Figura 2 y el conjunto de citoesqueleto que indica la formación de fibras de estrés de actina F usando etiqueta mancha faloidina rodamina como se muestra en la Figura 3. Las células de control que eran no sometido a la OGD-R mostraron la integridad de la unión continua mientras que las células endoteliales sometidas a OGD-R mostraron uniones discontinuas, lo que indica la pérdida de TJ integridad Figura 2. Las células de control que no fueron sometidos a un tratamiento OGD-R no mostraron o mínima de fibras de estrés-actina f formación mientras que las células endoteliales sometidas a OGD-R demostraron una mayor formación de fibras de estrés-actina f indicando los cambios en el citoesqueleto de actina asamblea Figura 3; Rep rint con permiso de Referencia # 13
Figura 1. Configuración típica del modelo de hipoxia Sistema ProOx 110. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Inmunofluorescencia localización de la proteína de unión estrecha (TJP) ZO-1 Demostrando La interrupción de las uniones estrechas siguientes OGD-R en RBMECs, como se muestra por las flechas blancas. La barra de escala = 10 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Rodamina faloidina Etiquetado para f formación de fibras de estrés-actina Demostrar cambios en la Asamblea Citoesqueleto Siguiendo OGD-R en RBMECs, como se muestra por las flechas blancas. La barra de escala = 10 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
OGD-R como un modelo in vitro para la lesión por isquemia-reperfusión ha sido bien establecido para el estudio de las neuronas 10,11. También hay estudios que muestran el efecto de la OGD en las células endoteliales cerebrales y alteraciones en la permeabilidad y TJ integridad 9. Sin embargo, nuestro estudio muestra el efecto de OGD, así como la reoxigenación, que es una representación más cercana de la lesión por reperfusión isquémica en condiciones in vivo que se producen después del accidente cerebrovascular isquémico.
Condiciones hipóxico-isquémica se sabe que inducen la inflamación en el sistema nervioso central, dando lugar a disrupción de la BHE mediante el aumento de la permeabilidad paracelular y edema vasogénico 4. La lesión por reperfusión es un proceso muy complejo y dinámico, en el que hay una producción excesiva de especies reactivas del oxígeno, el agotamiento de ATP, aumento de potasio extracelular, liberación de neurotransmisores excitatorios, endotelial e inflamación neuronal, la activación de células inmunes. Esto, a su vez, cAUSES activación de diversas vías inflamatorias, que conduce a la producción de citocinas, la inducción de nucleasas y proteasas, que conduce a edema, todos los cuales se muestran para activar varias caspasas, que conduce a la interrupción de la integridad BBB 5,12. Las células endoteliales son particularmente propensos a la lesión isquémica, debido a la presencia de un gran número de mitocondrias. Las células endoteliales vecinas están unidas entre sí por uniones estrechas mantenidas por las proteínas de unión estrecha.
ZO-1 se muestra a desempeñar un papel importante en el mantenimiento de la integridad TJ por su interacción con las otras proteínas de unión apretada y la asamblea del citoesqueleto de actina. Además, la regulación precisa del citoesqueleto de actina es esencial para muchos procesos fisiológicos y de desarrollo incluyendo adherencias célula-célula. En las células endoteliales, la formación de fibras de estrés de actina se encontró asociado con disfunción de la barrera y la hiperpermeabilidad 13,14. Rodamina falosdin técnica de etiquetado utilizados en el presente estudio para observar la formación de fibras de estrés de actina-f es un estudio de punto final. Sin embargo, las imágenes dinámicas y vivo de la formación de fibras de estrés también se puede realizar como se muestra por Doggett y Breslin 15.
El presente estudio enfatiza mayormente la contribución de ZO-1 hacia la integridad apretado nudo BBB. Sin embargo, otras moléculas de unión estrecha como claudin-5, ocludina, moléculas de adhesión de unión (JAM), etc. también pueden ser utilizados como marcadores para estudiar la integridad apretado unión BBB siguiente OGD-R. En este estudio, hemos empleado la localización de inmunofluorescencia y el etiquetado f-actina como una técnica cualitativa para determinar la integridad unión estrecha. Sin embargo, también podemos estudiar las otras características importantes de la acreditación como medición cuantitativa de la permeabilidad utilizando marcadores fluorescentes y resistencia eléctrica transendotelial (TEER).
La técnica OGD-R presenta en este estudio mediante elBiospherix sistema sólo se puede utilizar para estudios de hipoxia / anoxia en una concentración fija de oxígeno; Sin embargo, no podemos emplear este sistema para estudiar el efecto de diferentes concentraciones de oxígeno en las células endoteliales. Para estudiar los efectos de diferentes concentraciones de oxígeno en las células endoteliales que necesitamos emplear otros modelos disponibles adecuadas para el propósito.
Esta técnica se puede utilizar para el estudio de las relaciones mecánicas entre varios eventos celulares y moleculares que regulan la acreditación hiperpermeabilidad y la integridad TJ. La comprensión de ellos proporcionará información para el desarrollo de diversas estrategias moleculares para atenuar disrupción de la BHE y la permeabilidad microvascular.
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Acknowledgments
Reconocemos Programa de Subvenciones del Hospital Blanca, Scott y de apoyo financiero y de Texas A & M Health Science Center College de Medicina de Laboratorio Integrado de imagen para el uso del microscopio láser confocal. Reconocemos el Sr. Glen Cryer para obtener ayuda con la edición de manuscritos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Proox model 110 | Biospherix | Model 110 | |
| DMEM, no glucose | Gibco, Life technologies | 11966-025 | |
| Rhodamine Phalloidin | Life technologies | R415 | |
| ZO-1 Rabbit Polyclonal Antibody | Life technologies | 617300 | |
| Nunc Lab Tek II-CC 8 well sterile, glass slides | Thermo scientific | 177402 | |
| FITC-tagged anti-rabbit secondary antibody | Santa cruz | sc-2090 | |
| DPBS 1X | Thermo scientific | SH 30028.03 | Any other PBS available can be used |
References
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