Summary
نحن في هذا الفيديو لشرح كيفية عزل الخلايا وحيدة النواة من الجهاز العصبي المركزي من الدماغ و النخاع الذاتية مع الفئران المختبرية.
Abstract
يدرس ما إذا كان أحد أمراض المناعة الذاتية الموجهة إلى الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، مثل التهاب الدماغ و النخاع الذاتية التجريبية (EAE ، 1) ، أو الاستجابة المناعية للعدوى تصيب الجهاز العصبي المركزي ، مثل شلل الأطفال ، وneuroborreliosis لايم ، أو العصبي ، غالبا ما يكون اللازمة لعزل خلايا الجهاز العصبي المركزي ، تسلل المناعي.
في هذا البروتوكول عن طريق الفيديو ونحن لشرح كيفية عزل خلايا وحيدات النوى (الشركات المتعددة الجنسيات) من الجهاز العصبي المركزي من الفئران مع EAE. الخطوة الأولى من هذا الإجراء يتطلب التروية القلبية من القوارض بمحلول ملحي لضمان عدم الدم يبقى في الأوعية الدموية للجهاز العصبي المركزي لري. فإن أي زيادة تلوث الدم بشكل مصطنع عدد من الشركات المتعددة الجنسيات ، CNS تسلل واضح ، وربما يغير من تركيبة واضحة لاختراق جهاز المناعة. ثم نظهر كيفية إزالة المخ والحبل الشوكي للفئران لتفتيت لاحقة لإعداد تعليق وحيد الخلية. يتم فصل هذا التعليق على التدرج Percoll طبقتين لعزل الشركات المتعددة الجنسيات. بعد الغسيل ، وهذه الخلايا بعد ذلك جاهزة للخضوع لأية إجراءات مطلوبة.
الخلايا وحيدة النواة معزولة باستخدام هذا الإجراء هي قابلة للتطبيق ويمكن استخدامها لالكهربية والتدفق الخلوي (FACS) ، أو الكيمياء الحيوية. إذا تم تنفيذ هذه التقنية يمكن تحت ظروف معقمة (باستخدام أدوات معقمة في نسيج الثقافة هود) أيضا الخلايا أن تنمو في المتوسط زراعة الأنسجة. ويمكن لسكان الخلية نظرا المنقى مزيد من الإجراءات باستخدام مغناطيس أو FACS ملف.
Protocol
- تخدير عميق الفئران. رذاذ مع الايثانول 70 ٪ والقيام التروية القلبية مع برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة لإزالة الخلايا من الأوعية الدموية (قطع الأذين الأيمن ويروي من خلال البطين الأيسر).
- إزالة المخ والحبل الشوكي ووضعه في أنبوب 50 مل تحتوي على الجليد الباردة برنامج تلفزيوني. قطع الدماغ والحبل الشوكي في مصفاة الخلية 70 ملم وضعت في طبق بتري 10 سم تحتوي على 10 مل من الجليد الباردة برنامج تلفزيوني. اضغط على كل قطعة من الجهاز من خلال مصفاة الخلية باستخدام الجزء الخلفي من المحاقن المعقمة الغواص 1 مل. جمع تعليق خلية واحدة في أنبوب 50 مل على الجليد. غسل الخلايا مصفاة مع برنامج تلفزيوني وإضافة إلى أنبوب حتى حل واضح.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 8-10 دقيقة على 390 غرام.
- Resuspend الخلايا في 20 Percoll PBS مل + 30 ٪ وتراكب على 10 مل من Percoll PBS + 70 ٪.
- الطرد المركزي في 390 غرام عن 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة الدهون على رأس الأنبوب. جمع الخلايا من واجهة ويغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني. العد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذا الإجراء ، وجميع الإجراءات التي تنطوي على الحيوانات الحية ، لا بد من استخدام الحيوانات التي وافقت عليها المؤسسة لديك ولجنة الرعاية. نوصي بأن طبيب بيطري أو فني بيطري يكون حاضرا عند تنفيذ perfusions first القلب لضمان مستوى كاف من التخدير وتعطى للحيوان قبل وأثناء الإجراء ، وأن الحيوانات لا يخضع لا لزوم لها الألم أو الضيق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS, 1x, sterile | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 14190-250 | |
| Cell strainer, 70 um | Tool | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Percoll | Reagent | Sigma-Aldrich | P1644 |
References
- Beeton, C., Chandy, K. G. Induction and clinical scoring of chronic-relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Visualized Experiments. 5, Forthcoming.
