EAE와 쥐의 중추 신경계에서 Mononuclear 세포의 분리

Summary

이 비디오에서는 실험자가 면역 질환 encephalomyelitis와 쥐의 중추 신경계에서 mononuclear 세포를 분리하는 방법을 보여줍니다.

Abstract

이러한 실험 면역 encephalomyelitis (EAE, 1), 또는 급성 회백수염, 라임 neuroborreliosis 또는 neurosyphilis로 CNS의 감염에 대한 면역 반응으로 중추 신경계 (CNS)에 감독 면역 질환을 공부하든, 그것은 자주 CNS - 침투 면역 세포를 분리하는 데 필요한.

이 비디오 프로토콜에서 우리는 EAE와 암흑의 CNS에서 mononuclear 세포 (MNCs) 분리하는 방법을 보여줍니다. 이 절차의 첫 단계는 피를 CNS 물을 대는 혈관에 남아하지 않도록 생리 식염수와 설치류의 심장 재관류가 필요합니다. 모든 혈액 오염 인공적으로 명백한 CNS - 침투 MNCs의 수를 증가하고 침투해 면역의 명백한 구성을 변경할 수도 있습니다. 그렇다면 우리는 단일 세포 현탁액을 준비하는 후속 dilaceration에 대한 쥐의 두뇌 및 척수를 제거하는 방법을 보여줍니다. 이 정지는 MNCs을 분리하기 위해 두 계층 Percoll 기울기에 구분합니다. 세척 후,이 세포가 모든 필요한 절차를 거쳐 준비가 된 것입니다.

이 프로 시저를 사용하여 격리 Mononuclear 세포가 가능한하고 전기 생리학, 유동세포계측법 (외과), 또는 생화학 사용할 수 있습니다. 기술은 멸균 조건하에 수행되는 경우 (조직 문화 후드에 살균 장비를 사용) 세포도 조직 문화 매체 재배하실 수 있습니다. 주어진 세포 인구는 더욱 자기 분리 절차 또는 외과 중 하나를 사용하여 정화하실 수 있습니다.

Protocol

1. 깊이 쥐가 마취. 70 % 에탄올로 스프레이하고 혈관에서 세포를 (좌심실을 통해 오른쪽 심방과 perfuse를 잘라)를 제거하는 10 분 PBS와 심장 재관류 해.
2. 얼음처럼 차가운 PBS를 포함하는 50 ML 튜브의 뇌 및 척수 및 장소를 제거합니다. 얼음처럼 차가운 PBS 10 ML을 포함 10cm 배양 접시에 놓인 70mm 셀 스트레이너의 뇌 및 척수를 자르고. 살균 한 ML 주사기의 플런저의 뒷면을 사용하여 셀 스트레이너를 통해 기관의 각 조각을 누르십시오. 얼음에 50 ML 튜브에 단일 세포 현탁액를 수집합니다. PBS로 세포 스트레이너를 씻고 솔루션은 분명 때까지 튜브에 추가할 수 있습니다.
3. G. 390에 80-10 분 원심 분리기
4. PBS + 70 % Percoll 10 ML에 20 ML PBS + 30 % Percoll과 오버레이에있는 세포를 Resuspend.
5. 상온 20 분 390g에 원심 분리기.
6. 튜브의 상단에있는 지방을 제거합니다. 인터페이스에서 세포를 수집하고 PBS로 두 번 씻는다. 백작.

Discussion

이 절차는, 살아있는 동물과 관련된 모든 절차로, 귀하의 기관의 동물 사용 및 관리위원회의 승인을 받아야합니다. 우리는 전에와 절차를 수행하는 동안 동물에 주어집니다 마취의 충분한 수준을 보장하기 위해 최초의 심장병 perfusions을 수행할 때 수의사 또는 동물 기술자가 존재하는 것이, 그리고 동물들이 불필요 통증이나 고통을 받아야하지 않는 것이 좋습니다.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
PBS, 1x, sterile	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	14190-250
Cell strainer, 70 um	Tool	Fisher Scientific	08-771-2
Percoll	Reagent	Sigma-Aldrich	P1644