Summary
Bu video sıçanlarda deneysel otoimmün ensefalomyelit ile merkezi sinir sistemi mononükleer hücreleri izole etmek için nasıl göstermektedir.
Abstract
Deneysel otoimmun ensefalomiyelit (EAE, 1), ya da bir enfeksiyon, çocuk felci, Lyme neuroborreliosis, ya da nörosifiliz olarak MSS, bağışıklık yanıtı gibi merkezi sinir sistemi (MSS) yönelik bir otoimmün hastalık eğitim olsun, genellikle MSS-infiltre bağışıklık hücrelerini izole etmek için gerekli.
Bu video protokol EAE ile sıçan CNS (ÇUŞ) mononükleer hücreleri izole etmek için nasıl göstermektedir. Bu prosedürün ilk adımı MSS sulama kan damarlarının kan kalmasını sağlamak için tuzlu su çözeltisi ile kemirgen kardiyak perfüzyon gerektirir. Herhangi bir kan kontaminasyon yapay görünür MSS-infiltre ÇUŞ sayısı artacak ve bağışıklık sızmak görünür kompozisyonu değiştirebilir. Daha sonra, tek bir hücre süspansiyonu hazırlamak için sonraki dilaceration sıçan beyin ve omurilik nasıl çıkarılacağını göstermektedir. Bu süspansiyon ÇUŞ izole etmek için bir iki katmanlı Percoll degrade ayrılır. Yıkadıktan sonra, bu hücreler daha sonra gerekli tüm prosedür geçmesi hazırız.
Bu yordamı kullanarak izole edilen mononükleer hücreler canlı ve elektrofizyoloji, flow sitometri (FACS), ya da biyokimya için kullanılabilir. Tekniği steril koşullar altında yapılır (bir doku kültürü kaputu steril alet kullanarak) hücreleri de doku kültürü ortamında yetiştirilen olabilir. Belli bir hücre popülasyonu daha fazla manyetik ayırma işlemleri ya da bir FACS kullanılarak temizlenmiş olabilir.
Protocol
- Derinden sıçanlarda uyutmak. % 70 etanol ile Sprey ve kan damarları hücreleri (sol ventrikül ile sağ kulakçıklar ve serpmek kesim) kaldırmak için 10 dakika süreyle PBS ile kardiyak perfüzyon.
- Buz gibi soğuk PBS içeren 50 ml'lik bir tüp içinde beyin ve omurilik ve yer çıkarın. Buz gibi soğuk PBS 10 ml içeren bir 10 cm petri yerleştirilen 70 mm hücre süzgeç beyin ve omurilik kesin. 1 ml steril bir şırınga pistonu geri kullanarak hücre süzgecinden her organın parçası basın. 50 ml tüp içine buz üzerinde bir tek hücre süspansiyonu toplayın. Hücre süzgeç PBS ile yıkayın ve çözüm netleşene kadar tüp eklemek.
- G. 390 8-10 dakika santrifüj
- 10 ml PBS + 70% Percoll üzerine 20 ml PBS +% 30 Percoll ve bindirme hücrelerin tekrar
- 390 g oda sıcaklığında 20 dakika santrifüjleyin.
- Tüpün üstüne yağ çıkarın. Arayüzü hücreleri toplamak ve PBS ile iki kez yıkayın. Sayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu prosedür, canlı hayvanlar ile ilgili tüm prosedürler, kurumun hayvan kullanımı ve bakımı komitesi tarafından onaylanmış olması gerekir. Biz bir veteriner hekim veya bir veteriner teknisyeni, hayvan öncesi ve işlem sırasında verilen anestezi yeterli bir düzeyde sağlamak için ilk kalp perfüzyonları yaparken mevcut olması ve hayvanların gereksiz yere acı veya sıkıntı tabi olmadığını tavsiye ederiz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS, 1x, sterile | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 14190-250 | |
| Cell strainer, 70 um | Tool | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Percoll | Reagent | Sigma-Aldrich | P1644 |
References
- Beeton, C., Chandy, K. G. Induction and clinical scoring of chronic-relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Visualized Experiments. 5, Forthcoming.
