Summary
In deze video laten we zien hoe de mononucleaire cellen van het centrale zenuwstelsel van ratten met experimentele auto-immune encephalomyelitis isoleren.
Abstract
Of het bestuderen van een auto-immuunziekte gericht aan het centrale zenuwstelsel (CZS), zoals experimentele auto-immune encephalomyelitis (EAE, 1), of de immuunrespons op een infectie van het CZS, zoals poliomyelitis, Lyme neuroborreliose of neurosyfilis, is het vaak noodzakelijk om de CNS-infiltrerende immuuncellen te isoleren.
In deze video-protocol waarin we laten zien hoe mononucleaire cellen (MNC) van het CZS van een rat met EAE te isoleren. De eerste stap van deze procedure is een cardiale perfusie van de knaagdieren met een zoutoplossing om ervoor te zorgen dat er geen bloed blijft in de bloedvaten bevloeit het centraal zenuwstelsel. Elke besmet bloed zorgt voor een kunstmatige toename van het aantal schijnbare CNS-infiltrerende multinationals en kan de schijnbare samenstelling van het immuunsysteem infiltreren wijzigen. Vervolgens hebben we laten zien hoe de hersenen en het ruggenmerg van de rat voor latere dilaceratie te verwijderen om een single-cell suspensie te bereiden. Deze schorsing is gescheiden op een twee-lagen Percoll verloop van de multinationals te isoleren. Na het wassen, deze cellen zijn dan klaar voor elke gewenste behandeling te ondergaan.
Mononucleaire cellen geïsoleerd met behulp van deze procedure zijn levensvatbaar en kunnen gebruikt worden voor de elektrofysiologie, flow cytometrie (FACS), of biochemie. Als de techniek wordt uitgevoerd onder steriele omstandigheden (met behulp van steriele instrumenten in een weefselkweek kap) de cellen kunnen ook worden gekweekt in weefselkweek medium. Een bepaalde cel populatie kan verder worden gezuiverd met behulp van magnetische scheiding procedures of een FACS.
Protocol
- Diep verdoven ratten. Spray met 70% ethanol en doe een cardiale perfusie met PBS gedurende 10 min om cellen van de bloedvaten (snijd de rechter boezem en perfuseren door het linker ventrikel) te verwijderen.
- Verwijder de hersenen en het ruggenmerg en doe dit in een 50 ml buis met ijskoud PBS. Snijd de hersenen en het ruggenmerg in een 70 mm cel zeef geplaatst in een 10 cm petrischaal met 10 ml ijskoud PBS. Druk op elk stukje orgaan door de cel zeef met behulp van de achterkant van een steriele 1 ml spuit zuiger. Verzamel de enkele celsuspensie in een 50 ml buis op ijs. Was de cel-zeef met PBS en toe te voegen aan de buis totdat de oplossing helder is.
- Centrifugeer voor 8-10 min op 390 g.
- Resuspendeer de cellen in 20 ml PBS + 30% Percoll en overlay op 10 ml PBS + 70% Percoll.
- Centrifugeer bij 390 g gedurende 20 min bij kamertemperatuur.
- Verwijder het vet op de top van de buis. Het verzamelen van de cellen van de interface en was tweemaal met PBS. Tellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze procedure, als alle procedures met betrekking tot levende dieren, moet worden goedgekeurd door dier van uw instelling gebruik en onderhoud commissie. Wij adviseren een dierenarts of een veterinaire technicus aanwezig zijn bij het uitvoeren van de eerste cardiale perfusie naar een voldoende niveau van de anesthesie te waarborgen wordt gegeven aan het dier voor en tijdens de procedure, en dat de dieren ondergaan onnodig pijn of angst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS, 1x, sterile | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 14190-250 | |
| Cell strainer, 70 um | Tool | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Percoll | Reagent | Sigma-Aldrich | P1644 |
References
- Beeton, C., Chandy, K. G. Induction and clinical scoring of chronic-relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Visualized Experiments. 5, Forthcoming.
