Summary
В этом видео показано, как выделить из мононуклеарных клеток центральной нервной системы крыс с экспериментальным аутоиммунного энцефаломиелита.
Abstract
Независимо от изучения аутоиммунных заболеваний, направленных на центральную нервную систему (ЦНС), таких как экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ, 1), или иммунного ответа на инфекцию ЦНС, таких, как полиомиелит, Лайма нейроборрелиоз, или нейросифилиса, часто Необходимо изолировать CNS-проникновение иммунных клеток.
В этом видео-протокола мы демонстрируем, как изолировать мононуклеарных клеток (МНК) с ЦНС крыс с EAE. Первым шагом этой процедуры требуется сердечной перфузии грызун с физиологическим раствором, чтобы кровь не остается в кровеносных сосудах орошения ЦНС. Любая кровь, загрязнение будет искусственно увеличить количество видимого CNS-проникновения ТНК и может изменить видимый состав иммунной инфильтрата. Затем показано, как удалить головного и спинного мозга крыс для последующего dilaceration подготовить одну-клеточной суспензии. Эта суспензия разделяется на два слоя градиент Перколла изолировать МНК. После мытья, эти клетки затем готовы пройти все необходимые процедуры.
Мононуклеарных клеток, выделенных с помощью этой процедуры жизнеспособны и могут быть использованы для электрофизиологии, проточная цитометрия (СУИМ), или биохимии. Если техника производится в стерильных условиях (с использованием стерильных инструментов в капот культуры тканей) клетки могут также быть выращены в культуральной среде. Данной популяции клеток могут быть дополнительно очищают, используя либо магнитные процедуры разделения или СУИМ.
Protocol
- Глубоко обезболить крыс. Спрей с 70% этанола и сделать сердечной перфузии с PBS в течение 10 минут, чтобы удалить клетки из кровеносных сосудов (вырезать право предсердий и заливать через левый желудочек).
- Удалить головного и спинного мозга и место в 50 мл пробирку ледяной PBS. Вырезать головного и спинного мозга в 70 мм ячейки фильтра размещены в 10 см, чашки Петри, содержащие 10 мл ледяной PBS. Пресс каждый кусок орган, через ячейки сетчатого фильтра использованием задней стерильный 1 поршень шприца мл. Сбор суспензии отдельных клеток в 50 мл пробирку на льду. Мыть сотовый фильтр с PBS и добавьте к трубке, пока раствор не станет прозрачным.
- Центрифуга в течение 8-10 мин при 390 g.
- Ресуспендируют клеток в 20 мл PBS + 30% Перколла и наложения на 10 мл PBS + 70% Перколла.
- Центрифуга на 390 г в течение 20 мин при комнатной температуре.
- Удаление жира в верхней части трубки. Сбор клеток из интерфейса и мыть дважды с PBS. Count.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эта процедура, как и все процедуры, связанные с живыми животными, должны быть одобрены животного вашей организации использования и ухода комитета. Мы рекомендуем, чтобы ветеринарный врач или ветеринарный техник присутствовать при выполнении первого сердечной перфузии, чтобы обеспечить достаточный уровень анестезии уделяется животных до и во время процедуры, и что животные не подвергаются ненужной боли и страданий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS, 1x, sterile | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 14190-250 | |
| Cell strainer, 70 um | Tool | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Percoll | Reagent | Sigma-Aldrich | P1644 |
References
- Beeton, C., Chandy, K. G. Induction and clinical scoring of chronic-relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Visualized Experiments. 5, Forthcoming.
