Summary
हम इस वीडियो में प्रदर्शन कैसे प्रयोगात्मक autoimmune Encephalomyelitis के साथ चूहों के केंद्रीय तंत्रिका तंत्र से mononuclear कोशिकाओं को अलग करने के लिए.
Abstract
एक autoimmune रोग केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (CNS) प्रयोगात्मक autoimmune (EAE, 1) Encephalomyelitis, या जैसे पोलियो, Lyme neuroborreliosis, या neurosyphilis सीएनएस के एक संक्रमण के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के रूप में प्रणाली, के लिए निर्देशित अध्ययन चाहे, यह अक्सर है CNS-घुसपैठ प्रतिरक्षा कोशिकाओं को अलग करने के लिए आवश्यक है.
हम इस वीडियो प्रोटोकॉल में प्रदर्शित कैसे EAE के साथ एक चूहे के सीएनएस से mononuclear कोशिकाओं (एमएनसी) को अलग करने के लिए. इस प्रक्रिया का पहला कदम एक नमकीन समाधान करने के लिए सुनिश्चित करें कि कोई रक्त रक्त वाहिकाओं सिंचाई सीएनएस में रहता है के साथ एक कृंतक के हृदय छिड़काव की आवश्यकता है. किसी भी रक्त संदूषण कृत्रिम रूप से स्पष्ट सीएनएस घुसपैठ बहुराष्ट्रीय कंपनियों की संख्या में वृद्धि होगी और घुसपैठ प्रतिरक्षा स्पष्ट संरचना बदल सकता है. हम तो प्रदर्शन कैसे और बाद dilaceration के लिए चूहे के मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी को दूर करने के लिए एक एकल कोशिका निलंबन तैयार. इस निलंबन एक दो परत Percoll ढाल पर बहुराष्ट्रीय कंपनियों को अलग अलग है. धोने के बाद, इन कोशिकाओं को फिर किसी भी आवश्यक प्रक्रिया से गुजरना करने के लिए तैयार हैं.
Mononuclear इस प्रक्रिया का उपयोग करने के लिए अलग कोशिकाओं व्यवहार्य हैं और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, प्रवाह cytometry (FACS), या जैव रसायन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यदि तकनीक बाँझ शर्तों के तहत किया जाता है (एक टिशू कल्चर हुड में बाँझ उपकरणों का उपयोग कर) कोशिकाओं को भी टिशू कल्चर माध्यम में हो जा सकता है. एक दिया सेल की आबादी आगे या तो चुंबकीय जुदाई प्रक्रियाओं या एक FACS का उपयोग कर शुद्ध कर सकते हैं.
Protocol
- गहरा चूहों anesthetize. 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे और रक्त वाहिकाओं से कोशिकाओं (और बाएं वेंट्रिकल के माध्यम से सही atria perfuse कटौती) को हटाने के लिए 10 मिनट के लिए एक पीबीएस के साथ हृदय छिड़काव करने के लिए.
- मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी और एक 50 मिलीलीटर ठंडा पीबीएस युक्त ट्यूब में जगह निकालें. और एक 70 मिमी सेल एक 10 सेमी पेट्री ठंडा पीबीएस के 10 मिलीलीटर युक्त पकवान में रखा झरनी में मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी कट. सेल एक बाँझ 1 मिलीलीटर सिरिंज सवार के पीछे का उपयोग झरनी के माध्यम से प्रेस अंग के प्रत्येक टुकड़ा. बर्फ पर एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में एकल कक्ष निलंबन लीजिए. पीबीएस के साथ सेल झरनी धो और ट्यूब को जोड़ने जब तक समाधान स्पष्ट है.
- 8-10 मिनट के लिए 390 पर जी अपकेंद्रित्र
- 20 मिलीलीटर पीबीएस 30 +% और पीबीएस 70 +% Percoll के 10 मिलीलीटर पर Percoll उपरिशायी में कोशिकाओं Resuspend.
- कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए 390 ग्राम अपकेंद्रित्र.
- ट्यूब के शीर्ष पर वसा निकालें. अंतरफलक से कोशिकाओं को इकट्ठा और पीबीएस के साथ दो बार धोने. गिनो.
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Discussion
इस प्रक्रिया है, सभी जीवित पशुओं को शामिल प्रक्रियाओं के रूप में, अपने संस्थान के पशु का उपयोग करें और देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित किया जाना चाहिए. हम अनुशंसा करते हैं कि एक पशुचिकित्सा या एक पशु चिकित्सा तकनीशियन मौजूद हो सकता है जब पहली बार हृदय perfusions प्रदर्शन संज्ञाहरण के एक पर्याप्त स्तर सुनिश्चित करने के पहले और प्रक्रिया के दौरान जानवरों को दी है, और है कि पशुओं को अनावश्यक दर्द या संकट से गुजरना नहीं है.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS, 1x, sterile | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 14190-250 | |
| Cell strainer, 70 um | Tool | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Percoll | Reagent | Sigma-Aldrich | P1644 |
References
- Beeton, C., Chandy, K. G. Induction and clinical scoring of chronic-relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Visualized Experiments. 5, Forthcoming.
