Protocol
Déclaration éthique: Toutes les expériences sont effectuées suivant les politiques établies par le Comité des soins et de l'utilisation des animaux institutionnel (IACUC) à l'Université internationale de Floride (IACUC 13-004).
1. EEG Recordings
- Préparation de la mini-bouchon EEG
- Plonger les pointes d'électrodes de l'EEG mini-bouchon au moins 12 heures dans de l'eau distillée avec du chlorure de 0,2%. Rincer le mini-bouchon EEG doucement dans de l'eau distillée. Séchez le bouchon et les électrodes dans l'air.
- Mix EEG pâte d'électrode avec une solution NaCl à 0,9% de la proportion de volume de 2: 1. Ajouter une goutte de bleu de méthylène, ce qui permettra de visualiser la pâte d'électrode à l'intérieur des électrodes et sur la peau. Prendre la pâte mélangée dans une seringue. Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles d'air dans la seringue. Injecter le gel dans chacune des 32 électrodes, leur remplissage sans introduire de bulles d'air. Il est recommandé d'injecter du fond plutôt que le haut. Ceci assure une meilleure access à chaque électrode et réduit la possibilité de déborder le gel.
- Tournez sur l'EEG et système d'enregistrement physiologique, et ouvrez le logiciel d'enregistrement correspondant sur l'ordinateur en cours d'utilisation.
- la préparation des animaux et de l'anesthésie
NOTE: l'épilepsie chronique a été créée en utilisant un protocole pour FCD 8 chez les rats Wistar. L'enregistrement EEG ont été menées chez des rats Wistar adultes (âgées de 8 semaines, 300 - 400 g).- Notez le poids du rat dans une feuille d'expérimentation. Utilisez ces informations pour calculer la dose sédative (DEXDOMITOR 0,25 mg / kg). Induire une anesthésie chez le rat avec 5% d'isoflurane et 100% d'oxygène (1 L / min à 14,7 psi).
- Après couper la tête du rat, de réduire l'isoflurane à 2% et le maintenir pendant le réglage complet de la mini-bouchon EEG. Vérifiez réflexes de rat sont absents (orteil-pincement). Placez le rat sur un coussin chauffant dans l'appareil de stéréotaxie en fixant les canaux de l'oreille à l'aide de barres d'oreilles. Assurez-vous que l'anesthésie cône de nez est sécurisé.
- Applis pommade ophtalmique lubrifiante à chaque oeil.
- Raser les cheveux supplémentaire sur la tête de rat et les oreilles à l'aide d'un rasoir. Évitez tout saignement pendant le rasage.
REMARQUE: Tous les cheveux à gauche sur la peau va produire du bruit dans les enregistrements EEG. Frotter la peau du rat avec 90% d'alcool isopropylique pour stimuler les vaisseaux sanguins et dessécher la peau. - Placez un tampon de solution saline sur le cuir chevelu et le couvrir complètement pour garder bonne conductance de la peau jusqu'à ce que le mini-bouchon EEG est prêt à être placé.
- Connectez température, la respiration, et de trois sondes de l'électrocardiogramme plomb. Notez que la température est mesurée par une sonde rectale. Surveiller en continu la physiologie du rat au cours de la procédure d'enregistrement. Assurez-vous que la température normale est de 37 ° C, la gamme de la respiration est 30 - 60 respirations par minute, et la fréquence cardiaque est d'environ 350 à 450 battements par minute.
- procédures d'enregistrement
- Retirez le tampon de solution saline sur le cuir chevelu du rat et placer le prêt EEG mini-cap sur sa peau. Fixer le mini-bouchon avec des bandes de caoutchouc. Placer une bande de caoutchouc sur la face avant du cuir chevelu, généralement à l'avant des yeux, et une autre bande à l'arrière du cuir chevelu entre les oreilles et le cou. Utilisez un protecteur en plastique sous le cou pour faciliter la respiration normale.
- Mettez une couche de conductance élevée pâte d'électrode sur les deux électrodes de masse et de référence. Placez-les sur l'oreille respective.
NOTE: L'électrode de référence peut être éventuellement placé dans d'autres endroits. - Branchez le mini-bouchon EEG aux amplificateurs et d'observer un aperçu de l'atelier de l'impédance de l'électrode. Vérifiez la performance de toutes les électrodes. Pour un enregistrement de haute qualité, veiller à ce que la valeur d'impédance est de l'ordre de 5 à 30 kQ. Si des électrodes bruyants, fournir un meilleur contact avec le cuir chevelu, soit en les déplaçant à l'intérieur de l'échafaudage vers le cuir chevelu ou plus doucement injection gel à partir de la partie supérieure de l'électrode.
- Administrer DEXDOMITOR (0,25 mg / kg) intraperiintraperitoneale et immédiatement réduire le taux isoflurane à 0%. Si le taux de respiration est pas dans 30 - 60 respirations par ordre de la minute, commencer à augmenter doucement le taux isoflurane. Ne pas dépasser la valeur de 1% d'isoflurane. Surveiller attentivement cette étape parce que le mélange de l'isoflurane et DEXDOMITOR pourrait inciter les animaux à un état critique.
NOTE: Sur le modèle préclinique de l'épilepsie focale, l'isoflurane affecte IED, alors que DEXDOMITOR ne fait pas. Questions à l 'isoflurane ont la propriété épileptogène plus faible, à savoir, relativement moins EEI peuvent être détecté par rapport à d'autres conditions 7,14. La dose de DEXDOMITOR est efficace pour environ 2 heures. Ainsi, pour gagner du temps pour son effet, la préparation a été réalisée sous l'isoflurane. - Mener des enregistrements EEG. Après l'enregistrement, marquer les positions des trois cercles en saillie de la mini-bouchon EEG sur le dessus de la peau en insérant un stylo de couleur à l'intérieur avant de la mini-bouchon EEG est retiré. Utilisez-les comme points de repère pour l'IRM co-enregistrement. Prenez une photo de la tête de rat avec les points de repère. Placez le rat à l'intérieur de la cage et de le surveiller jusqu'à la reprise complète de l'effet de DEXDOMITOR.
NOTE: Dans cette expérience, la couleur rouge (couleur de l'adversaire au vert) a été utilisé pour distinguer les positions des électrodes (en vert). Cependant, il est recommandé d'utiliser d'autres couleurs (violet / vert) si petites taches hémorragiques sont observés dans la peau.
Figure 1. Une image de la mini-bouchon EEG placé sur un rat particulier.
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2. Cerveau Imaging Source
- Classement IED
NOTE: La détection et la classification IED sont réalisés en utilisant des codes auto-développé dans MATLAB sur la base duétude précédente 15. Ce logiciel sera disponible sur demande.- Jeter canaux bruités en inspectant visuellement les traceurs de l'EEG. Retirer artefacts ECG en utilisant une méthode de soustraction automatique de forme d'onde périodique, qui est basé sur un modèle et une analyse de corrélation.
NOTE: Généralement, l'expérimentateur qui a enregistré l'EEG partage la feuille expérimentale écrite pour l'information du canal mauvaise observé sur la base des valeurs d'impédance. Logiciel pour supprimer les artefacts ECG sera également disponible sur demande.
Figure 2. Un exemple de la trace EEG montrant différents types d'EEI. La boîte rouge indique un type d'engins explosifs improvisés.
S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure. - Application d'un filtre passe-bande avec des fréquences de coupure de 3 à 150 Hz et une encochefiltrer pour enlever la fréquence de ligne (60 Hz en général et 50 Hz dans certains pays) de déconnecté composant.
- Détecter deux types d'EEI (pointes et tranchants-ondes). Pointes et francs-ondes constituent les grands événements électriques de 20 à 70 ms et de 70 à 200 ms en durée respectivement. Par conséquent, après application d'un filtre passe-bande respectif (fréquences de coupure de 15 à 50 Hz pour les pointes et de 5 à 15 Hz pour les francs-ondes), les IED sont détectées sur la base de seuils d'amplitude 15.
REMARQUE: Les seuils sont automatiquement mis à 4σ comme suggéré dans l'étude précédente de l'activité multiunit 15. Ici, σ est un écart-type estimée du signal passe-bande filtrée, σ = {médian | signal filtré | / 0.6745}. - Sous-classer les pointes et tranchants-ondes dans différentes grappes. Les caractéristiques distinctives de différentes pointes et tranchants-ondes sont extraites en utilisant la transformée en ondelettes 15. Ils sont sous-classés en plusieurs clusters utilisant k-means,et le nombre optimal de cluster k est déterminée en utilisant silhouette.
- La moyenne des signaux de sous-classées dans le même cluster. Les signaux EEG moyenne pour chaque sous-type IED seront utilisés pour l'analyse de la source de cerveau.
- Jeter canaux bruités en inspectant visuellement les traceurs de l'EEG. Retirer artefacts ECG en utilisant une méthode de soustraction automatique de forme d'onde périodique, qui est basé sur un modèle et une analyse de corrélation.
- modèle de conducteur de Volume
NOTE: Pour les sections suivantes, le logiciel open source, Brainstorm 12, sera utilisé avec l'atlas IRM pour rats Wistar 9. Cependant, l'IRM de rat individuel peut également être utilisé pour générer le modèle de conducteur de volume si elle est disponible. L'atlas IRM 9 peut être téléchargé à http://www.idac.tohoku.ac.jp/bir/en/ . Ce site fournit l'atlas que le format nifti section «rat Wistar IRM Atlas" en vertu, et il peut être accessible après inscription. Le logiciel nécessaire pour le pré-traitement peut également être trouvée dans ce site.- IRM d'entrée et la surface du cerveau pour le logiciel 12.
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- Générer surface de la tête avec le réglage par défaut.
S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure. - Générer le cuir chevelu et les surfaces de crâne internes / externes sur la base de l'IRM pour le champ de calcul plomb 12.
NOTE: La résolution des sommets influence la précision de la source estimée, mais grand nombre de sommets résultats dans la complexité de calcul haute. Nombre recommandé de sommets de chaque couche est 642 pour une précision acceptable avec la complexité de calcul équitable. L'épaisseur du crâne peut être vérifiée à partir de l'IRM, et dans le cas de l'atlas IRM, il est d'environ 1 mm. Après l'insertion de valeurs ci-dessus dans le logiciel, triangle face-sommet correspondant mailles pour chaque surface sera créé.
S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure. - Vérifiez l'orientation et l'emplacement de chaque surface par rapport à l'IRM en utilisant l'option de visualisation. Modifier en conséquence, si les surfaces ne sont pas co-enregistrées 12.
S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure. - En utilisant l'image de la tête de rat acquise en 1.3.5. co-enregistrer les positions des trois points de repère (R1, R2, R3) et à l'IAM. Utilisez les points de monuments de la grille comme des références à generate les positions d'électrodes que les électrodes sont fixées sur l'échafaudage (figure 3B).
Figure 3. (A) Rat image de la tête utilisé pour obtenir des positions d'électrodes et (b) l'EEG mini-bouchon schéma avec le système de coordonnées. Les points rouges dans (A) indiquent les points de repère mentionnés dans 1.3.5. qui correspondent aux numéros rouges dans (B). En outre, les notes vertes dans (A) représentent les positions des électrodes 32, et elles correspondent aux numéros en bleu (B).
S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure. - Générer N × 3 électrode matrice de position basée sur les 3 points de repère. Ici, N est le nombre de canaux (N = 32) et la colonne représente le x, y, z et les valeurs de coordonnées correspondant.
NOTE: Le mini-bouchon EEG est un échafaudage rigide. Par conséquent, une fois que les grilles de référence 3 (R1, R2, et R3) sont obtenues, la position des électrodes est automatiquement réglée. L'utilisateur aura seulement besoin de redéfinir les valeurs Z sur une voie que le mini-bouchon est projeté de manière appropriée sur le cuir chevelu. Le point N grilles peuvent être numérotés comme le montre la figure 3B chiffres bleus. L'échafaudage standard pour le mini-bouchon EEG est disponible dans le commerce (Table des Matières). Le logiciel pour co-inscription est également disponible à la communauté. - Entrez le fichier de canal généré.
S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure. - Afficher et confirmer l'emplacement de toutes les électrodes. Modifiez les électrodes 12 égarés. Le système de coordonnées finale pour l'électrode positions doivent coïncider avec le système de coordonnées utilisé pour les surfaces mentionnées ci-dessus.
REMARQUE: Les surfaces créées peuvent être inspectés visuellement sur une IRM en utilisant l'option de visualisation, Et puis, une surface choisie seront affichés comme ligne jaune à l'IRM "enregistrement IRM Vérifiez IRM / Enregistrement de surface.". En outre, les 3 points de repère et les positions des électrodes 32 peuvent être affichées sur l'IRM en sélectionnant l'option de la boîte à outils, "Afficher Capteurs IRM Viewer." Les emplacements peuvent être inspectés visuellement en comparant les distributions basées sur les yeux et les oreilles des endroits du rat ( Figure 4).
Figure 4. atlas (A) IRM avec surface de co-enregistrées cerveau (ligne jaune), (B) le modèle de conducteur de volume créé avec les alignés 32 électrodes et 3 points de repère (points rouges), et de l'atlas (C) IRM avec co-enregistrées ref érence grille R1.
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- IRM d'entrée et la surface du cerveau pour le logiciel 12.
- Brain Imaging Source
- Calculer plomb matrice de champ 13. Entrez les valeurs de conductivité qui satisfont le rapport de la peau, du crâne et du cerveau comme 1: 1/80: 1. obtenir la matrice de champ à base de plomb sur le modèle de volume conducteur et les positions d'électrodes créés dans 2.2.
REMARQUE: La boîte à outils propose 12 l'interface avec les autres logiciels pour calculer BEM 10. Par conséquent, seules les valeurs de conductivité sont nécessaires comme entrée.
S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure. - Saisissez les signaux EEG moyenne pour chaque sous-type IED stockée dans 2.1.4.
"Src =" / files / ftp_upload / 52700 / 52700vis7.jpg "/>
S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure. - Obtenir solution sLORETA 13 sur la base de la matrice de champ de plomb calculée et entrée les signaux EEG. En sélectionnant l'option de procédé d'estimation de la source, la solution inverse peut être obtenue 12.
S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure. - Tracer les sources estimées.
- Calculer plomb matrice de champ 13. Entrez les valeurs de conductivité qui satisfont le rapport de la peau, du crâne et du cerveau comme 1: 1/80: 1. obtenir la matrice de champ à base de plomb sur le modèle de volume conducteur et les positions d'électrodes créés dans 2.2.
Representative Results
Une fois que toutes les procédures sont correctement remplis, sources estimées peuvent être visualisées dans la surface du cerveau du modèle pré-clinique. La figure 5 montre les sources estimées d'un sous-type particulier de pointes (en haut) et une forte-ondes (en bas) de EEI. En outre, la figure 6 montre comment les changements de distribution de la source dans des délais séquentiels au cours d'une mise en place de la saisie. Ces résultats confirment la capacité des méthodes proposées pour enregistrer haute résolution EEG sur des rats souffrant d'épilepsie focale et de mener une analyse de source en utilisant la EEG enregistré.
Figure 5. Estimation source de cerveau emplacement des IED à l'égard de différents groupes en épis (en haut) et tranchants-ondes (en bas). (A) des séries chronologiques, (B) EEG topographie, et (C) de courant corticales aigreCES. L'évaluation est effectuée à un moment spécifique marqué avec une ligne verticale rouge dans (A).
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Figure 6. sources cérébrales estimé lors de la saisie. Les instants sont marqués comme des lignes verticales rouges.
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Discussion
Une nouvelle méthodologie pour non-invasive enregistrement multicanal EEG dans un modèle préclinique particulier de l'épilepsie focale est décrite. Les renseignements pour les procédures d'enregistrement et d'analyse, avec des conseils expérimentales spécifiques, sont fournis. Il y avait des facteurs clés à considérer la réalisation de bons résultats. Tout d'abord, pour les enregistrements EEG, obtenir des signaux de haute qualité est essentiel. Bonne viscosité de la pâte de EEG doit être appliquée à chaque électrode lors de la préparation de mini-bouchon, et la tête et les cheveux oreille du rat devrait être complètement enlevée pendant le rasage. Chèque Impédance est l'étape la plus importante pour confirmer la qualité des enregistrements EEG. Deuxièmement, pour l'imagerie source du cerveau, générant modèle de conducteur de volume correct est crucial. Chaque surface doit être co-enregistré. En outre, les positions des électrodes produites doivent avoir erreur de distance minimum à partir des emplacements réels des électrodes sur le cuir chevelu du rat.
Même si ce manuscrit présente la sourceles procédures d'analyse à l'aide de Brainstorm 12, ils peuvent être effectuées en utilisant d'autres logiciels ouverts 16,17 et 18,19 des produits commerciaux. Aussi, outre sLORETA 13, d'autres solutions telles que les modèles inverses dipolaires multiples et Beamformer peuvent être appliqués 4.
Une limitation de cette approche est que l'analyse du comportement ne peut être effectué depuis l'enregistrement EEG est effectuée sous sédation. Cependant, par rapport aux autres procédés pour l'enregistrement EEG chez le rat 5,6, cette approche est non invasive.
Nos résultats préliminaires confirment l'importance pour une classification précise des marqueurs IED à partir d'enregistrements EEG pour déterminer les zones d'irritation dans un rat avec l'épilepsie focale, ainsi que pour évaluer leur relation avec les mécanismes sous-jacents de saisie initiation 11. En outre, il a été montré que la localisation de la source pour de tels engins explosifs improvisés EEG spécifiques a montré une bonne correspondance avec la resprégions caces BOLD d'activation et de désactivation 20.
Notre étude va stimuler l'utilisation de modèles précliniques pour évaluer les stratégies lit-banquette-lit développés par les ingénieurs biomédicaux. Par exemple, l'extraction IED est aujourd'hui réalisée dans les hôpitaux manuellement, ce qui nécessitait un effort humain considérable. La méthodologie proposée dans cette étude fait automatiquement. Nous émettons l'hypothèse que l'utilisation de cette méthodologie va produire des résultats similaires lorsqu'il est appliqué à des patients avec FCD. Nous préparons les protocoles de la CISR pour l'évaluation de cela et d'autres aspects de la méthodologie dans le dataset humaine.
En outre, l'utilisation de modèles précliniques nous aidera à comprendre les capacités et les limites de la localisation de source EEG dans les épilepsies 21. L'estimation précise des sources du cerveau sous-fifre épileptogenèse est crucial pour les stratégies thérapeutiques et la planification chirurgicale. Aussi, avoir une plate-forme standard pour l'enregistrement EEG chez le rat sera utile pourl'évaluation de l'efficacité de plusieurs médicaments anti-épileptiques dans des essais précliniques. Cette étude est la première dans laquelle des rats épileptiques sont enregistrées de manière non invasive sous sédation, ce qui ouvrira de nouvelles portes pour l'évaluation de biomarqueurs EEG pour l'épilepsie. Toutefois, l'ensemble de la méthodologie présentée dans cette étude est extensible à d'autres conditions expérimentales et les troubles cérébraux. Le mini-bouchon EEG peut aussi être utilisé dans les types des autres rongeurs.
Dans le passé, un paradigme de stimulation patte chez des rats Wistar a été utilisé pour évaluer la qualité et la reproductibilité des données enregistrées avec l'EEG mini-bouchon 2. En outre, les validations pour la reconstruction de source du cerveau ont été effectués à partir du crâne EEG haute résolution simultanément enregistré avec laminaires potentiels de champ locaux de rats Wistar sous un paradigme de stimulation des moustaches 22. Cette méthodologie a été développée pour les rats Wistar en raison de l'existence d'un atlas IRM pour ce rat s particuliertrain. Cependant, elle peut être appliquée à d'autres types de rongeurs avec leur format standard de 23 souris, y compris atlas, des rats Sprague-Dawley 24 et Paxinos et Watson 25 rats. En outre, les procédures fondamentales de notre méthodologie proposée pourraient être utilisées dans des modèles précliniques pour rongeurs qui EEG est une modalité importante. Cependant, de nombreux aspects de cette méthode sont particulièrement pour l'épilepsie, en particulier ceux liés à l'EEG prétraitement (détection et la classification IED). Aussi, les chercheurs doivent être conscients des médicaments appropriés utilisés pour la sédation dans les différents cas. L'utilisation de l'isoflurane et DEXDOMITOR dans notre étude a été soigneusement examiné en raison de l'impact réduit sur les IED. En ce qui concerne les enregistrements EEG, dans le cas de la souris, la superficie relativement petite de la surface du cuir chevelu permettrait de réduire le nombre de canaux considérablement.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Pedro A. Hernandez Valdes, François Tadel, et Lloyd Smith pour leurs précieux conseils et une discussion fructueuse. Nous remercions aussi Rafael Torres pour la lecture de la preuve.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Data Acquisition Computer | Hewlett-Packard | Z210 Workstation | |
| Dexdomitor | Orion Pharma | 6295000 | Dexmedetomidine hydrochloride |
| EEG Analysis Software | The Mathworks Inc. | MATLAB R2011b | |
| Brainstorm | Sylvain et al. 2001 | ||
| OpenMEEG | Gramfort et al. 2010 | ||
| EEG Data Streamer | Tucker-Davis Technologies | RS4 Data Streamer | |
| EEG Electrode Paste | Biotach | YGB 103 | |
| EEG Preamplifier | BioSemi | Active Two | |
| Brain Products | BrainAmp | ||
| Tucker-Davis Technologies | PZ3 Low Impedance Amplifier | ||
| EEG Recording Software | BioSemi | ActiView | |
| EEG Recording Software | Tucker-Davis Technologies | OpenEx - OpenDeveloper | |
| EEG SCSI Connector | BioSemi | Active Two SCSI Connector | |
| Brain Products | D-sub Connector | ||
| EEG Processor | Tucker-Davis Technologies | RZ2 BioAmp Processor | |
| Tucker-Davis Technologies | Zif-Clif Digital Headstage | ||
| High Resolution EEG Mini-cap | Cortech Solutions | DA-AR-ELRCS32 | US patent Application No. 13/641,834 |
| Isoflurane, USP | VedcoPiramal Healthcare | NDC 66794-013-25 | |
| Isopropyl Alcohol | Aqua Solutions | 3112213 | 90% v/v solution |
| Lubricant Ophthalmic Ointment | Rugby | NDC 0536-6550-91 | Sterile |
| NaCl | Abbott | 2B8203 | Vaterinary 0.9% Sodium Chroride Injection USP |
| Physiology Recording Software | ADInstruments | LabChart 7.0 | |
| Physiology Recording System | ADInstruments | PowerLab 8/35 | |
| Syringe | Monoject | 200555 | 12cc |
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