Protocol
Dichiarazione etica: Tutti gli esperimenti sono eseguiti secondo le politiche stabilite dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale (IACUC) alla Florida International University (IACUC 13-004).
1. EEG Recordings
- Preparazione del mini-cap EEG
- Immergere le punte degli elettrodi del mini-cap EEG almeno 12 ore in acqua distillata da cloruro 0,2%. Risciacquare il mini-tappo EEG delicatamente in acqua distillata. Essiccare il tappo e gli elettrodi in aria.
- Mix EEG elettrodo pasta con 0,9% di soluzione di NaCl nella proporzione volume di 2: 1. Aggiungere una goccia di blu di metilene, che aiuterà a visualizzare la pasta all'interno dell'elettrodo, gli elettrodi e sulla pelle. Prendere la pasta miscelata in una siringa. Assicurarsi che non vi siano bolle d'aria nella siringa. Iniettare il gel in ciascuno dei 32 elettrodi, riempiendole senza introdurre bolle d'aria. Si raccomanda di iniettare dal fondo piuttosto che la cima. Questo fornisce una migliore access a ciascun elettrodo e riduce la possibilità di gel traboccando.
- Accendere EEG e sistema di registrazione fisiologica, e aprire il software di registrazione corrispondente sul computer in uso.
- Preparazione degli animali e l'anestesia
NOTA: epilessia cronica è stata creata utilizzando un protocollo per FCD 8 in ratti Wistar. La registrazione EEG sono stati condotti in ratti adulti Wistar (8 settimane di vita, 300-400 g).- Registrare il peso del ratto in un foglio esperimento. Utilizzare queste informazioni per calcolare la dose sedativo (DEXDOMITOR 0,25 mg / kg). Indurre l'anestesia nel ratto con 5% isoflurano e ossigeno al 100% (1 L / min a 14,7 psi).
- Dopo tagliare la testa del topo, ridurre isoflurano al 2% e mantenerla per tutta la cornice del mini-cap EEG. Controllare riflessi ratto sono assenti (toe-pinch). Posizionare il ratto su una piastra elettrica nella apparato stereotassico fissando i condotti uditivi utilizzando barre di orecchio. Assicurarsi cono anestesia naso è sicuro.
- Apply lubrificante pomata oftalmica per ogni occhio.
- Radere i capelli supplementari sulla testa ratto e orecchie usando un rasoio. Evitare qualsiasi sanguinamento durante la rasatura.
NOTA: Qualsiasi capelli lasciati sulla pelle produrrà rumore nelle registrazioni EEG. Rub pelle del topo con il 90% di alcool isopropilico per stimolare i vasi sanguigni e sgrassare la pelle. - Posizionare un tampone salino sul cuoio capelluto e coprire completamente per mantenere una buona conduttanza cutanea fino al mini-cap EEG è pronto per essere posizionato.
- Collegare la temperatura, la respirazione, e tre sonde elettrocardiogramma piombo. Si noti che la temperatura viene misurata da una sonda rettale. Monitorare continuamente la fisiologia del ratto durante le procedure di registrazione. Assicurarsi che la temperatura normale è di 37 ° C, gamma respirazione è 30-60 respiri al minuto, e la frequenza cardiaca è di circa 350-450 battiti al minuto.
- Procedure di registrazione
- Rimuovere il tampone salino sul cuoio capelluto del ratto e posizionare il preparato EEG mini-cap sulla sua pelle. Fissare il mini-cap con elastici. Posizionare un elastico sul lato anteriore del cuoio capelluto, di solito davanti agli occhi, e un altro gruppo sul retro del cuoio capelluto tra le orecchie e il collo. Utilizzare una protezione di plastica sotto il collo per facilitare la respirazione normale.
- Mettere uno strato di alta conduttanza elettrodi di pasta su entrambi gli elettrodi di terra e di riferimento. Mettetele sul rispettivo orecchio.
NOTA: L'elettrodo di riferimento può essere eventualmente collocata in altre posizioni. - Collegare il mini-tappo EEG agli amplificatori e osservare in anteprima il banco di lavoro per l'impedenza degli elettrodi. Controllare le prestazioni di tutti gli elettrodi. Per una registrazione di alta qualità, assicurano che il valore di impedenza è nell'intervallo di 5-30 kΩ. Se ci sono elettrodi rumorosi, fornire un migliore contatto con il cuoio capelluto da uno spostandoli all'interno del ponteggio verso il cuoio capelluto o delicatamente iniettando più gel dall'alto dell'elettrodo.
- Somministrare DEXDOMITOR (0,25 mg / kg) intraperitoneally e subito ridurre il tasso di isoflurano al 0%. Se il tasso di respirazione non è di 30-60 respiri al minuto gamma, iniziare ad aumentare il tasso di isoflurano delicatamente. Non superare il valore di 1% isoflurano. Monitorare con attenzione questo passo perché la miscela di isoflurano e DEXDOMITOR potrebbe spingere gli animali ad una condizione critica.
NOTA: Sul modello preclinico di epilessia focale, isoflurano colpisce IED, mentre DEXDOMITOR non lo fa. I soggetti sotto isoflurano hanno più debole proprietà epilettogena, cioè, relativamente meno IED possono essere rilevati rispetto alle altre condizioni 7,14. La dose DEXDOMITOR è efficace per circa 2 ore. Così, per risparmiare il tempo per il suo effetto, la preparazione è stata effettuata sotto isoflurano. - Condurre registrazioni EEG. Dopo la registrazione, contrassegnare le posizioni dei tre cerchi sporgenti del mini-tappo EEG in cima alla pelle inserendo una penna di colore al loro interno prima del mini-tappo EEG viene rimosso. Usarli come punti di riferimento per la risonanza magnetica co-Iscrizione. Scatta una foto della testa ratto con i punti di riferimento. Posizionare il topo di nuovo dentro la gabbia e monitorarlo fino al recupero completo di effetto di DEXDOMITOR.
NOTA: In questo esperimento, il colore rosso (colore avversario a verde) è stato utilizzato per distinguere dalle posizioni degli elettrodi (verde). Tuttavia, si consiglia di usare altri colori (viola / verde) se i piccoli punti emorragici si osservano nella pelle.
Figura 1. Un'immagine del EEG mini-tappo posizionato su un particolare topo.
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2. cervello Imaging Source
- Classificazione IED
NOTA: Il rilevamento IED e la classificazione viene effettuata utilizzando i codici di auto-sviluppato in MATLAB in base allaprecedente studio 15. Questo software sarà disponibile a richiesta.- Scartare canali rumorosi ispezionando visivamente i traccianti EEG. Rimuovere artefatti EKG utilizzando un metodo automatico per la forma d'onda periodica sottrazione, che si basa su un modello e una analisi di correlazione.
NOTA: Normalmente, lo sperimentatore che ha registrato il EEG condivide il foglio sperimentale scritta per le informazioni del canale cattivo osservato sulla base dei valori di impedenza. Software per rimuovere gli artefatti ECG sarà disponibile anche su richiesta.
Figura 2. Un esempio di traccia EEG mostrando diversi tipi di IED. La scatola rossa indica un tipo di IED.
Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. - Applicare un filtro passa-banda con frequenze di taglio da 3 - 150 Hz e una taccafiltrata per rimuovere la frequenza di rete (60 Hz in generale e 50 Hz in alcuni paesi) offline componente.
- Rileva due tipi di IED (punte e onde aguzze). Picchi e onde aguzze costituiscono grandi eventi elettrici di 20-70 ms e 70-200 ms di durata rispettivamente. Pertanto, dopo l'applicazione di un rispettivo filtro passa-banda (frequenze di taglio 15 - 50 Hz per punte e 5 - Nel 15 Hz per onde aguzze), gli IED sono rilevate in base ad ampiezza soglie 15.
NOTA: Le soglie vengono automaticamente impostati 4σ come suggerito nello studio precedente per l'attività multiunit 15. Qui, σ è una deviazione standard stimata del segnale passa-banda-filtrato, σ = {mediana | segnale filtrato | / 0,6745}. - Sub-classificare le punte e onde aguzze in diversi cluster. Le caratteristiche distintive di diverse punte e onde aguzze vengono estratti mediante trasformata wavelet 15. Essi sono sotto-classificate in più cluster con k-means,e il numero di cluster ottimale k è determinato utilizzando silhouette.
- Calcolare la media dei segnali sub-classificati nella stessa cluster. I segnali EEG medi per ogni sottotipo IED saranno utilizzati per l'analisi di origine cerebrale.
- Scartare canali rumorosi ispezionando visivamente i traccianti EEG. Rimuovere artefatti EKG utilizzando un metodo automatico per la forma d'onda periodica sottrazione, che si basa su un modello e una analisi di correlazione.
- Volume modello conduttore
NOTA: Per le seguenti sezioni, il software open source, Brainstorm 12, verrà utilizzato con l'atlante MRI per Wistar ratti 9. Tuttavia, MRI ratto singolo può anche essere utilizzato per generare il modello di volume conduttore se disponibile. L'atlante MRI 9 può essere scaricato dal http://www.idac.tohoku.ac.jp/bir/en/ . Questo sito fornisce l'atlante il formato NIfTI sezione "Wistar Rat MRI Atlas" sotto, e può essere accessibile previa registrazione. Il software necessario per la pre-elaborazione può essere trovata anche in questo sito.- MRI ingresso e la superficie del cervello per il software 12.
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- Generare superficie della testina con l'impostazione di default.
Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. - Generare cuoio capelluto e le superfici del cranio esterna / interna in base alla risonanza magnetica per il campo principale di calcolo 12.
NOTA: La risoluzione dei vertici influenza la precisione della sorgente stimata, ma molti vertici risultati in alta complessità computazionale. Numero consigliato di vertici di ogni strato è 642 per la precisione accettabile con complessità computazionale fiera. Lo spessore del cranio può essere controllato dalla MRI, e nel caso dell'atlante MRI, è di circa 1 mm. Dopo aver inserito i valori superiori nel software, corrispondente triangolo faccia vertici mesh per verrà creato ogni superficie.
Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. - Controllare l'orientamento e la posizione di ciascuna superficie rispetto alla MRI utilizzando l'opzione di visualizzazione. Modificare di conseguenza, se le superfici non sono co-registrate 12.
Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. - Usando l'immagine testa topo acquisita in 1.3.5. co-registrare le posizioni dei punti di riferimento 3 (R1, R2, e R3) in MRI. Utilizzare i punti della griglia dei punti di riferimento come riferimenti generate le posizioni degli elettrodi come gli elettrodi sono fissati sulla scaffold (Figura 3B).
Figura picture testa 3. (A) Rat utilizzato per ottenere le posizioni degli elettrodi e (b) il diagramma mini-cap EEG con il sistema di coordinate. I puntini rossi in (A) indicano i punti di riferimento di cui al 1.3.5. che corrispondono ai numeri rossi in (B). Inoltre, i segni verdi in (A) rappresentano le posizioni degli elettrodi 32, e corrispondono ai numeri in blu (B).
Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. - Genera N × 3 elettrodo matrice posizione basata sui 3 punti di riferimento. Qui, N è il numero di canali (N = 32) e la colonna rappresenta il corrispondente x, y, z valori delle coordinate.
NOTA: Il mini-cap EEG è un'impalcatura rigida. Pertanto, una volta ottenute le 3 griglie di riferimento (R1, R2, e R3), la posizione degli elettrodi vengono impostati automaticamente. L'utente dovrà solo ridefinire i valori Z in modo che il mini-tappo è opportunamente proiettata sul cuoio capelluto. Le griglie di punti N possono essere numerati in sequenza, come mostrato in Figura 3B numeri blu. L'impalcatura standard per l'EEG mini-cap è disponibile in commercio (Table of Materials). Il software per la co-registrazione è a disposizione della comunità anche. - Inserire il file di canali generato.
Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. - Visualizzare e confermare la posizione di tutti gli elettrodi. Modificare gli elettrodi fuori luogo 12. Il sistema di coordinate finale per l'elettroposizioni de devono coincidere con il sistema di coordinate usato per le superfici suddette.
NOTA: Le superfici create possono essere controllate visivamente al una risonanza magnetica utilizzando l'opzione di visualizzazione, e poi, una superficie selezionata verranno visualizzati come linea gialla sulla MRI "registrazione MRI Controllare MRI / registrazione di superficie.". Inoltre, i 3 punti di riferimento e le 32 posizioni elettrodi possono essere visualizzati sulla risonanza magnetica selezionando l'opzione del toolbox, "Mostra Sensori MRI Viewer". Le posizioni possono essere controllati visivamente confrontando le distribuzioni basate su occhi e orecchie posizioni del ratto ( Figura 4).
Figura 4. atlante (A) RM con piano di co-registrate cervello (linea gialla), (B) il volume modello conduttore creati con le allineati 32 elettrodi e 3 punti di riferimento (punti rossi), e Atlas (C) MRI con co-registrate arbitro griglia erence R1.
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- MRI ingresso e la superficie del cervello per il software 12.
- Cervello Imaging Source
- Calcola matrice campo di piombo 13. Inserire i valori di conducibilità che soddisfano il rapporto di pelle, il cranio e cervello come 1: 1/80: 1. Ottenere la matrice campo principale in base al modello volume conduttore e le posizioni degli elettrodi creati in 2.2.
NOTA: La casella degli strumenti offre 12 l'interfaccia con gli altri software per il calcolo BEM 10. Pertanto, solo i valori di conducibilità sono richiesti input.
Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. - Inserire i segnali EEG medi per ogni sottotipo IED memorizzato in 2.1.4.
"Src =" / files / ftp_upload / 52700 / 52700vis7.jpg "/>
Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. - Ottenere soluzione sLORETA 13 basato sulla matrice campo piombo calcolato ei segnali di ingresso EEG. Selezionando l'opzione metodo di stima di origine, la soluzione inversa può essere ottenuta 12.
Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. - Tracciare le fonti stimate.
- Calcola matrice campo di piombo 13. Inserire i valori di conducibilità che soddisfano il rapporto di pelle, il cranio e cervello come 1: 1/80: 1. Ottenere la matrice campo principale in base al modello volume conduttore e le posizioni degli elettrodi creati in 2.2.
Representative Results
Una volta che tutte le procedure siano debitamente compilato, fonti stimati possono essere visualizzati nella superficie del cervello del modello pre-clinico. La Figura 5 mostra le fonti stimate da un particolare sottotipo di picchi (in alto) e onde aguzze (in basso) da IED. Inoltre, figura 6 mostra come i cambiamenti di distribuzione fonte in tempi sequenziali durante uno stabilimento sequestro. Questi risultati supportano la capacità delle metodologie proposte per la registrazione ad alta risoluzione EEG su ratti affetti da epilessia focale e per condurre analisi di origine utilizzando EEG registrato.
Figura 5. stimato posizioni di origine cerebrale di IED rispetto ai diversi gruppi a picchi (in alto) e onde aguzze (in basso). (A) serie temporali, (B) EEG topografia, e (C) Corrente corticali acidaces. La valutazione viene effettuata in un momento specifico marcata con una linea verticale rossa in (A).
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Figura 6. fonti cerebrali stimati durante il sequestro. Gli istanti sono contrassegnati come linee verticali rosse.
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Discussion
Una nuova metodologia per non invasivo multicanale registrare EEG in un particolare modello preclinico di epilessia focale è descritta. Le indicazioni per le procedure di registrazione e di analisi, con specifiche punte sperimentali, sono forniti. Ci sono stati i fattori chiave da considerare raggiungere risultati di successo. In primo luogo, per le registrazioni di EEG, ottenendo segnali di alta qualità è essenziale. La corretta viscosità della pasta EEG dovrebbe essere applicata a ciascun elettrodo durante la preparazione mini-cap, e la testa e l'orecchio capelli del ratto dovrebbe essere completamente rimosso durante la rasatura. Controllo impedenza è il passo più importante per confermare la qualità delle registrazioni di EEG. In secondo luogo, per l'imaging fonte cervello, generando corretto modello di volume conduttore è fondamentale. Ogni superficie deve essere co-registrato. Inoltre, le posizioni degli elettrodi generati devono avere un errore minima distanza dalle posizioni degli elettrodi reali sul cuoio capelluto del ratto.
Anche se questo manoscritto presenta fonteprocedure di analisi che utilizzano Brainstorm 12, possono essere effettuate utilizzando altri software aperti 16,17 e prodotti commerciali 18,19. Inoltre, oltre sLORETA 13, altre soluzioni inverse come molteplici modelli dipolo e Beamformer possono essere applicati 4.
Una limitazione di questo approccio è che l'analisi del comportamento non può essere condotta in quanto la registrazione EEG è effettuata sotto sedazione. Tuttavia, rispetto agli altri metodi di registrazione EEG nel ratto 5,6, questo approccio è invasivo.
I nostri risultati preliminari supportano l'importanza, per una precisa classificazione di IED marcatori da registrazioni EEG per determinare le zone irritativi in un ratto con epilessia focale, nonché per valutare il loro rapporto con i meccanismi alla base di sequestro iniziazione 11. Inoltre, è stato dimostrato che la localizzazione della sorgente EEG per tali IED specifici ha mostrato una buona corrispondenza con la respective attivazione e disattivazione regioni BOLD 20.
Il nostro studio stimolerà l'utilizzo di modelli preclinici per valutare le strategie bed-panca-letto sviluppati da ingegneri biomedici. Ad esempio, l'estrazione IED è oggi eseguita in ospedali manualmente, che ha richiesto un notevole sforzo umano. La metodologia proposta in questo studio fa automaticamente. Noi ipotizziamo che l'uso di questa metodologia produrrà risultati simili quando applicato ai pazienti con FCD. Ci stiamo preparando protocolli IRB per la valutazione di questo e di altri aspetti della metodologia nel set di dati umano.
Inoltre, l'uso di modelli preclinici ci aiuterà a capire le capacità ei limiti di localizzazione della sorgente EEG nell'epilessia 21. La stima accurata delle fonti cerebrali subalterno epilettogenesi è cruciale per le strategie terapeutiche e pianificazione chirurgica. Inoltre, avendo una piattaforma standard per la registrazione EEG in ratti sarà utile perla valutazione dell'efficacia di diversi farmaci antiepilettici in studi preclinici. Questo è il primo studio in cui ratti epilettici sono registrati in modo non invasivo sotto sedazione, che aprirà nuove porte per la valutazione di biomarcatori EEG per l'epilessia. Tuttavia, l'intera metodologia presentata in questo studio è estendibile ad altre condizioni sperimentali e disturbi cerebrali. L'EEG mini-tappo può essere utilizzato anche in altri tipi di roditori.
In passato, un paradigma stimolazione zampa in ratti Wistar è stato utilizzato per valutare la qualità e la riproducibilità dei dati registrati con il mini-tappo EEG 2. Inoltre, convalide per la ricostruzione di origine cerebrale sono stati condotti da alta risoluzione cranio EEG concomitanza registrato con potenzialità laminari campo locale di ratti Wistar sotto un paradigma stimolazione baffo 22. Questa metodologia è stata sviluppata per ratti Wistar a causa dell'esistenza di un atlante MRI per questo particolare ratto streno. Tuttavia, può essere applicato ad altri tipi di roditori con il loro formato standard di atlas compreso il mouse 23, Sprague-Dawley 24 e Paxinos e Watson ratti 25. Inoltre, le procedure fondamentali della nostra metodologia proposta potrebbero essere utilizzati in qualsiasi roditori modelli preclinici che EEG è una modalità importante. Tuttavia, molti aspetti di questa metodologia sono particolarmente per l'epilessia, in particolare quelle relative alla pre-elaborazione EEG (rilevamento IED e classificazione). Inoltre, i ricercatori devono essere consapevoli di farmaci adeguati utilizzati per la sedazione in diversi casi. L'uso di isoflurano e DEXDOMITOR nel nostro studio è stato considerato con attenzione a causa del ridotto impatto IED. Per quanto riguarda le registrazioni EEG, nel caso del mouse, l'area relativamente piccola superficie del cuoio capelluto ridurrebbe il numero di canali considerevolmente.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Pedro A. Valdes Hernandez, Francois Tadel, e Lloyd Smith per il loro preziosi consigli e fruttuosa discussione. Ringraziamo anche Rafael Torres per la correzione di bozze.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Data Acquisition Computer | Hewlett-Packard | Z210 Workstation | |
| Dexdomitor | Orion Pharma | 6295000 | Dexmedetomidine hydrochloride |
| EEG Analysis Software | The Mathworks Inc. | MATLAB R2011b | |
| Brainstorm | Sylvain et al. 2001 | ||
| OpenMEEG | Gramfort et al. 2010 | ||
| EEG Data Streamer | Tucker-Davis Technologies | RS4 Data Streamer | |
| EEG Electrode Paste | Biotach | YGB 103 | |
| EEG Preamplifier | BioSemi | Active Two | |
| Brain Products | BrainAmp | ||
| Tucker-Davis Technologies | PZ3 Low Impedance Amplifier | ||
| EEG Recording Software | BioSemi | ActiView | |
| EEG Recording Software | Tucker-Davis Technologies | OpenEx - OpenDeveloper | |
| EEG SCSI Connector | BioSemi | Active Two SCSI Connector | |
| Brain Products | D-sub Connector | ||
| EEG Processor | Tucker-Davis Technologies | RZ2 BioAmp Processor | |
| Tucker-Davis Technologies | Zif-Clif Digital Headstage | ||
| High Resolution EEG Mini-cap | Cortech Solutions | DA-AR-ELRCS32 | US patent Application No. 13/641,834 |
| Isoflurane, USP | VedcoPiramal Healthcare | NDC 66794-013-25 | |
| Isopropyl Alcohol | Aqua Solutions | 3112213 | 90% v/v solution |
| Lubricant Ophthalmic Ointment | Rugby | NDC 0536-6550-91 | Sterile |
| NaCl | Abbott | 2B8203 | Vaterinary 0.9% Sodium Chroride Injection USP |
| Physiology Recording Software | ADInstruments | LabChart 7.0 | |
| Physiology Recording System | ADInstruments | PowerLab 8/35 | |
| Syringe | Monoject | 200555 | 12cc |
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