Protocol
윤리 문 : 모든 실험 기관 동물 관리 및 사용위원회 플로리다 국제 대학 (IACUC) (IACUC 13-004)에 의해 설립 된 정책을 다음과 수행됩니다.
1. 뇌파 녹음
- 뇌파 미니 캡의 준비
- 뇌파 미니 캡 0.2 % 염화 증류수에 적어도 12 시간의 전극의 끝을 담가. 증류수에 부드럽게 뇌파 미니 캡을 씻어. 캡과 공기 전극을 건조.
- 2의 부피 비율 0.9 % NaCl 용액과 혼합 뇌파 전극 페이스트 : 1. 전극 내부와 피부에 전극 페이스트를 시각화하는 데 도움이 될 것입니다 메틸렌 블루의 드롭을 추가합니다. 주사기에 혼합 붙여 넣기를하세요. 주사기에 기포가 없는지 확인합니다. 기포를 도입없이 채우는 전극 (32)의 각각에 겔을 주입한다. 이것은 바닥이 아닌 위로부터 주입하도록 권장한다. 이것은 더 나은 전열을 제공합니다각 전극에 SS 및 흘리 겔의 가능성을 줄일 수 있습니다.
- 뇌파 및 생리 학적 기록 시스템의 전원을 켜고 사용중인 컴퓨터에 해당하는 레코딩 소프트웨어를 엽니 다.
- 동물 준비 및 마취
주 : 만성 간질은 위 스타 쥐에서 FCD 8 프로토콜을 사용하여 만들어졌습니다. (- 400 g을 8 주 오래 된, 300) 뇌파 기록은 성인의 Wistar 쥐에서 수행되었다.- 실험 시트에 쥐의 체중을 기록한다. 진정제 투여 량 (dexdomitor 0.25 ㎎ / ㎏)을 계산하기 위해이 정보를 사용합니다. 5 % 이소 플루 란과 산소 100 % (14.7 psi에서 / 분 1 L)와 함께 쥐에 마취를 유도한다.
- 후 2 % 이소 플루 란을 줄이고 EEG 미니 캡의 전체 설정을 유지하는 동안, 쥐의 머리를 손질. 쥐의 반사가없는 (발가락 핀치)입니다 확인합니다. 귀 막대를 사용하여 귀 운하를 고정하여 정위 장치에서 가열 패드에 쥐를 놓습니다. 반드시 마취 코 콘이 안전합니다.
- AP = 연합 뉴스각각의 눈에 윤활유 안과 연고를 플라이.
- 면도기를 사용하여 쥐의 머리와 귀에 여분의 머리를 면도. 면도 중에 출혈을 피하십시오.
참고 : 뇌파 기록의 노이즈를 만들어 피부에 남아있는 모든 머리. 혈관을 자극하여 피부 탈지 90 % 이소 프로필 알코올 쥐의 피부에 문질러. - 두피에 식염수 면봉을 놓고 뇌파 미니 캡 배치 할 준비가 될 때까지 좋은 피부 전도성을 유지하기 위해 완전히 커버.
- 온도, 호흡, 3 리드 심전도 프로브를 연결합니다. 온도가 직장 프로브로 측정합니다. 지속적으로 기록 과정에서 쥐의 생리를 모니터링 할 수 있습니다. 분당 60 호흡과 심장 박동이 약 350 - - 정상 온도가 37 ° C를인지 확인, 호흡 범위는 30 분당 450 비트.
- 녹음 절차
- 쥐의 두피에 식염수 면봉을 제거하고 준비 뇌파 미니-C를 배치그것의 피부에 AP. 고무 밴드와 미니 캡을 고정합니다. 귀와 목 사이에 두피의 뒷면에 하나의 고무 일반적으로 눈 앞의 두피의 전면에 밴드, 또 다른 밴드를 놓습니다. 정상 호흡을 용이하게하기 위해 목 아래에 플라스틱 보호 장치를 사용합니다.
- 모두 접지 전극과 기준 전극에 높은 전도성 전극 페이스트의 층을 넣습니다. 각각의 귀에 배치합니다.
주 : 기준 전극이 가능한 다른 위치에 배치 될 수있다. - 앰프 뇌파 미니 캡을 연결하고 전극 임피던스에 대한 워크 벤치의 미리보기를 관찰합니다. 모든 전극의 성능을 확인합니다. 30 kΩ의 - 고품질 기록 용, 임피던스 값 (5)의 범위에 있음을 보장한다. 어떤 시끄러운 전극이있는 경우, 전극의 상단에서 더 젤을 주입 부드럽게 두피쪽으로 비계 내부를 이동하거나 하나에 의해 두피와 더 나은 접촉을 제공합니다.
- dexdomitor를 관리 (0.25 ㎎ / ㎏) intraperitoneally 즉시 0 %로 이소 플루 란 속도를 줄일 수 있습니다. 호흡 속도가 30에서하지 않는 경우 - 분 범위 60 호흡, 부드럽게 이소 플루 란 속도를 증가 시작합니다. 1 %의 이소 플루 란의 값을 초과하지 마십시오. 이소 플루 란과 dexdomitor의 혼합물이 위험 상태로 동물을하라는 메시지를 표시 할 수 있기 때문에 신중하게 단계를 모니터링합니다.
참고 : dexdomitor하지 않는 반면에 초점 간질의 전임상 모델에서 이소 플루 란이의 IED에 영향을 미친다. 이소 플루 란 주제 아래, 즉 약한 간질 속성을 가지고, 상대적으로 적은 수의 IED는 다른 조건 7,14에 비해 검출 될 수있다. dexdomitor의 용량은 약 2 시간 동안 효과가있다. 따라서, 그것의 효과를위한 시간을 절약하기 위해, 제제는 이소 플루 란 하에서 수행 하였다. - 뇌파 기록을 실시한다. 기록한 후, 제거 EEG 미니 캡 전에 내부 색 펜을 삽입하여 피부 위에 EEG 미니 캡의 세 돌출 원의 위치를 표시한다. MRI 협력을위한 명소로 사용- 등록. 랜드 마크 쥐 헤드의 사진을 촬영합니다. 다시 케이지 안에 쥐를 놓고 dexdomitor의 영향에서 완전히 회복 될 때까지 모니터링합니다.
참고 :이 실험에서 붉은 색 (녹색 상대 색) 전극 위치 (녹색)과 구분하기 위해 사용되었다. 그러나, 작은 출혈 반점이 피부에서 관찰되는 경우 다른 색상 (보라색 / 녹색)을 사용하는 것이 좋습니다.
그림 1. 특정 쥐에 배치 뇌파 미니 캡의 그림.
2. 뇌 영상 소스
- 폭발물 공격 분류
참고 : IED 탐지 및 분류를 기반으로 MATLAB에서 자체 개발 한 코드를 사용하여 수행됩니다이전의 연구 (15). 이 소프트웨어는 요청에 의해 사용할 수 있습니다.- 시각적으로 뇌파 추적자를 검사하여 잡음 채널을 폐기하십시오. 템플릿과 상관 분석에 기반 주기적 파형 빼기위한 자동 방법을 사용 EKG 아티팩트를 제거한다.
주 : 일반적으로 EEG를 기록 실험자 임피던스 값에 기초하여 채널 관찰 불량 정보 기입 실험 시트를 공유한다. 심전도 아티팩트를 제거하는 소프트웨어는 요청도 사용할 수 있습니다.
도 2의 IED의 다른 유형을 나타내는 EEG 파형의 예. 빨간색 박스의 IED의 일종을 나타낸다.
이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. - 150 Hz에서 노치 - (3)의 차단 주파수를 대역 통과 필터를 적용라인 주파수 (일반적으로 60 Hz에서 일부 국가에서 50 Hz에서) 구성 요소를 오프라인으로 제거하는 필터.
- 의 IED (스파이크와 날카로운 파도)의 두 가지 유형을 감지합니다. 70 밀리 및 70 - - 각각 200 ms를 초과하는 시간 스파이크와 날카로운 파 20의 큰 전기 이벤트를 구성한다. 따라서, 각각의 대역 통과 필터 (15 컷오프 주파수 - 스파이크 50 Hz에서 5 - 날카로운 파 15 Hz로)을인가 한 후에, 진폭의 IED는 15 임계 값에 기초하여 검출된다.
참고 : 임계 값은 자동으로 멀티 유닛 활동 (15)에 대한 이전 연구에서 제안 4σ로 설정됩니다. {| 필터링 된 신호 | / 0.6745} 여기서, σ는 σ = 중간, 대역 통과 필터링 된 신호의 추정 표준 편차이다. - 다른 클러스터로 스파이크와 날카로운 파도 하위 분류합니다. 다른 스파이크와 날카로운 파도의 고유 한 특징은 15 웨이블릿 변환을 사용하여 추출한다. 그들은 하위 분류 된 K-수단을 사용하여 여러 클러스터로,및 최적의 클러스터 번호 k 실루엣을 사용하여 결정된다.
- 같은 클러스터 내에서 하위 분류 신호를 평균. IED 각 서브 타입에 대한 평균 EEG 신호는 뇌 소스 분석을 위해 사용될 것이다.
- 시각적으로 뇌파 추적자를 검사하여 잡음 채널을 폐기하십시오. 템플릿과 상관 분석에 기반 주기적 파형 빼기위한 자동 방법을 사용 EKG 아티팩트를 제거한다.
- 볼륨 도체 모델
참고 : 다음 섹션의 경우, 오픈 소스 소프트웨어, 브레인 스토밍 (12)는, 위 스타 쥐 (9)에 대한 자기 공명 영상 아틀라스와 함께 사용됩니다. 그러나, 개별 쥐의 MRI도 사용할 경우 부피 도체 모델을 생성하는데 사용될 수있다. MRI 아틀라스 (9)에서 다운로드 할 수 있습니다 http://www.idac.tohoku.ac.jp/bir/en/ . 이 웹 사이트는 "위 스타 쥐 MRI 아틀라스"섹션에서 NIFTI 형식으로 아틀라스를 제공하며, 등록 후 액세스 할 수 있습니다. 전처리에 필요한 소프트웨어는 또한이 웹 사이트에서 찾아 볼 수있다.- 소프트웨어 (12)에 입력 MRI 및 뇌 표면.
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- 기본 설정과 헤드 표면을 생성합니다.
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참고 : 정점의 해상도는 추정 소스의 정확성,하지만 높은 계산 복잡도에 정점 결과 많은 영향을 미친다. 각 층의 정점 권장 수는 공정 계산 복잡도와 허용 정확성에 대해 642입니다. 두개골의 두께는 MRI에서 검사 및 MRI 아틀라스의 경우, 약 1m이다 수M. 각각의 표면이 생성됩니다를 들어, 소프트웨어에서 위의 값을 삽입 삼각형 얼굴 정점에 대응 한 메쉬.
이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. - 시각화 옵션을 사용 MRI에 대하여 각각의면의 방향 및 위치를 확인한다. 어떤 표면이 공동 등록 (12)를하지 않은 경우, 적절하게 수정합니다.
이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. - 1.3.5에서 획득 한 쥐의 머리 사진을 사용. MRI에서 3 랜드 (R1, R2, 및 R3)의 위치를 동시 - 등록한다. G에 대한 참조로 랜드 마크의 격자 점을 사용하여전극 지지체 (도 3b)에 고정 될 때 전극의 위치를 enerate.
도 3 (A) 쥐 헤드 포토 좌표계 전극 위치와 (b) EEG 미니 캡도를 얻기 위해 사용된다. (A) 레드 도트는 1.3.5에서 언급 한 랜드 마크를 나타냅니다. 이는 (B)에 적색 번호에 대응한다. 또한, 녹색의 부호 (A)는 전극 (32)의 위치를 도시하고, 이들은 (B)에 청색 번호에 대응한다.
이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. - 3 랜드 마크를 기반으로 N × 3 전극 위치 매트릭스를 생성합니다. 여기서, N은 (N = 32)의 채널 번호이며 열에 대응하는 X, Y 및 Z 좌표 값을 나타낸다.
참고 : 뇌파 미니 캡은 단단한 발판이다. 3 기준 격자 (R1, R2, 및 R3)가 얻어지면 따라서, 전극의 위치가 자동으로 설정된다. 사용자는 미니 캡이 적절하게 두피에 투사하는 방식에서, Z 값을 재정의해야합니다. 도 3b에 도시 된 청색 번호로서 N 포인트 그리드는 순차적으로 번호가 될 수있다. 뇌파 미니 캡의 표준 비계 (자료 표) 상업적으로 사용할 수 있습니다. 공동 등록을위한 소프트웨어는 또한 지역 사회에 사용할 수 있습니다. - 입력 채널 생성 된 파일입니다.
이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. - 모든 표시 전극의 위치를 확인한다. 어떤 잘못 전극 (12)을 수정합니다. 전자의 최종 좌표계드 위치는 상술 한면에 사용되는 좌표계와 일치한다.
참고 : ". MRI / 표면 등록을 확인 MRI 등록 "생성 된 표면을 시각적으로 시각화 옵션을 사용하여 자기 공명 영상 검사 할 수 그리고, 선택된 표면이 자기 공명 영상에 노란색 선으로 표시됩니다. 또한, (3) 건축물 및 32 전극 위치는 툴박스의 옵션을 선택하여 MRI에 표시 할 수는 "센서 MRI 뷰어."의 위치를 육안 (래트의 눈 및 귀 위치에 따라 분포를 비교함으로써, 검사 될 수있다 그림 4).
공동 등록 뇌 표면 (황색 선), (B)로 정렬 32 전극 (3)의 랜드 마크 (빨강 점)으로 만들어 볼륨 도체 모델 및 공동 등록과 (C) MRI 아틀라스와도 4 (A) MRI 아틀라스 REF 퍼런 그리드 (R1).
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- 소프트웨어 (12)에 입력 MRI 및 뇌 표면.
- 두뇌 원본 영상
- 리드 필드 매트릭스 (13)를 계산합니다. 입력 1과 같이 피부, 두개골 및 뇌의 배율을 만족 전도도 값 : 1/80 : 1. 볼륨 도체 모델 및 2.2에서 작성한 전극의 위치에 기초하여 상기 리드 필드 행렬을 획득.
참고 : 도구 상자 (12)는 BEM (10) 계산하는 다른 소프트웨어와 인터페이스를 제공합니다. 따라서, 오직 전도성 값은 입력으로서 필요하다.
이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. - 입력 2.1.4에 저장된 각 IED 하위 유형에 대한 평균 뇌파 신호.
"SRC ="/ 파일 / ftp_upload / 52700 / 52700vis7.jpg "/>
이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. - 계산 리드 필드 매트릭스와 입력 EEG 신호에 기초 sLORETA 용액 13를 구합니다. 소스 추정 방법 옵션을 선택하여, 역 용액 (12)을 얻을 수있다.
이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. - 추정 소스를 플롯.
- 리드 필드 매트릭스 (13)를 계산합니다. 입력 1과 같이 피부, 두개골 및 뇌의 배율을 만족 전도도 값 : 1/80 : 1. 볼륨 도체 모델 및 2.2에서 작성한 전극의 위치에 기초하여 상기 리드 필드 행렬을 획득.
Representative Results
일단 모든 절차가 제대로 완료, 예상 소스는 전임상 모델의 뇌 표면에 가시화 될 수있다. (5) 스파이크 (위)과의 IED에서 날카로운 파도 (아래)의 하나의 특정 서브 타입에서 추정 된 소스를 보여줍니다. 또한, 6 표시도 방법 발작을 설정하는 동안 순차적 타임 프레임에 소스 배포판으로 변경됩니다. 이러한 결과는 초점 간질 쥐 고해상도 EEG를 기록하고 기록 된 EEG를 이용하여 소스 분석을 수행하는 방법을 제안하는 능력을 지원한다.
스파이크에서 다른 클러스터에 대해 (위)과 날카로운 파도 (아래)과의 IED의 그림 5. 예상 뇌 원본 위치. () 시간 시리즈, (B) 뇌파 지형, 및 (c) 신 현재의 대뇌 피질CES. 평가에서 빨간색 수직선 (A)로 표시된 특정 시간에 수행된다.
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발작 동안 그림 6. 예상 뇌 소스. 시간 순간은 빨간색 수직선으로 표시됩니다.
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Discussion
초점 간질 특정 전임상 모델에서 비 침습적 채널 EEG 기록하는 새로운 방법을 설명한다. 기록 및 분석 절차에 대한 내역은 특정 실험 팁을 제공하고 있습니다. 성공적인 결과를 달성 고려해야 할 중요한 요소가 있었다. 우선, EEG 레코딩을 위해 고품질의 신호를 얻는 것이 필수적이다. EEG 페이스트의 적정 점도는 미니 캡 제조 동안 각 전극에인가되어야하고, 쥐의 머리 및 귀 모발 면도 중에 완전히 제거되어야한다. 임피던스 체크 EEG 레코딩의 품질을 확인하기 위해 가장 중요한 단계이다. 둘째, 뇌 소스 이미징, 적절한 양 도체 모델을 생성하는 것은 매우 중요하다. 각면은 공동 등록해야합니다. 또한, 생성 된 전극의 위치는 랫트의 두피에 전극의 실제 위치에서 최소 거리 에러를 가져야한다.
심지어이 원고 소스를 소개하지만브레인 (12)를 사용하여 분석 절차는, 그들은 다른 오픈 소프트웨어 16,17과 18,19 시판품을 사용하여 수행 될 수있다. 또한 sLORETA 13 외에, 다중 다이폴 모델 빔 형성기와 같은 다른 역 용액 4를 적용 할 수있다.
이 방법의 하나의 제한은 EEG 기록이 진정 하에서 수행되기 때문에, 분석 동작을 수행 할 수 없다는 것이다. 그러나, 래트에서 5,6- EEG 기록을위한 다른 방법에 비해,이 방법은 비 침습적이다.
우리의 예비 결과는 초점 간질 쥐의 자극성 영역을 결정하기 위해,뿐만 아니라 발작 개시 (11)에 대한 기본 메커니즘과의 관계를 평가하기 위해 뇌파 기록에서 폭발물 공격 마커의 정확한 분류에 대한 중요성을 지원합니다. 또한, 이러한 특정의 IED에 대한 EEG 소스 지역화 RESP와 양호한 일치를 보였다 것으로 밝혀졌다ective BOLD 활성화 및 비활성화 지역 (20).
우리의 연구는 생물 의학 엔지니어에 의해 개발 된 침대 벤치 침대 전략을 평가하는 전임상 모델의 사용을 자극 할 것이다. 예를 들어, IED 추출 요즘 많은 인적 노력이 필요한 수동 병원에서 수행된다. 본 연구에서 제안 된 방법은 자동으로 수행합니다. 우리는 FCD 환자에 적용 할 때,이 방법의 사용은 유사한 결과를 얻을 수 있다는 가설을 세웠다. 우리는 이것의 평가와 인간의 데이터 셋의 방법론의 다른 측면에 대한 IRB 프로토콜을 준비하고있다.
또한, 전임상 모델의 사용은 우리가 간질 21 뇌파 소스 지역화의 기능과 한계를 이해하는 데 도움이 될 것입니다. epileptogenesis를 부하 뇌 소스의 정확한 추정은 치료 전략 및 수술 계획을 위해 매우 중요하다. 또한, 쥐의 뇌파 기록을위한 표준 플랫폼을 갖는 것이 유용 할 것이다전임상 시험에서 몇 항 간질 약물의 효과의 평가. 이 간질 뇌파 바이오 마커의 평가를 위해 새로운 문을 열 것 간질 쥐가 비 침습적 진정에 따라 기록되는 첫 번째 연구이다. 그러나, 본 연구에서 제시 한 전체 방법론은 다른 실험 조건 및 뇌 질환에 대한 확장입니다. EEG 미니 캡은 또한 설치류의 다른 유형에 이용 될 수있다.
과거에는, 위 스타 래트에서 앞발 자극 패러다임 EEG 미니 캡 (2)과, 기록 된 데이터의 품질과 재현성을 평가하기 위해 사용되어왔다. 또한, 뇌 소스 재구성에 대한 검증이 동시에 수염 자극 패러다임 (22) 아래의 Wistar 쥐에서 층류 지역 필드 잠재력으로 기록 된 고해상도 두개골 뇌파에서 수행되었다. 이 방법 때문에이 특정 쥐들에 대한 자기 공명 영상 아틀라스의 존재의의 Wistar 쥐를 위해 개발 된기차. 그러나, 마우스 (23), 흰쥐 24과 Paxinos 왓슨 래트 25 포함한 아틀라스 그들의 표준 포맷과 다른 설치류 유형에 적용될 수있다. 또한, 제안 된 방법의 기본적인 절차는 EEG가 중요한 양상되는 모든 설치류 전임상 모델에서 사용될 수있다. 그러나,이 방법의 여러 측면 뇌파 전처리 (IED 탐지 및 분류)에 관한 특히이 간질을 위해 특히이다. 또한, 연구진은 다른 경우에 진정 작용에 사용되는 적절한 약물을 알고 있어야합니다. 우리의 연구에서 이소 플루 란과 dexdomitor의 사용은 신중의 IED에 의한 영향이 감소하는 것으로 간주되었다. EEG 레코딩에 대해서, 쥐의 경우에, 두피에 비교적 작은 표면적은 상당히 채널 수를 감소시킬 것이다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
저자는 자신의 귀중한 조언과 유익한 토론 페드로 발데스 A. 에르난데스, 프랑소와 Tadel, 로이드 스미스에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 또한 증거 읽기 라파엘 토레스 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Data Acquisition Computer | Hewlett-Packard | Z210 Workstation | |
| Dexdomitor | Orion Pharma | 6295000 | Dexmedetomidine hydrochloride |
| EEG Analysis Software | The Mathworks Inc. | MATLAB R2011b | |
| Brainstorm | Sylvain et al. 2001 | ||
| OpenMEEG | Gramfort et al. 2010 | ||
| EEG Data Streamer | Tucker-Davis Technologies | RS4 Data Streamer | |
| EEG Electrode Paste | Biotach | YGB 103 | |
| EEG Preamplifier | BioSemi | Active Two | |
| Brain Products | BrainAmp | ||
| Tucker-Davis Technologies | PZ3 Low Impedance Amplifier | ||
| EEG Recording Software | BioSemi | ActiView | |
| EEG Recording Software | Tucker-Davis Technologies | OpenEx - OpenDeveloper | |
| EEG SCSI Connector | BioSemi | Active Two SCSI Connector | |
| Brain Products | D-sub Connector | ||
| EEG Processor | Tucker-Davis Technologies | RZ2 BioAmp Processor | |
| Tucker-Davis Technologies | Zif-Clif Digital Headstage | ||
| High Resolution EEG Mini-cap | Cortech Solutions | DA-AR-ELRCS32 | US patent Application No. 13/641,834 |
| Isoflurane, USP | VedcoPiramal Healthcare | NDC 66794-013-25 | |
| Isopropyl Alcohol | Aqua Solutions | 3112213 | 90% v/v solution |
| Lubricant Ophthalmic Ointment | Rugby | NDC 0536-6550-91 | Sterile |
| NaCl | Abbott | 2B8203 | Vaterinary 0.9% Sodium Chroride Injection USP |
| Physiology Recording Software | ADInstruments | LabChart 7.0 | |
| Physiology Recording System | ADInstruments | PowerLab 8/35 | |
| Syringe | Monoject | 200555 | 12cc |
References
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