Summary
Classical análisis de asimetría de la extremidad anterior de la prueba de cilindro se usa rutinariamente para evaluar los déficits de comportamiento en ratas después de la lesión cerebral o ictus; sin embargo, no puede detectar déficits consistentes en ratones. Este estudio demuestra que la cuantificación de comportamiento pata-arrastre es un análisis más sensible de la lesión cerebral en ratones.
Abstract
La prueba de cilindro se utiliza rutinariamente para predecir el daño isquémico focal a la corteza motora de la extremidad anterior en roedores. Cuando se coloca en el cilindro, roedores explorar por la crianza y tocando las paredes del cilindro con sus patas extremidades anteriores de apoyo postural. Después de una lesión isquémica a la corteza sensoriomotora extremidad anterior, ratas dependen más de su pata extremidad anterior afectada por el apoyo postural resulta en un menor número de toques con su pata afectada que se denomina asimetría extremidad anterior. En contraste, el daño isquémico focal en el cerebro de ratón no resultar en déficits consistentes comparables en la asimetría de la extremidad anterior. Si bien el déficit de asimetría extremidad anterior se observan con poca frecuencia, los ratones no demuestran una novela derrame cerebral posterior comportamiento llamado "pata-arrastre". Paw-arrastre es la tendencia de un ratón para arrastrar su pata afectada a lo largo de la pared del cilindro en lugar de empujar directamente fuera de la pared cuando el desmontaje de una parte trasera a una posición de cuatro patas. Hemos demostrado previamente quecomportamiento arrastrando la pata es muy sensible a pequeñas lesiones isquémicas corticales a la corteza motora de la extremidad anterior. Aquí le ofrecemos un protocolo detallado para el análisis de la pata y arrastrando. Definimos lo que una pata-de arrastre es y demostrar cómo cuantificar el comportamiento de la pata y arrastrando. La prueba del cilindro es una prueba sencilla y económica de administrar y no requiere de estrategias de privación de alimentos pre-entrenamiento o. En el uso de análisis de la pata-arrastrar con la prueba del cilindro, se llena un nicho para predecir lesiones isquémicas corticales como photothrombosis y endotelina-1 (ET-1) isquemia inducida - dos modelos que están cada vez más en popularidad y producen lesiones focales más pequeños de oclusión de la arteria cerebral media. Por último, medir el comportamiento de la pata y arrastrando en la prueba del cilindro permitirá que los estudios de la recuperación funcional después de una lesión cortical utilizando una amplia cohorte de cepas de ratones transgénicos, donde previo análisis de la asimetría de la extremidad anterior ha fallado en detectar déficits consistentes.
Introduction
El objetivo de las estrategias de regeneración neural es demostrar tanto la reparación de tejidos y la recuperación funcional. La recuperación funcional es típicamente evaluado con pruebas de comportamiento que miden los déficits funcionales, en este caso relacionado con las habilidades motoras que están asociados con el daño a las regiones específicas del cerebro. La lesión cerebral traumática o daño isquémico a la zona de la extremidad anterior de la corteza sensitivomotora se pueden demostrar por una serie de pruebas de comportamiento. Una de estas pruebas, la prueba del cilindro se utiliza ampliamente en ratas para evaluar los déficits funcionales en la actividad de la extremidad anterior 1. La prueba tiene un bajo coste de puesta a punto que requiere sólo un cilindro, una cámara y una mesa con una tapa transparente. Es fácil de administrar, ya que se basa en el comportamiento exploratorio natural de los roedores, por lo que no se requiere pre-entrenamiento y la privación de alimentos o recompensas. A pesar de estas numerosas ventajas, la prueba del cilindro se utiliza bajo-evaluar déficits extremidades anteriores en ratones después de lesiones focales en la extremidad anterior sensorimotor corteza, que atribuimos al análisis del comportamiento del ratón en la prueba de cilindro. Miembro Anterior asimetría es la medida clásica de análisis para la prueba del cilindro. Cuando se coloca en el cilindro, roedores exploran de forma natural las paredes del cilindro con la cría en sus patas traseras y tocando las paredes del cilindro con sus patas extremidades anteriores para mantener el equilibrio postural. El número de toques de la pata con la pared con cada extremidad anterior es fácilmente cuantificado por el rodaje de roedores durante esta exploración del cilindro. Asimetría extremidad anterior se produce cuando la extremidad anterior de la pata afectada hace menos toques con la pared de la extremidad anterior de la pata afectada y es indicativo de daño a la corteza sensitivomotora contralateral. En ratas, las inyecciones intra-corticales del agente vasoconstrictor, la endotelina (ET-1), en el córtex sensoriomotor extremidad anterior causa una lesión isquémica focal que resulta en déficits de comportamiento en la extremidad anterior contralateral. Las deficiencias en el uso de la extremidad anterior contralateral se detectan fácilmente como los cambios en forelimb asimetría en la prueba del cilindro en ratas 1-3. En contraste con las ratas sin embargo, los cambios en la asimetría de la extremidad anterior son variables y menos consistente en ratones después comparables ET-1 inyecciones 4-6. Aquí se demuestra una novela análisis del comportamiento del miembro anterior en la prueba de cilindro - análisis del comportamiento de la pata y arrastrando. Hemos demostrado previamente que el análisis de la pata-arrastrando es una medida más sensible de daño a la corteza sensitivomotora extremidad anterior en ratones que el análisis de la asimetría de la extremidad anterior clásica y por lo tanto es aplicable a una variedad de modelos de lesiones corticales focales.
El examen de cómo los contactos patas delanteras la pared del cilindro después del daño isquémico a la corteza sensoriomotora extremidad anterior reveló un comportamiento novedoso en ratones - pata-4 arrastrando. Una pata de arrastre se produce cuando un ratón se coloca sobre sus patas traseras para explorar la pared del cilindro y luego arrastra su pata afectada (contraindicado lesional) a lo largo de la pared del cilindro hacia su línea media o hacia abajo, mientras que la paredsu pata afectada proporciona apoyo postural contra la pared. Paw-arrastra rara vez ocurre en los ratones lesionados por lo tanto, la aparición de una pata-resistencia es un indicador positivo de la lesión en la extremidad anterior sensoriomotoras corteza 4. Hemos cuantificado previamente comportamiento pata-arrastrando en ratones después de ET-1 daño isquémico a la corteza sensoriomotora extremidad anterior y han mostrado un comportamiento pata-arrastrando sostenida en ratones hasta dos semanas después del accidente cerebrovascular 4. Aquí nos muestran que el comportamiento de la pata-arrastre se mantiene hasta cuatro semanas después del accidente cerebrovascular. Análisis del comportamiento de la pata-arrastrando proporciona una nueva y sensible herramienta para evaluar el daño isquémico focal a la corteza sensoriomotora extremidad anterior en ratones. Su bajo costo de configuración, facilidad de administración y anotando hacen de esta una herramienta simple, pero útil para evaluar rápidamente los déficits conductuales extremidades anteriores en ratones.
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Protocol
Declaración de Ética: Todos los experimentos fueron aprobados por la Universidad Memorial de Comité de Ética Animal Care de Terranova de acuerdo con las directrices del Consejo Canadiense de los Animales.
1. Los ratones
- Utilice ratones adultos. En este estudio, se utilizaron ratones macho adulto FVBN (n = 10) entre 2-4 meses. Los ratones en una hr 12:12 reverso del ciclo de luz-oscuridad y proporcionar comida para roedores estándar y agua ad libitum.
2. Los materiales requeridos para la Prueba de Cilindro
- Obtener una tabla con una tapa transparente para filmar la prueba cilindro. Las dimensiones de la mesa son irrelevantes, la parte superior debe ser de plexiglás o vidrio, y debe haber espacio suficiente para colocar un espejo por debajo de la mesa. Esto permite que para el ratón que se grabó en vídeo desde abajo. Use un espejo debajo de la tabla para reflejar la imagen a través del cilindro. Como alternativa, utilice una cámara al revés si está disponible. Las dimensiones de la mesa utilizados en este protocolo son 54 x 56 x 66.5cm (WxLxH) con un 51 x 51cm superior (ancho x largo).
- Obtener un espejo. Las dimensiones del espejo utilizados en este protocolo son 34 x 58 cm (ancho x largo).
- Obtener un cilindro transparente / plexiglás para el ratón para llevar a cabo. Las dimensiones del cilindro utilizados en este protocolo son 17.5cm de alto, 8,8 cm ID, 9.5cm diámetro exterior con un espesor de pared de 0.35cm. Un cilindro más alto puede ser necesario para las cepas de ratón más activos.
- Coloque el cilindro en el tablero de la mesa y filmar el reflejo en el espejo de abajo.
- Se requiere una cámara de vídeo y el trípode. Grabar videos en aproximadamente 650KB / s, que es de aproximadamente 190 MB por cada 5 min de vídeo cilindro. Asegúrese de que la cámara tiene una funcionalidad de zoom para asegurar que el cilindro abarca todo el campo de visión.
NOTA: La cámara de vídeo utilizado en este protocolo es un Sony DCR-SR42, 40x zoom óptico, zoom digital 2,000x, 680kpix que utiliza la definición estándar, vídeo NTSC entrelazado). - Obtener software para el análisis - un pl mediosayer con el apoyo de vídeo y modulación velocidad de reproducción. El reproductor de medios utilizados en este protocolo es la v2.1.2 VLC Media Player.
- Obtener un equipo con un sistema operativo capaz de ejecutar el reproductor multimedia y un monitor.
- Se requiere el almacenamiento electrónico de videos. Descargar videos a un disco duro externo o copiarlo en DVD para el almacenamiento a largo plazo.
NOTA: En 190 MB por vídeo, 84 sesiones caben en una tarjeta SD de 16 GB y 168 sesiones caben en una tarjeta SD de 32 GB. Debido al costo relativamente bajo de los medios SD, y la incertidumbre de cuánto tiempo algunos ratones requieren para completar 20 traseros, se recomienda una tarjeta de 32 GB. En el estudio actual, los videos fueron copiados de la cámara a un disco duro externo de 2 TB y luego vueltos a copiar en DVD como copia de seguridad.
3. Configuración experimental de la prueba del cilindro
- Fije espejo debajo de la mesa en un ángulo de 45 grados a la mesa. Haga esto utilizando dos soportes unidos a las patas de la mesa de Support la parte superior e inferior del espejo, respectivamente. Ubicaciones de los soportes se observan en una vista lateral de la mesa (Figura 1A) y una vista de cara de la tabla (Figura 1B).
- Coloque cilindro en el centro de la mesa. Dibuje cuatro líneas equidistantes en el que el cilindro se sienta en la mesa con un marcador negro (Sharpie) de manera que el cilindro puede ser levantada y regresó a la misma posición (Figura 2). Dibujo ellos en la parte inferior de la mesa transparente permite que el tablero de la mesa a limpiar entre los ensayos con animales sin disolver la tinta de marcador.
- Conecte la cámara y el trípode. Apunte la cámara hacia el espejo para que la imagen está mirando directamente a través del cañón del cilindro. Asegúrese de que la pared interior completa del cilindro es visible y sin obstrucciones por la base (Figura 3). Ver una vista lateral en de la configuración, incluyendo el ángulo relativo de la configuración de la cámara y el espejo, desde arriba (Figura 4A) y de lanivel de la mesa, incluyendo una cría de ratón (Figura 4B).
- Prepare tarjetas de referencia para identificar cada ratón antes de la filmación. Asegúrese de que las tarjetas suelen incluir un número de identificación para cada ratón, el punto de tiempo de la prueba (por ejemplo., 3 días después del tratamiento) y la fecha de la sesión de filmación. No incluya el grupo de tratamiento en la tarjeta de señal para garantizar el experimentador está cegado.
- Se requiere de Cine en condiciones de iluminación interior estándar como este nivel de luz para ver claramente los movimientos del ratón alrededor del cilindro.
NOTA: Si está disponible a filmar en la oscuridad con una cámara de luz roja puede ser suficiente, sin embargo, uno primero habría que probar si toca la pata y lastres son claramente visibles para la cuantificación.
4. Ejecución
- Comienza el rodaje. Mostrar la tarjeta de señal del ratón apropiada frente a la lente de la cámara.
- Baje el ratón en el cilindro de la parte superior abierta inmediatamente después de la filmación de la tarjeta de señal.
- Comienza el rodaje de ratón. Reducir al mínimo el ruido durante este tiempo, como los ratones pueden perder el interés en explorar si sobresaltada.
- Observar la parte trasera ratones para explorar el cilindro. Capturar el vídeo hasta que el ratón realiza un mínimo de veinte partes posteriores.
NOTA: Un trasera ocurre cuando ambas patas delanteras pierden el contacto con el suelo y el ratón se coloca en sus piernas traseras. - Limpie mesa y el cilindro con una solución de limpieza adecuada entre cada ratón para desinfectar y eliminar los olores de ratón.
- La congelación es cuando los ratones dejan de explorar y permanecer tranquilamente sentado en cuatro patas durante aproximadamente 5 minutos. Si los ratones se congelan antes de que ocurran veinte partes posteriores, puede ser necesario para eliminarlos desde el cilindro durante 10-20 min antes de reanudar la prueba. Si los ratones no realizan veinte partes posteriores, se retiran del estudio.
NOTA: En nuestra experiencia, los ratones nunca han necesitado ser excluido debido a un fallo de explorar el cilindro.
5. Evaluación de la prueba del cilindro usando la pata-ArrastrarAnálisis
- Reproduzca el vídeo a una velocidad de entre 0,25x y 0.67X velocidad regular dependiendo de la rapidez con el ratón explora el cilindro. Utilice un reproductor multimedia que ofrece velocidades de reproducción lentas.
- Cuantificar el número total de toques pata. Toques de la pata se producen cuando las traseras de ratón (Figura 5A), toca el lado del cilindro (Figura 5B), posteriormente desmonta con ambas patas simultáneamente (Figura 5C) y tierras (Figura 5d). La pata puede o no puede ponerse en contacto con la pared del cilindro con una palma completa, pero algún tipo de contacto con la pared del cilindro debe ocurrir. Evaluar toques pata contando el número de veces que el ratón hace contacto (no importa cuán breve) con la pared del cilindro con una o ambas patas delanteras mientras está de pie sobre sus patas traseras durante una trasera.
Tenga en cuenta que el contacto con la pared del cilindro solamente se cuenta como un "toque la pata" o "pata-arrastre" si el ratón está en una posición trasera - de pieen sus extremidades traseras con ambas patas delanteras fuera de la mesa. Si el ratón se mantiene en una postura de 3 puntos - ambos miembros posteriores y una pata de la mesa y se pone a tocar la pared con la pata libre - esto no se cuenta como un toque de la pata. Los ratones pueden trasero y tocar la pared del cilindro con una sola pata y esto se cuenta como un toque de la pata. Nota: un ratón también puede mover su cuerpo alrededor del cilindro durante una parte trasera, lo que hace más de dos contactos. Estos contactos se cuentan - uno para cada contacto pata izquierda y uno para cada contacto pata derecha. - Cuantificar el número de pata-arrastres. Comportamiento arrastrando la pata es distinta de toques normales pata.
- Si los contactos de la pata de la pared del cilindro con una palma abierta completa (Figura 6B), que poco a poco se apartarán de la pared, a menudo con un ligero temblor. El movimiento comienza con los dígitos arrastrando contra la pared del cilindro, ya sea en una dirección medial o hacia abajo, (Figura 6C) antes de caer lejos completely (Figura 6D). El ratón y luego desmontar con su pata afectada (Figura 6E) antes de aterrizar en cuatro patas (Figura 6F). Esto se considera una pata y arrastre y debe ser contada en un recuento.
- Si la pata no hace contacto con la pared del cilindro con una palma totalmente abierta, se pastar la pared del cilindro con sus dígitos antes de caer fuera de la pared del cilindro. Del mismo modo, un ratón puede arrastrar su pata contra la pared del cilindro, pero no lo liberan por completo antes de desmontar. Estos se consideran tanto la pata-arrastra, así como toques y debe ser contada como tanto en un recuento.
- La pata también puede arrastrar a lo largo de la pared del cilindro, mientras que un ratón explora el cilindro. En este caso, la pata seguirá la torsión del torso del ratón, ya que explora izquierda o derecha de su posición original (Figura 7A-D) antes de desmontar (Figura 7E). Esto no se considera una pata y arrastre, ya que depende del ratón elegir al azaruna dirección para explorar y no depende de que fue dañado hemisferio cortical.
- Paw-arrastres se expresan como un porcentaje de la pata-arrastra por número total de toques pata durante una sesión. Expresar el número de pata-drags como un porcentaje del total de contactos de la pata para cada extremidad anterior por separado.
- Toques que resulta en una pata y arrastre cuentan como una pata y arrastre y un toque simultáneamente. Por lo tanto, si un ratón arrastra su pata cada vez que sus contactos pata la pared del cilindro, el porcentaje de la pata-arrastrando se expresa como 100%.
6. Otros Diseño Experimental Sugerencias
- Para reducir al mínimo las variables extrañas:
- Pruebe los ratones al mismo tiempo en cada día de pruebas. Prueba de los ratones durante su ciclo de estela. Mantener los ratones en un ciclo de luz de marcha atrás 12 horas facilita el rendimiento.
- Los ratones pueden ser reacios a explorar el cilindro si hincapié ya sea por el ruido o un nuevo entorno. Prueba de ratones en su local de confinamiento o una habitación que han been familiarizado con reduce el estrés. Esto puede ocurrir si la habitación es ruidoso, si el ratón ha sido empujado antes de entrar en el cilindro o debido a la habituación.
NOTA: La prueba debe realizarse una vez antes de la manipulación experimental para servir como una lectura de línea de base. Después de la manipulación, días de pruebas son a discreción del experimentador, aunque se aconseja de evitar un número excesivo de las exposiciones al cilindro en un corto período de tiempo. - Los ratones puede llegar a ser reacios a atrás después de 6-7 exposiciones al cilindro. Para el estudio actual, los ratones se pusieron a prueba en el cilindro para un total de siete veces, antes de la isquemia y en los días 1, 3, 7, 14, 21 y 28 después de la cirugía.
NOTA: En este estudio se utilizó la cepa FVBN ratón. Hemos probado previamente ratones C57BL / 6 en el cilindro y el comportamiento de la pata-arrastrando observada después de una ET-1 lesión isquémica (datos no mostrados). C57BL / 6 ratones eran más activos que los ratones FVBN cuando la cría y con frecuencia saltaron sobre el borde del cilindroantes de subir a cabo. Taller cilindros se deben usar si los ratones intentan escapar saltando.
7. La endotelina-1 Cirugía e infarto Medidas Volumen
- Realizar endotelina-1 cirugía y mediciones de volumen del infarto de acuerdo con los protocolos publicados previamente 4. Para dirigirse a la corteza motora de la extremidad anterior anterior, cada ratón debe recibir tres ET-1 inyecciones en las siguientes coordenadas: (i) 0,7 anteroposterior (AP) /1.5 medial-lateral (ml) / - 1,2 dorsal-ventral (DV), ( ii) 0,4 AP / 1,25 ml / - 1,2 DV y (iii) 0,1 AP / 1,75 ml / -1,2 DV 4.
8. Análisis estadístico
- Se recomienda una de dos vías para medidas repetidas análisis de varianza (ANOVA) para analizar el porcentaje de pata-arrastrando las patas para afectados y no afectados a través de diferentes puntos de tiempo.
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Representative Results
Hemos demostrado anteriormente que el comportamiento de la pata-arrastrando aparece después de una lesión isquémica focal a la corteza sensoriomotora extremidad anterior y es un indicador positivo de daños 4. Inyecciones intra-corticales de ET-1 en el córtex sensoriomotor extremidad anterior se utilizaron para inducir una lesión isquémica (Figura 8A, B). Este estudio examinó si el comportamiento de la pata-arrastrando extendió por más de 14 días después de la lesión para su uso potencial para evaluar la recuperación funcional. Los ratones se pusieron a prueba en la prueba de cilindro en el día antes de la ET-1 inyecciones para el punto de tiempo antes de la cirugía, y en los días 1, 3, 7, 14, 21 y 28 después de la lesión. En cada punto de tiempo, se cuantificó el número de toques de la pata y arrastra la pata por tanto la pata afectada y no afectada. Dos vías ANOVA de medidas repetidas sobre el número de toques pata revelaron efectos significativos principales de tiempo [F (6,108) = 3,59, p = 0,0028] y sujetos [F (18,108) = 2,38, p = 0,0032], pero ningún efecto del tratamiento(Tabla 1). Considerando que, mediante el análisis estándar de la asimetría de la extremidad anterior de la prueba de cilindro que cuantifica toques pata afectados frente toques totales pata reveló extremidades anteriores inconsistente déficits conductuales. A un solo sentido ANOVA de medidas repetidas en el porcentaje de utilización de la pata afectada reveló un efecto principal significativo de tiempo (p = 0,015), que siguió por la prueba post hoc de Dunnett mostró reducciones significativas en el uso pata afectada por ciento a los 7, 14 y 21 días después -Cirugía y se recuperó a los 28 días después de la cirugía (Figura 8C). En contraste, una forma en dos medidas repetidas ANOVA sobre el número de pata drags revelaron efectos principales significativos de tiempo [F (6,108) = 7,09, P <0,0001], el tratamiento [F (1,108) = 33,02, P <0,0001], la interacción [ F (6,108) = 9,89, p <0,0001] y los sujetos [F (18,108) = 4,84, p <0,0001]. Más análisis post hoc de Bonferroni mostró un aumento significativo en el número de pata arrastra en cada punto de tiempo después de la cirugía (Tabla 1). Del mismo modo, una de dos vías ANOVA de medidas repetidas comparando el número de pata afectada-arrastra frente totales toques pata afectada reveló efectos principales significativos de tiempo [F (6,108) = 6.63, p <0,0001], el tratamiento [F (1,108) = 20,46, p = 0,0003], la interacción [F (6,108) = 8,21, p <0,0001] y sujetos (juego) [F (18,108) = 7,35, p <0,0001]. Más análisis post hoc de Bonferroni mostró un comportamiento significativo pata-arrastrando hasta 28 días después de la cirugía (Figura 8D). El comportamiento de la pata-arrastrando era específico para la extremidad afectada como ningún aumento o cambio en la pata-arrastre se observó con el miembro no afectado. Paw-arrastrando comportamiento con el pata afectada fue significativamente elevado en el 1, 3, 7, 21 y 28 días después de la cirugía (Figura 8D). Comportamiento arrastrando la pata alcanzó un máximo de 1 día después de la cirugía con> 30% de todos los toques pata con la extremidad anterior afectada resultando en una pata y arrastre a continuación, se redujo a ~ 15% a los 3 días después de la cirugía donde permaneció hasta e incluyendo 28 días después de la cirugía. A las 28 días después de la cirugía, los ratones fueron sacrificados y los volúmenes de infarto evaluados. El volumen del infarto media para el grupo fue de 3,2 ± 0,4 m 3 (n = 10 ratones). Estos resultados muestran que los pequeños infartos corticales pueden resultar en déficits conductuales significativas y sostenidas, medido en la prueba de cilindro. En resumen, estos datos demuestran que no sólo es la pata-arrastrando altamente sensible a los daños a la corteza sensoriomotora extremidad anterior, pero que la pata-arrastre también persiste en el tiempo y se puede utilizar para evaluar la recuperación funcional.
Figura 1. ubicaciones del soporte para sujetar el espejo en su lugar por debajo de la mesa. (A) Vista frontal de la tabla que muestra ubicaciones de los soportes de las patas delanteras de la tabla. (A ') Mayor aumento de la inserción en un lugar que muestra de soportes en las patas delanteras. (B) Vista posterior de la mesa de espectáculoing ubicaciones de los soportes de la pierna trasera. (B ') Mayor aumento de la inserción en B que indica la ubicación del soporte en las piernas traseras de mesa.
Figura 2. Marcar la ubicación para la colocación del cilindro en la mesa. Foto de la mesa que indica la colocación del cilindro con líneas negras dibujadas alrededor del perímetro de la base. Las flechas apuntan a las líneas negras dibujadas en la parte inferior de los Plexiglas utilizados para centrar el cilindro sobre la mesa.
Figura 3. Vista frontal de la cámara y la mesa puesta a punto. Foto de la mesa demostrando la línea de visión directa a través de la camisa del cilindro (flecha roja).
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Figura 4. Una vista lateral de la cámara y la tabla de configuración. La cámara está dirigida directamente a la base del cilindro. (A) Mesa y configuración de la cámara tomados de arriba. (B) Mesa y configuración de la cámara tomadas a nivel de la tabla, que muestra una cría de ratón en el cilindro.
Figura 5. Una secuencia de fotos que demuestran una cría de ratón ileso. (A) Foto de un ratón antes de la parte trasera. (B) El ratón toca la pared del cilindro con las dos patas. (C) Para desmontar, el ratón empujar contra la pared del cilindro con las dos patas, y (D) de la tierra en las cuatro patas. Pata izquierda Lt = del ratón, pata derecha Rt = del ratón.
Figura 6. Una secuencia de fotos que demuestran un ratón pata-arrastre lesionada. (A) Foto de un ratón antes de la parte trasera. (B) El ratón va a tocar la pared del cilindro con las dos patas; (C) y luego poco a poco dejar que los dígitos de la pata afectada arrastre verticalmente en la pared del cilindro; (D) antes de dejar la pata caer lejos de la pared. (E) El ratón entonces desmontar con su pata afectada y (F) de la tierra en las cuatro patas. Inserciones de gran aumento en B, C y D demuestran cómo los contactos patas delanteras afectadas la pared del cilindro. Pata izquierda Lt = del ratón.
Figura 7. A 'no la pata y arrastre'. (A) El ratón toca la pared del cilindro con ambas patas. (B) El ratón retuerce su torso lateralmente para explorar la pared del cilindro. (C) El ratón vuelve a las posiciones de su patas delanteras que conduce a una nueva posición lateralmente y arrastra la pata trasera en la misma dirección. (D) La pata de salida se planta firmemente en su nueva ubicación, y las dos patas se utilizan para desmontar (E) para regresar a las cuatro patas. Puntas de flecha rojas indican la ubicación de las patas en las posiciones de inicio y fin. La flecha roja indica el movimiento de arrastre pata a lo largo de la pared del cilindro.
Figura 8. Comportamiento de la pata-arrastre se mantiene durante 4 semanas después de una cortical focal, lesión isquémica. (A) ph Representante otomicrograph de una sección coronal del cerebro teñidas con violeta de cresilo a través de un ET-1 lesión isquémica a los 28 días después de la cirugía. (B) Mayor aumento de la ET-1 lesión del área de caja en A. (C) Análisis de la asimetría de la extremidad anterior en la prueba de cilindro después de una ET-1 lesión isquémica a la sensoriomotor extremidad anterior muestra déficits de comportamiento variables. Los datos se expresan como media ± SEM. Medios fueron analizados por medidas repetidas ANOVA de una vía que revelan un efecto principal significativo de tiempo (p = 0,015) y luego seguido por la prueba post hoc de Dunnett comparando todos los medios a los medios antes del tratamiento. (D) Análisis del comportamiento de la pata y arrastrando en la prueba del cilindro revela un déficit conductual extremidad anterior se sostiene hasta cuatro semanas después de una lesión isquémica inducida por ET-1. Medios fueron analizadas por dos vías de medidas repetidas ANOVA seguido de test de Bonferroni post hoc. (N = 10) * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52701/52701fig8large.jpg" target = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los puntos clave para establecer la hora de cuantificar el comportamiento de la pata y arrastrando en la prueba del cilindro son los siguientes: i) cuantificar el número de pata-arrastra frente toques totales pata de cada pata antes de la lesión cerebral para establecer una línea de base; ii) cuantificar el número de pata-drags frente toques totales pata de cada pata después de la lesión isquémica; y iii) discriminar entre una pata y arrastre y el movimiento lateral de la pata a lo largo de la pared del cilindro durante la rotación lateral del torso del ratón.
Paw-arrastre es un comportamiento novedoso que aparece después de una lesión en la corteza sensoriomotora extremidad anterior. La aparición del comportamiento de la pata-arrastrando por lo tanto se puede utilizar como un indicador positivo de que el córtex sensoriomotor extremidad anterior ha sido dañado. Los resultados representativos muestran que pequeñas ET-1 infartos aproximadamente 2-4 mm 3 en volumen y localizadas al resultado corteza sensoriomotora extremidad anterior en el comportamiento de la pata y arrastrando. Esto está en contraste con la extremidad anterior asymanálisis metría que no puede detectar déficits consistentes en el porcentaje de toques pata afectada en comparación con toques general siguiente ET-1 lesiones corticales isquémicos 4-6. Análisis del comportamiento de la pata-arrastrando, por lo tanto es más sensible en la detección de daños en la corteza sensoriomotora extremidad anterior. Además, debido a la pata-arrastre se mantuvo hasta cuatro semanas después de la lesión también puede ser adecuado para el análisis de recuperación de la función. Como ya hemos demostrado que el comportamiento de la pata-arrastrando correlaciona con el daño a la corteza sensoriomotora extremidad anterior 4, cualquier número de modelos de lesión puede beneficiar en tener este análisis de la prueba de cilindro. Aunque las grandes lesiones, como la oclusión de la arteria cerebral media y traumáticas cerebro lesión 7,8 muestran déficits en el análisis de la asimetría de la extremidad anterior de la clásica prueba de cilindro, estos déficits a menudo se resuelven con el tiempo. En estos casos, la pata-arrastrando, siendo una medida más sensible de daño a la corteza sensitivomotora extremidad anterior sería useful en la detección de los déficits crónicos, más sutiles. Del mismo modo en modelos de lesión que muestran resultados menos consistentes con el análisis de asimetría de la extremidad anterior clásica, el análisis de la pata-arrastrando sería útil en la detección de anomalías de comportamiento más consistentes. Paw-arrastrando el análisis de la prueba de cilindro tiene amplias aplicaciones para una variedad de modelos de lesión isquémica incluyendo la oclusión de la arteria cerebral media, photothrombosis, extracción pial y ET-1, como se ha demostrado aquí.
Hay una variedad de pruebas de comportamiento utilizados para analizar motor extremidad anterior y déficits sensoriales después de la lesión a la corteza sensoriomotora. La prueba Montoya escalera evalúa extremidad anterior alcanzar y agarrar comportamientos 9,10. Del mismo modo sola pastilla alcanzar y pruebas de alimentación de pasta analizar la actividad de la motricidad fina de las patas y dígitos 11,12. Análisis de asimetría extremidad anterior de la prueba del cilindro se asocia con el apoyo postural cuando el ratón está sobre sus extremidades posteriores 1. Sólo el númerode los contactos cada pata hace con se cuantifica la pared del cilindro. Cómo la pata hace contacto no es examinada y puede ser además indicativo de daño. Estudios anteriores han cuantificado la duración de la asistencia de cada toque pata y se encontró más déficit consistentes en ratones después del accidente cerebrovascular photothrombotic 13,14. Nuestros resultados muestran que la pata-arrastrando en el cilindro aparece después de una lesión de la corteza sensoriomotora extremidad anterior y puede ser relacionado con una disminución de la capacidad para soportar su peso con la pata afectada y / o debido a una pérdida de recepción sensorial en la pata. Se observa la pata para hacer contacto con la pared, pero no parece mantener una postura de apoyo o ayudar a empujar fuera de la pared, sino que se desliza en lo que llamamos una pata y arrastre. Hemos observado que el comportamiento de la pata-arrastrando se produce en casi todos los animales con una lesión en la corteza sensoriomotora extremidad anterior y consiste en un patrón muy singular de comportamiento, lo que es bastante fuerte en la predicción de lesión cortical en su propio rvuelo. En este sentido, de la pata-arrastre es una herramienta útil en una batería de análisis de comportamiento. Es la combinación de un bajo coste de puesta en marcha, la facilidad de administración de la prueba, y la fiabilidad del análisis de la pata-arrastre que hace el análisis de la pata-arrastre de la prueba del cilindro una opción tan atractiva en la predicción de la lesión isquémica focal en el ratón .
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Disclosures
Los autores no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Agradecemos al Sr. John Crowell y el Sr. Terry Upshall por su experiencia técnica y asistencia con la fotografía y videografía. Esta labor fue apoyada por las subvenciones de funcionamiento a JLV de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud y la Corporación de Investigación y Desarrollo de Terranova y un Corazón y fundación del movimiento de Canadá Asociación Canadiense para la concesión de Recuperación Stroke Catalyst. RBR era un receptor de un Keith Griffiths Memorial del corazón y derrame Fundación de Becas de Posgrado.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plexi-glass cylinder | 17.5 cm high, 9.5 cm outer diameter, 8.8 cm inner diameter, wall thickness 0.35 cm (or 3.5 mm) | ||
| viewing table | 54x56x66.5 cm (width x length x height), top of table is a 51x51 cm sheet of plexiglass. | ||
| mirror | 34x58 cm mirror | ||
| video camera | Sony | DCR-SR42 | Video camera with onboard storage, SD functionality, 40x optical zoom |
| computer | Dell | Optiplex 760 | Processor: Intel, 3.0 GHz, Memory 4.00GB (RAM) |
| computer monitor | Samsung | S22C350H | |
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| VLC Media Player | Video LAN | v2.1.2 | Media player with playback speed modulation and video support |
| External Hard Drive | Western Digital | WDBAAU0020HBK-01 | 2 TB |
References
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