Summary
Klassisk frambens asymmetri analys av cylinder testet rutinmässigt används för att bedöma beteendestörningar hos råttor efter hjärnskada eller stroke; men misslyckas att upptäcka konsekvent underskott i möss. Denna studie visar att kvantifiera tass-släp beteende är en känsligare analys av hjärnskada hos möss.
Abstract
Cylindern testet rutinmässigt används för att förutsäga fokal ischemisk skada forelimb motor cortex hos gnagare. När den placeras i cylindern, gnagare utforska med uppfödning och vidrör väggarna i cylindern med sina forelimb tassar för postural stöd. Efter ischemisk skada forelimb sensorimotor cortex, råttor förlita sig mer tungt på deras opåverkade forelimb tass för postural stöd resulterar i färre handen med sin påverkade tassen som kallas frambens asymmetri. Däremot fokal ischemisk skada i mushjärna inte resultera i jämförbara konsekvent underskott i forelimb asymmetri. Medan frambens asymmetri underskott sällan observeras, inte möss visar en ny beteende efter stroke kallas "tass-släp". Paw-släp är tendensen för en mus för att dra sitt påverkade tassen längs cylinderväggen snarare än direkt skjuta ifrån från väggen när demontering från en bakre till en fyrbent hållning. Vi har tidigare visat atttass-dra beteende är mycket känslig för små kortikala ischemiska skador på forelimb motoriska cortex. Här ger vi ett detaljerat protokoll för tass-dra analys. Vi definierar vad en tass-dra är och visa hur man kvantifiera tass-dra beteende. Cylindern testet är ett enkelt och billigt test för att administrera och inte kräver förberedande utbildning eller livsmedels utsatthet strategier. Vid användning av tass-dra analys med cylinderprovningen, fyller en nisch för att förutsäga kortikala ischemiska skador såsom photothrombosis och endotelin-1 (ET-1) inducerad ischemi - två modeller som ständigt ökar i popularitet och producerar mindre brännskador än arteria cerebri media ocklusion. Slutligen kommer mäta tass-dra beteende i cylindertestet tillåta studier av funktionell återhämtning efter kortikal skada med en bred kohort av transgena musstammar där tidigare frambens asymmetri analys har misslyckats med att upptäcka konsekvent underskott.
Introduction
Målet med neurala föryngringsstrategier är att visa både vävnad reparera och funktionell återhämtning. Funktionell återhämtning typiskt utvärderas med beteendetester som mäter funktionella brister, i detta fall med motorik som är förknippade med skador på specifika delar av hjärnan. Traumatisk hjärnskada eller ischemisk skada på sensorimotor forelimb området av hjärnbarken kan påvisas genom ett antal beteendetester. Ett sådant test är cylinder testet används flitigt i råttor för att bedöma funktionella brister i frambensaktivitet 1. Testet har en låg set-up kostnad som endast kräver en cylinder, kamera och bord med en transparent topp. Det är lätt att administrera eftersom den är baserad på den naturliga undersökande beteende hos gnagare, så pre-utbildning och brist på mat eller belöningar behövs inte. Trots dessa många fördelar, är cylindertestet underutnyttjade att bedöma forelimb underskott i möss efter brännskador till forelimb sensorimotor cortex, som vi tillskriver den analys av mus beteende i cylindertest. Forelimb asymmetri är den klassiska måttet på analys för cylindertest. När den placeras i cylindern, gnagare utforska naturligtvis väggarna i cylindern genom uppfödning på sina bakben och vidrör cylinderväggarna med sina forelimb tassar för postural balans. Antalet tass handen med väggen med varje forelimb lätt kvantifieras genom att filma gnagare under denna utforskning av cylindern. Forelimb asymmetri uppstår när påverkade frambens tassen gör färre handen med väggen än den opåverkade frambens tassen och är en indikation på skador på det kontra sensorimotorisk kortex. Hos råttor, intra-kortikala injektioner av kärlsammandragande medel, Endotelin (ET-1), i forelimb sensorimotor cortex orsakar en fokal ischemisk skada, vilket resulterar i beteendestörningar i den kontralaterala forelimb. Brister i kontra forelimb användning lätt detekteras som förändringar i forelimb asymmetri i cylinder-testet på råttor 1-3. I motsats till råttor dock förändringar i forelimb asymmetri är rörlig och mindre konsekventa i möss efter jämförbara ET-1 injektioner 4-6. Här visar vi en ny analys av forelimb beteende i cylindertestet - analys av tass-dra beteende. Vi har tidigare visat att tass-drar analys är ett mer känsligt mått på skada på forelimb sensorimotor kortex i möss än den klassiska frambens asymmetri analys och därför kan tillämpas på en mängd olika fokala kortikala skademodeller.
Undersökning av hur framtassarna i kontakt med cylinderväggen efter ischemisk skada forelimb sensorimotor cortex avslöjade en ny beteende hos möss - tass-dra 4. En tass-dra inträffar när en mus står på bakbenen för att utforska cylinderväggen då drar dess påverkade (kontra lesional) tass längs cylinderväggen mot dess mittlinje eller nedåt väggen medandess opåverkade tassarna ger postural stöd mot väggen. Paw-laddar sällan förekommer i oskadade möss därför utseendet på en tass-dra är en positiv indikator för skador på forelimb sensorimotor cortex 4. Vi har tidigare kvantifierats tass-dra beteende hos möss efter ET-1 ischemisk skada forelimb sensorimotor cortex och har visat ihållande tass-dra beteende hos möss upp till två veckor efter stroke 4. Här visar vi att tass-dra beteende upprätthålls upp till fyra veckor efter stroke. Analys av tass-dra beteende ger en ny och känslig verktyg för att bedöma fokal ischemisk skada forelimb sensorimotor cortex hos möss. Dess billiga set-up, enkel administration och scoring gör detta till en enkel, men ändå användbart verktyg för att snabbt bedöma forelimb beteendestörningar hos möss.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik uttalande: Alla experiment har godkänts av Memorial University of Newfoundland Animal Care etikkommitté enligt riktlinjerna i den kanadensiska rådet om Animal Care.
1. Möss
- Använd vuxna möss. I denna studie var vuxna manliga FVBN möss (n = 10) mellan 2-4 månader användes. House möss på en 12:12 h omvänd ljus-mörker cykel och ge standard gnagarfoder och vatten efter behag.
2. Material som krävs för cylindern Test
- Skaffa ett bord med en transparent topp till filma cylindertestet. Måtten i tabellen är irrelevanta, toppen måste vara plexiglas eller glas, och det måste finnas tillräckligt med utrymme att placera en spegel under bordet. Detta gör det möjligt för musen att spelas in underifrån. Använda en spegel under tabellen för att reflektera bilden genom cylindern. Som ett alternativ, använda en upp-och-ned kameran om det finns. Måtten i tabellen som används i detta protokoll är 54 x 56 x 66.5cm (BxLxH) med en 51 x 51cm topp (BxL).
- Skaffa en spegel. Måtten på spegeln som används i detta protokoll är 34 x 58cm (BxL).
- Skaffa en transparent / plexiglascylinder för musen för att utföra i. Måtten på cylindern som används i detta protokoll är 17.5cm hög, 8,8 cm ID, 9,5 cm OD med en väggtjocklek av 0.35cm. En högre cylinder kan krävas för mer aktiva musstammar.
- Placera cylindern på bordsskivan och filma reflektion i spegeln nedan.
- En videokamera och stativ krävs. Videoinspelning på cirka 650Kb / s, vilket ungefär är 190Mb per 5 min av cylinder video. Se till att kameran har en zoom funktion för att se till att cylindern omfattar hela synfältet.
OBS: videokamera som används i detta protokoll är en Sony DCR-SR42, 40x optisk zoom, 2,000x digital zoom, 680kpix som använder standardupplösning, NTSC interlaced video). - Skaffa mjukvara för analys - en media player med stöd för video och uppspelningshastighet modulering. Mediaspelaren som används i detta protokoll är VLC Media Player v2.1.2.
- Skaffa en dator med ett operativsystem som kan köra mediaspelare och en bildskärm.
- Elektronisk lagring videor krävs. Ladda ner filmer till en extern hårddisk eller kopiera det på DVD-skivor för långtidslagring.
OBS: På 190Mb per video, kommer 84 sessioner plats på en 16 GB SD-kort och 168 sessioner får plats på ett 32GB SD-kort. På grund av den relativa inexpensiveness av SD-media, och osäkerheten i hur mycket tid en del möss kräver att slutföra 20 föder, är en 32 GB-kort rekommenderas. I den aktuella studien har videor kopieras från kameran till en 2TB extern hårddisk och sedan kopieras på DVD-skivor som backup.
3. experimentuppställning av Cylinder Test
- Fäst spegel under tabellen vid en 45 graders vinkel mot bordsskivan. Gör detta med hjälp av två stödkonsoler kopplade till bordsbenen för att support toppen och botten av spegeln, respektive. Bracket platser noteras i en sidovy av bordet (Figur 1A) och ett rakt framifrån av bordet (Figur 1B).
- Placera cylindern på mitten av bordet. Rita fyra ekvidistanta linjer där cylindern sitter på bordet med en svart markering (Sharpie) så att cylindern kan lyftas och återvände till samma position (Figur 2). Ritning dem på undersidan av den transparenta bords tillåter bordsskivan som skall rengöras mellan djurförsök utan upplösning av markörfärg.
- Fäst kamera och stativ. Rikta kameran mot spegeln så att bilden ser direkt genom pipan av cylindern. Se till att hela innerväggen hos cylindern är synlig och obehindrat genom basen (fig 3). Se en sida-om vy av installationen, inklusive den relativa vinkeln av kameran och spegel setup, ovanifrån (fig 4A) och frånnivå av bordet, innefattande en mus odling (figur 4B).
- Förbered cue kort för att identifiera varje mus före inspelningen. Se till att korten innefattar typiskt ett identifieringsnummer för varje mus, tidspunkten av testet (t.ex.., 3 dagar efter behandling) och datum för inspelningen sessionen. Ta inte med behandlingsgruppen på cue kort för att säkerställa att försöksledaren är förblindad.
- Film i standard inomhus ljusförhållanden som denna nivå av ljus erfordras för att tydligt se musrörelser runt cylindern.
OBS: Om det finns filma i mörker med ett rött ljus kamera kan räcka, men man skulle behöva först att testa om tass handen och drar syns tydligt för kvantifiering.
4. Utförande
- Börja filma. Visa lämpligt musen cue kort framför kameralinsen.
- Sänk musen in i cylindern från den öppna toppen omedelbart efter inspelningen kön kortet.
- Börja filma musen. Minimera buller under denna tid, som möss kan förlora intresset för att utforska om häpen.
- Observera möss bakåt för att utforska cylindern. Fånga video tills musen utför minst tjugo föder.
OBS: En bakre inträffar när båda framtassarna förlorar kontakten med golvet och musen står på bakbenen. - Torka bord och cylinder med en lämplig rengöringslösning mellan varje musen för att sanera och ta bort mus dofter.
- Frysning är när möss sluta utforska och förblir lugnt sitta på alla fyra i ungefär 5 minuter. Om möss frysa innan tjugo föder inträffar, kan det vara nödvändigt att ta bort dem från cylindern för 10-20 minuter innan du fortsätter testet. Om möss inte utför tjugo föder, tas de bort från studien.
OBS: Enligt vår erfarenhet, möss har aldrig behövde uteslutas på grund av underlåtenhet att utforska cylindern.
5. Utvärdering av Cylinder Test med hjälp av Paw-draAnalys
- Spela upp video med en hastighet av mellan 0,25 x och 0.67x regelbundna hastighet beroende på hur snabbt musen utforskar cylindern. Använd en mediaspelare som erbjuder långsammare uppspelningshastighet.
- Kvantifiera det totala antalet tass handen. Tass handen inträffar när musen uppresningar (figur 5A), berör den sida av cylindern (figur 5B), därefter lämnar farkosten med båda tassarna samtidigt (figur 5C) och landar (figur 5D). Tassen kan eller inte kan kontakta cylinderväggen med en full palm, men viss kontakt med cylinderväggen måste förekomma. Bedöm paw handen genom att räkna antalet gånger som musen kommer i kontakt (oavsett hur kort) med cylinderväggen med endera eller båda framtassama stående på sina bakbenen under en bakre.
Observera att kontakt med cylinderväggen är endast räknas som en "tass touch" eller "tass-drag" om musen är i ett bakre läge - ståendepå sina bakben med båda framtassarna utanför av bordsskivan. Om musen fortfarande i en 3-punkts hållning - både bakbenen och en framtassarna på bordet och fortsätter att röra väggen med fri tass - detta inte räknas som en tass touch. Möss kan bak och tryck på cylinderväggen med en enda framtassarna och detta räknas som en tass touch. Obs: en mus kan också flytta sin kropp runt cylindern under ett bakre, vilket gör fler än två kontakter. Dessa kontakter är stämde - en för varje vänster framtassarna touch och en för varje rätt framtassarna touch. - Kvantifiera antalet tass-laggar. Tafsa-dra beteende skiljer sig från normala tass handen.
- Om tassen i kontakt med cylinderväggen med en full öppen handflata (Figur 6B), kommer det långsamt att falla bort från väggen, ofta med en liten darrning. Rörelsen börjar med siffrorna dra mot cylinderväggen antingen i en medial eller nedåtgående riktning (figur 6C) innan den föll bort completely (figur 6D). Musen kommer sedan demontera med sin opåverkad tass (figur 6E) före landning på alla fyra (Figur 6F). Detta anses vara en tass-dra och bör räknas i en sammanställning.
- Om tassen inte kommer i kontakt med cylinderväggen med en helt öppen handflata, kommer det betar cylinderväggen med dess siffror innan den faller bort från cylinderväggen. På liknande sätt kan en mus dra sin tass mot cylinderväggen, men inte släppa det helt innan du kliver av. Dessa anses båda vara tass-drar samt detaljer och bör räknas som både i en sammanställning.
- Tassen kan också dra längs cylinderväggen när en mus utforskar cylindern. I detta fall kommer tassen följa vridning av musens torso eftersom det undersöker vänster eller höger om ursprungsläget (Figur 7A-D) innan demontering (figur 7E). Detta anses inte vara en tass-drag, eftersom det beror på musen slumpmässigt väljaen riktning för att utforska och är inte beroende av vilken kortikal halvklotet skadades.
- Paw-laggar uttrycks som en procentandel av tass-drar per totalt antal tass handen under en session. Uttryck antalet tass-laggar i procent av det totala antalet tass kontakter för varje forelimb separat.
- Touches resulterar i en tass-dra räknas som en tass-dra och en touch samtidigt. Om sålunda en mus drar sin tass varje gång dess tass i kontakt med cylinderväggen, är tassen-dra procentandel uttryckt som 100%.
6. Ytterligare Experimental Design Förslag
- För att minimera yttre variabler:
- Testa möss samtidigt på varje testning dag. Testa mössen under sin vakna cykel. Att hålla möss på en 12 timmar omvänd ljuscykel underlättar prestanda.
- Möss kan vara ovilliga att utforska cylindern om stressade antingen genom buller eller en ny miljö. Testa möss i deras djurhåll rum eller ett rum som de har been förtrogen med minskar stress. Detta kan inträffa om rummet är bullriga, om musen har trängda före in i cylindern eller på grund av tillvänjning.
OBS: Testning bör utföras en gång innan experimentell manipulation för att tjäna som en baslinje läsning. Efter manipulation, testdagar är på försöksgottfinnande, även om det är klokt att undvika ett alltför stort antal exponeringar mot cylindern under en kort tidsperiod. - Möss kan bli ovilliga att bakåt efter 6-7 exponeringar mot cylindern. För den aktuella studie gavs möss testades i cylindern för totalt sju gånger, före ischemi och på dagarna 1, 3, 7, 14, 21 och 28 efter operation.
OBS: I denna studie använde vi FVBN musstammen. Vi har tidigare testat C57Bl / 6 möss i cylindern och observerade tass-dra beteende efter en ET-1 ischemisk skada (data visas ej). C57BL / 6-möss var mer aktiva än FVBN möss när uppfödning och ofta hoppade på kanten på cylinderninnan klättra ut. Taller cylindrar ska användas om möss försöker fly genom att hoppa.
7. Endotelin-1 Kirurgi och infarktvolymen Mätningar
- Utför Endotelin-1 kirurgi och mätningar infarktvolymen enligt tidigare publicerade protokoll 4. Om du vill rikta den främre frambens motoriska cortex, bör varje mus få tre ET-1 injektioner på följande koordinater: (i) +0,7 anteriorposterior (AP) /1.5 medial-lateral (ml) / - 1,2 dorsal-ventrala (DV), ( ii) +0,4 AP / 1,25 ml / - 1,2 DV och (iii) +0,1 AP / 1,75 ml / -1,2 DV 4.
8. Statistisk analys
- En två-vägs upprepade mätningar variansanalys (ANOVA) rekommenderas för att analysera procent av tass-dra för de drabbade och ej drabbade tassar mellan olika tidpunkter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har tidigare visat att tass-dra beteende visas efter en fokal ischemisk skada forelimb sensorimotor cortex och är en positiv indikator på skada 4. Intra-kortikala injektioner av ET-1 i forelimb sensorimotor cortex användes för att framkalla en ischemisk skada (Figur 8A, B). Denna studie undersökte huruvida tass-dra beteende förlängas längre än 14 dagar efter skada för dess potentiella användning för att bedöma funktionell återhämtning. Möss testades i cylinder test på dag före ET-1 injektioner för den innan operation tidpunkt, och på dagarna 1, 3, 7, 14, 21 och 28 efter skada. Vid varje tidpunkt, räknades antalet tass handen och paw laggar kvantifieras för både den påverkade och opåverkade tassen. Två vägs upprepade mätningar ANOVA om antalet tass handen visade signifikanta viktigaste effekterna av tid [F (6108) = 3,59, p = 0,0028] och ämnen [F (18.108) = 2,38, p = 0,0032] men ingen effekt av behandling(Tabell 1). För att använda standard analys av forelimb asymmetri för cylinder test som kvantifierar drabbade tass handen kontra totala tass handen visade inkonsekvent forelimb beteendestörningar. En enkel upprepade mätningar ANOVA för procentandelen påverkade tassen användning visade en signifikant huvudeffekt av tid (p = 0,015) som följt av Dunnetts post hoc test visade betydande minskningar i procent påverkade tassen användning vid 7, 14 och 21 dagar efter -surgery och utvanns genom 28 dagar efter kirurgi (Figur 8C). Däremot en tvåvägs upprepad mätningar ANOVA om antalet tass laddar visade signifikanta viktigaste effekterna av tid [F (6108) = 7,09, p <0,0001], behandling [F (1,108) = 33.02, P <0,0001], interaktion [ F (6108) = 9,89, p <0,0001] och ämnen [F (18.108) = 4,84, p <0,0001]. Ytterligare Bonferroni post hoc-analys visade signifikanta ökningar i antalet tass släpar vid varje tidpunkt efter kirurgi (tabell 1). På samma sätt, en tvåvägs upprepad mätningar ANOVA jämför antalet påverkade tassen-drar kontra totala drabbade tass handen visade signifikanta viktigaste effekterna av tid [F (6108) = 6,63, p <0,0001], behandling [F (1,108) = 20,46, p = 0,0003], interaktion [F (6108) = 8,21, p <0,0001] och ämnen (matchning) [F (18.108) = 7,35, p <0,0001]. Ytterligare Bonferroni post hoc-analys visade signifikant tass-dra beteende upp till 28 dagar efter operation (Figur 8D). Tassen-dra beteende var specifika för den drabbade extremiteten som ingen ökning eller förändring av tass-släpobserverades med opåverkade lemmen. Tass-dra beteende med den påverkade tassarna var markant förhöjt vid en, 3, 7, 21 och 28 dagar efter operation (fig 8D). Tass-dra beteende nådde en topp på en dag efter operationen med> 30% av alla tass berör med den påverkade forelimb vilket resulterar i en tass-dra därefter sjönk till ~ 15% vid 3 dagar efter operation, där antalet var upp till och med 28 dagar efter operationen. Vid 28 dagar efter operationen, möss avlivades och infarktvolymer bedömas. Den genomsnittliga infarktvolymen för gruppen var 3,2 ± 0,4 pm 3 (n = 10 möss). Dessa resultat visar att små kortikala infarkter kan leda till betydande och ihållande beteendestörningar mätt i cylindertestet. Sammanfattningsvis visar dessa data att det inte bara är tass-dra mycket mottaglig för skador på forelimb sensorimotor cortex, men att tass-släpkvarstår också över tiden och kan användas för att bedöma funktionell återhämtning.
Figur 1. Konsol platser att fästa spegeln på plats under bordet. (A) Framifrån tabell konsol platser på frambenen i tabellen. (A) högre förstoring av infällda i A visar var fästena på frambenen. (B) Bakifrån av tabellen showing bakre benet Fästets platser. (B) Högre förstoring av infällda i B anger fäste plats på bakbenen i tabellen.
Figur 2. Märkning platsen för cylinderplacering på bordet. Foto av bords anger placeringen av cylinder med svarta linjer dragna runt omkretsen av basen. Pilarna pekar på de svarta linjer dragna på undersidan av de plexiglas används för centrering av cylindern på bordsskivan.
Figur 3. Framifrån av kamera och bords set-up. Foto av bords visar siktlinjen direkt genom cylinderröret (röd pil).
tunn-page = "always"> 
Figur 4. En sidovy av kameran och bordet installation. Kameran är riktad direkt vid basen av cylindern. (A) Tabell och kamerainställningar tas från ovan. (B) Bord och kamerainställningar tas på samma nivå som i tabellen, visar en mus uppfödning i cylindern.
Figur 5. En sekvens av bilder som visar en oskadad mus uppfödning. (A) Foto av en mus innan en bakre. (B) Musen vidrör cylinderväggen med båda tassarna. (C) För att demontera, kommer musen trycka mot cylinderväggen med hjälp av båda tassarna, och (D) mark på alla fyra tassar. Lt = musens vänstra tass, Rt = mus högra tass.
Figur 6. En sekvens av bilder som visar en skadad mus tass-dra. (A) Bild av en mus innan en bakre. (B) Musen kommer att beröra cylinderväggen med båda tassar; (C) sedan långsamt låta siffrorna på påverkade tassen dra vertikalt ner cylinderväggen; (D) innan låta tassen falla bort från väggen. (E) Musen kommer sedan demontera med sin opåverkad tass och (F) landar på alla fyra tassar. Hög förstoring infällningar i B, C och D visar hur de påverkade framtassarna i kontakt med cylinderväggen. Lt = musens vänstra tass.
Figur 7. En icke tass-drag ". (A) Musen vidrör cylinderväggen med båda tassarna. (B) Musen vrider sin överkropp i sidled för att utforska cylinderväggen. (C) Musen åter positioner sin ledande framtassarna till en ny position i sidled och drar sitt bakre tass i samma riktning. (D) Den bakre tassen är planterad ordentligt på sin nya plats, och båda tassarna används för att demontera (E) för att återgå till alla fyra tassar. Röda pilspetsar visar platsen för tassar på start- och slutpositioner. Röd pil indikerar rörelse bakom framtassarna längs cylinderväggen.
Figur 8. Paw-dra beteende upprätthålls under 4 veckor efter en samlingspunkt kortikal, ischemisk skada. (A) representant ph otomicrograph av en kresylviolett-färgade koronalt hjärnsnitt genom en ET-1 ischemisk skada vid 28 dagar efter kirurgi. (B) Högre förstoring av ET-1 lesionen av inramade området i A. (C) Analys av forelimb asymmetri i cylindertestet efter en ET-1 ischemisk skada forelimb sensorimotor visar rörliga beteendestörningar. Data uttrycks som medelvärde ± SEM. Medel analyserades med envägs upprepade mätningar ANOVA avslöjar en signifikant huvudeffekt av tid (p = 0,015) följt därefter av Dunnetts post hoc test som jämförde alla medel till medel före behandling. (D) Analys av tass-dra beteende i cylinder testet avslöjar en forelimb beteende underskott upprätthålls upp till fyra veckor efter en ET-1-inducerad ischemisk skada. Medel analyserades med tvåvägs upprepade mätningar ANOVA följt av Bonferroni posthoc test. (N = 10) * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52701/52701fig8large.jpg" target = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De viktigaste punkterna för att fastställa när kvantifiera tass-dra beteende i cylinder testet är följande: i) kvantifiera antalet tass-drar kontra totala tass handen för varje tass före hjärnskada att etablera en baslinje; ii) kvantifiera antalet tass-laggar kontra totala tass handen för varje tass efter ischemisk skada; och iii) skilja mellan en tass-dra och den laterala rörelsen hos tassen längs cylinderväggen under sidovridning av musen torso.
Paw-släp är en ny beteende som visas efter skada till forelimb sensorimotor cortex. Uppträdandet av tass-dra beteende kan därför användas som en positiv indikator på att forelimb sensorimotor cortex har skadats. De representativa resultat visar att små ET-1 infarkter cirka 2-4 mm 3 i volym och lokaliserade till forelimb sensorimotor cortex resultat i tass-dra beteende. Detta står i kontrast till forelimb asymMetry analys som underlåter att upptäcka konsekvent underskott i procent av drabbade tass handen kontra totala handen efter ET-1 ischemiska kortikala skador 4-6. Analys av tass-dra beteende är därför mer känslig för att upptäcka skador på forelimb sensorimotor cortex. Vidare, eftersom tass-släpn bibehölls upp till fyra veckor efter skada kan det även vara lämpligt för analys av återhämtning av funktion. Som vi tidigare har visat att tass-dra beteende korrelerar med skador på forelimb sensorimotor cortex 4, kan valfritt antal skademodeller nytta i att ha denna analys av cylindertestet. Även om stora skador, såsom mitten cerebral artärocklusion och traumatisk hjärnskada 7,8 visar underskott på klassiska frambens asymmetri analys av cylinder testet, dessa underskott löser ofta över tiden. I dessa fall tass-drar, som är en mer känsligt mått på skada på forelimb sensorimotor kortex vore useful för att upptäcka kroniska, mer subtila underskott. Likaså i skademodeller som visar mindre konsekventa resultat med den klassiska frambens asymmetri analys skulle tass-dra analys vara användbar för att upptäcka mer konsekventa beteendestörningar. Tafsa-dra analys av cylindertestet har breda applikationer för olika ischemiska skademodeller, inklusive mitten cerebral artärocklusion, photothrombosis, pial stripp och ET-1, vilket visas här.
Det finns en mängd olika beteendetester används för att analysera framben motoriska och sensoriska underskott efter skada till sensorimotor cortex. Den Montoya trappa testet bedömer framben nå och greppa beteenden 9,10. Likaså enda pellet gående och pasta äta tester analyserar finmotorik aktivitet tassarna och siffror 11,12. Frambens asymmetri analys av cylindertestet är förknippad med postural stöd när musen är upp på sina bakbenen 1. Endast det antalkontakter varje tass bildar med cylinderväggen kvantifieras. Hur tassen i kontakt inte undersökts och kan vidare indikativ för skador. Tidigare studier har kvantifierat hur länge stöd för varje tassarna touch och fann mer konsekvent underskott i möss efter photothrombotic stroke 13,14. Våra resultat visar att tass-dra i cylindern visas efter skada till forelimb sensorimotor cortex och kan vara relaterad till en minskad förmåga att stödja sin vikt med den påverkade tassen och / eller på grund av en förlust av sensorisk mottagning i tassen. Tassen observeras att få kontakt med väggen, men verkar inte ha en stödjande hållning eller hjälpa till att driva bort från väggen, utan glider av i vad vi kallar en tass-dra. Vi har observerat att tass-dra inträffar i nästan varje djur med en skada på forelimb sensorimotor cortex och innebär en mycket unik beteendemönster, vilket gör det ganska stark i att förutsäga kortikal skada i sin egen right. I denna mening är tass-släp ett användbart verktyg i ett batteri av beteendeanalyser. Det är kombinationen av en låg startkostnad, enkel administrering av testet, och tillförlitligheten av tassen-dra analys som gör tass-dra analys av cylindertestet sådan ett attraktivt val i att förutsäga fokal ischemisk skada i mus .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi tackar John Crowell och Mr Terry Upshall för sin tekniska expertis och hjälp med fotografering och filmning. Detta arbete stöddes av verksamhetsbidrag till JLV från den kanadensiska Institutes of Health Research och forskning och utveckling AB i Newfoundland och en hjärta & Stroke Foundation of Canada Canadian Partnerskap för stroke Recovery Catalyst bidrag. RBR var mottagare av en Keith Griffiths Memorial hjärta & Stroke Foundation Graduate Scholarship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plexi-glass cylinder | 17.5 cm high, 9.5 cm outer diameter, 8.8 cm inner diameter, wall thickness 0.35 cm (or 3.5 mm) | ||
| viewing table | 54x56x66.5 cm (width x length x height), top of table is a 51x51 cm sheet of plexiglass. | ||
| mirror | 34x58 cm mirror | ||
| video camera | Sony | DCR-SR42 | Video camera with onboard storage, SD functionality, 40x optical zoom |
| computer | Dell | Optiplex 760 | Processor: Intel, 3.0 GHz, Memory 4.00GB (RAM) |
| computer monitor | Samsung | S22C350H | |
| Excel (Microsoft Office Professional Plus) | Microsoft | v14.0.7106.5003 | |
| VLC Media Player | Video LAN | v2.1.2 | Media player with playback speed modulation and video support |
| External Hard Drive | Western Digital | WDBAAU0020HBK-01 | 2 TB |
References
- Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).
- Kolb, B., et al. Growth factor-stimulated generation of new cortical tissue and functional recovery after stroke damage to the motor cortex of rats. J Cereb Blood Flow Metab. 27 (5), 983-997 (2007).
- Windle, V., et al. An analysis of four different methods of producing focal cerebral ischemia with endothelin-1 in the rat. Exp Neurol. 201 (2), 324-334 (2006).
- Roome, R. B., et al. A reproducible Endothelin-1 model of forelimb motor cortex stroke in the mouse. J Neurosci Methods. 233, 34-44 (2014).
- Tennant, K. A., Jones, T. A. Sensorimotor behavioral effects of endothelin-1 induced small cortical infarcts in C57BL/6 mice. J Neurosci Methods. 181 (1), 18-26 (2009).
- Wang, Y., Jin, K., Greenberg, D. A. Neurogenesis associated with endothelin-induced cortical infarction in the mouse. Brain Res. 1167, 118-122 (2007).
- Baskin, Y. K., Dietrich, W. D., Green, E. J. Two effective behavioral tasks for evaluating sensorimotor dysfunction following traumatic brain injury in mice. J Neurosci Methods. 129 (1), 87-93 (2003).
- Li, X., et al. Chronic behavioral testing after focal ischemia in the mouse: functional recovery and the effects of gender. Exp Neurol. 187 (1), 94-104 (2004).
- Clarke, J., Ploughman, M., Corbett, D. A qualitative and quantitative analysis of skilled forelimb reaching impairment following intracerebral hemorrhage in rats. Brain Res. , 204-212 (2007).
- Montoya, C. P., Campbell-Hope, L. J., Pemberton, K. D., Dunnett, S. B. The 'staircase test': a measure of independent forelimb reaching and grasping abilities in rats. J Neurosci Methods. 36 (2-3), 219-228 (1991).
- Farr, T. D., Whishaw, I. Q. Quantitative and qualitative impairments in skilled reaching in the mouse (Mus musculus) after a focal motor cortex stroke. Stroke. 33 (7), 1869-1875 (2002).
- Tennant, K. A., et al. The vermicelli and capellini handling tests: simple quantitative measures of dexterous forepaw function in rats and mice. J Vis Exp. (41), (2010).
- Clarkson, A. N., et al. AMPA receptor-induced local brain-derived neurotrophic factor signaling mediates motor recovery after stroke. J Neurosci. 31 (10), 3766-3775 (2011).
- Clarkson, A. N., Huang, B. S., Macisaac, S. E., Mody, I., Carmichael, S. T. Reducing excessive GABA-mediated tonic inhibition promotes functional recovery after stroke. Nature. 468 (7321), 305-309 (2010).
