Summary
Klassisk forben asymmetri analyse af cylinderen test anvendes rutinemæssigt til at vurdere adfærdsmæssige mangler i rotter efter hjerneskade eller slagtilfælde; Men det mislykkes at opdage konsekvente underskud i mus. Denne undersøgelse viser, at kvantificering paw-trække adfærd er en mere følsom analyse af hjerneskade i mus.
Abstract
Cylinderen test anvendes rutinemæssigt til at forudsige fokal iskæmisk beskadigelse af forben motor cortex hos gnavere. Når de placeres i cylinderen, gnavere udforske ved opdræt og røre væggene i cylinderen med deres forben poter for postural støtte. Efter iskæmisk skade på forben sensomotoriske cortex, rotter stole mere tungt på deres upåvirket forben pote for postural støtte resulterer i færre rører med deres påvirkede pote, som kaldes forben asymmetri. I modsætning hertil fokal iskæmisk skade i musen hjernen ikke resultere i sammenlignelige konsistente underskud i forben asymmetri. Mens forben asymmetri underskud sjældent overholdes, behøver mus demonstrere en roman adfærd indlæg slagtilfælde betegnet "pote-trække". Paw-trække er tendensen til en mus til at trække sin påvirkede pote langs cylindervæggen stedet for direkte skubbe væk fra væggen, når afmontering fra en bageste til en firbenet holdning. Vi har tidligere påvist, atpaw-trække adfærd er meget følsom over for små kortikale iskæmiske skader på forben motor cortex. Her giver vi en detaljeret protokol for pote-trække analyse. Vi definerer, hvad en pote-træk er, og vise, hvordan man kan kvantificere pote-trække adfærd. Cylinderen test er en enkel og billig test til at administrere og kræver ikke forudgående uddannelse eller fødevarer afsavn strategier. Ved at bruge pote-trække analyse med cylinderen test, det fylder en niche til at forudsige kortikale iskæmiske skader såsom photothrombosis og Endothelin-1 (ET-1) induceret iskæmi - to modeller, der er stadigt stigende i popularitet og producere mindre fokale skader end mellem-cerebral arterieokklusion. Endelig vil måle pote-trække adfærd i cylinderen test tillader studier af funktionelle opsving efter kortikal skade ved hjælp af en bred gruppe af transgene musestammer hvor tidligere forben asymmetri analyse har undladt at registrere konsekvente underskud.
Introduction
Målet med neurale regenerering strategier er at demonstrere både væv reparation og funktionel genopretning. Funktionel opsving typisk evalueres med adfærdsmæssige tests, der måler funktionelle mangler, i dette tilfælde involverer motoriske færdigheder, der er forbundet med skader på de specifikke områder af hjernen. Traumatisk hjerneskade eller iskæmisk skade på sensomotoriske forben område af cortex kan påvises ved en række adfærdsmæssige tests. En sådan test er cylinderen test, der anvendes i udstrakt grad i rotter for at vurdere funktionelle mangler i forben aktivitet 1. Testen har en lav set-up omkostninger, der kun kræver en cylinder, kamera og bord med en gennemsigtig top. Det er let at administrere, da den er baseret på den naturlige udforskende adfærd gnavere, så pre-træning og mad afsavn eller belønninger er ikke påkrævet. På trods af disse mange fordele, er cylinderen test underudnyttet at vurdere forben underskud i mus efter fokale skader på forben sensorimotor cortex, som vi tilskriver analysen af museadfærd i cylinderen test. Forben asymmetri er den klassiske mål for analyse for cylinderen test. Når de anbringes i cylinderen, gnavere naturligt udforske væggene i cylinderen ved opdræt på deres bagben og rørende cylindervæggene med deres forben poter for postural balance. Antallet af pote hånd med væggen med hver forlem let kvantificeres ved at filme gnavere i denne udforskning af cylinderen. Forben asymmetri opstår, når den påvirkes forben pote gør færre berøringer med væggen end den upåvirkede forben pote og er indikativ for beskadigelse af kontralaterale sensorimotor cortex. Hos rotter, intra-kortikale injektioner af det vasokonstriktive middel, endothelin (ET-1), ind i forben sensomotoriske cortex forårsager en fokal iskæmisk læsion, som resulterer i adfærdsmæssige mangler i den kontralaterale forben. Underskud i kontralaterale forben brug let opdages som ændringer i forelimb asymmetri i cylinderen i rotter 1-3. I modsætning til rotter dog, ændringer i forben asymmetri er variable og mindre konsekvent i mus efter sammenlignelige ET-1 injektioner 4-6. Her demonstrerer vi en ny analyse af forben adfærd i cylinderen test - analyse af pote-trække adfærd. Vi har tidligere vist, at pote-trække analyse er et mere følsomt mål for beskadigelse af forben sensomotoriske cortex hos mus end de klassiske forben asymmetri analyse og derfor er anvendelig til en bred vifte af fokale corticale beskadigelsesmodeller.
Undersøgelse af, hvordan forpoteknogler kontakter cylindervæggen efter iskæmisk skade på forben sensomotoriske cortex afslørede en roman adfærd i mus - pote-trække 4. En pote modstand forekommer, når en mus står på sine bagbenene at udforske cylindervæggen derefter trækker sin afficerede (kontraindiceret læsional) paw langs cylindervæggen mod dens midterlinjen eller ned ad væggen, menssin upåvirket forepaw giver postural støtte mod væggen. Paw-slæber sjældent forekomme i ubeskadigede mus derfor udseende af en pote-træk er en positiv indikator for skade på forben sensomotoriske cortex 4. Vi har tidligere kvantificeret pote-trække adfærd i mus efter ET-1 iskæmisk skade på forben sensomotoriske cortex og har vist vedvarende pote-trække adfærd hos mus op til to uger efter slagtilfælde 4. Her viser vi, at pote-trække adfærd opretholdes op til fire uger efter slagtilfælde. Analyse af pote-trække adfærd tilvejebringer en hidtil ukendt og følsomt værktøj til vurdering af fokal iskæmisk skade på forben sensomotoriske cortex hos mus. Dens billig opsætning, nem administration og scoring gør dette til en enkel, men alligevel nyttigt redskab til hurtigt at vurdere forben adfærdsmæssige afvigelser i mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik erklæring: Alle forsøg blev godkendt af Memorial University of Newfoundland Animal Care etiske komité i henhold til retningslinjerne i den canadiske Rådet om Animal Care.
1. Mus
- Brug voksne mus. I denne undersøgelse blev voksne mandlige FVBN mus (n = 10) mellem 2-4 måneder anvendes. House mus på en 12:12 timers reverse lys-mørke-cyklus og give standard gnaverfoder og vand ad libitum.
2. Materialer Nødvendige for Cylinder Test
- Opnå en tabel med en gennemsigtig top til film cylinderen test. Dimensionerne af tabellen er irrelevante, toppen skal være plexiglas eller glas, og der skal være plads nok til at placere et spejl under tabellen. Dette giver mulighed for musen til at blive optaget på video nedefra. Bruge et spejl under tabellen for at afspejle billedet gennem cylinderen. Som et alternativ, kan du bruge en omvendt kamera, hvis tilgængelig. Dimensionerne i tabellen anvendes i denne protokol er 54 x 56 x 66.5cm (wxlxh) med en 51 x 51cm top (BxL).
- Anskaf et spejl. Dimensionerne af spejlet, der anvendes i denne protokol er 34 x 58cm (BxL).
- Anskaf en transparent / plexiglas cylinder for musen til at udføre i. Dimensionerne af cylinderen, der anvendes i denne protokol er 17.5cm høj, 8,8 cm ID, 9.5cm OD med en vægtykkelse på 0.35cm. Kan kræves en højere cylinder til mus mere aktive stammer.
- Placer cylinderen på bordpladen og filme refleksion i spejlet nedenfor.
- Et videokamera og stativ er påkrævet. Videooptagelse på ca. 650Kb / s, hvilket er ca. 190Mb per 5 min af cylinder video. Sikre, at kameraet har en zoom funktionalitet til at sikre, at cylinderen omfatter hele synsfeltet.
BEMÆRK: videokamera anvendt i denne protokol er et Sony DCR-SR42, 40x optisk zoom, 2,000x digital zoom, 680kpix som bruger standard definition NTSC interlaced video). - Opnå software til analyse - et medie plAyer med video støtte og afspilningshastighed modulation. Medieafspilleren anvendes i denne protokol er VLC Media Player v2.1.2.
- Anskaf en computer med et operativsystem kan køre medieafspilleren og en skærm.
- Elektronisk lagring videoer er påkrævet. Downloade videoer til en ekstern harddisk eller kopiere det over på dvd'er til langtidsopbevaring.
BEMÆRK: Ved 190Mb per video, vil 84 sessioner passe på en 16 GB SD-kort og 168 sessioner vil være på en 32 GB SD-kort. På grund af den relative billighed SD medier, og usikkerheden i, hvor meget tid nogle mus kræver at fuldføre 20 stejler, anbefales en 32 GB-kort. I den aktuelle undersøgelse blev videoerne kopieres fra kameraet til en 2TB ekstern harddisk og derefter recopied på dvd'er som backup.
3. Eksperimentel opsætning af Cylinder Test
- Fastgør spejl under tabellen i en 45 graders vinkel til bordpladen. Gøre dette ved hjælp to støttebeslag knyttet til bordben til support toppen og bunden af spejlet hhv. Bracket placeringer er angivet i en side-visning af tabellen (figur 1A) og en flade på visning af tabellen (figur 1B).
- Placer cylinder på midten af bordet. Tegne fire ækvidistante linjer, hvor cylinderen sidder på bordet med en sort markør (Sharpie), således at cylinderen kan løftes og returneres til den samme position (figur 2). Tegne dem på undersiden af den gennemsigtige bordplade tillader bordpladen skal renses mellem dyreforsøg uden at opløse markør blæk.
- Monter kameraet og stativ. Ret kameraet mod spejlet, så billedet ser direkte gennem tønde af cylinderen. Sikre, at hele indvendige væg af cylinderen er synlig og uhindret af basen (figur 3). Se en side på visning setup, herunder den relative vinkel af kameraet og spejlet setup, ovenfra (figur 4A) og franiveau af bordet, herunder en mus opdræt (figur 4B).
- Forbered cue cards til at identificere hver mus før optagelserne. Sørg for, at kortene omfatter typisk et identifikationsnummer for hver mus, den tid-point af testen (f.eks., 3 dage efter behandling) og datoen for optagelserne session. Medtag ikke behandlingsgruppen på cue-kort til at sikre, at forsøgslederen er blindet.
- Film i standard indendørs lysforhold som dette niveau af lys er nødvendig for at tydeligt se musebevægelser omkring cylinderen.
BEMÆRK: Hvis det er tilgængeligt filme i mørke med et rødt lys kamera kan være tilstrækkeligt, dog vil man først at teste, om pote rører og drags er klart synlige for kvantificering.
4. Udførelse
- Begynd optagelserne. Vise den passende mus cue card foran kameralinsen.
- Sænk musen ind i cylinderen fra den åbne top umiddelbart efter optagelserne cue-kortet.
- Begynd filme musen. Minimere støj i løbet af denne tid, da mus kan miste interesse i at udforske, hvis forskrækkede.
- Overhold musene bag at udforske cylinderen. Capture video indtil musen udfører mindst tyve stejler.
BEMÆRK: En bageste opstår, når begge forpoterne mister kontakt med gulvet og musen står på bagbenene. - Tør bordplade og cylinder med en passende rengøring løsning mellem hver mus til at rense og fjerne musen dufte.
- Nedfrysning er, når mus stoppe udforske og forbliver roligt sidde på alle fire i ca 5 min. Hvis mus fryse før tyve stejler opstår, kan det være nødvendigt at fjerne dem fra cylinder til 10-20 min inden de genoptager testen. Hvis mus ikke udfører tyve stejler, bliver de fjernet fra undersøgelsen.
BEMÆRK: Det er vores erfaring, mus har aldrig behøvet at være udelukket på grund af manglende udforske cylinderen.
5. Evaluering af Cylinder Test hjælp Paw-TrækkeAnalyse
- Afspil videoen med en hastighed på mellem 0,25x og 0.67x regelmæssig hastighed afhængigt af hvor hurtigt musen udforsker cylinderen. Brug en medieafspiller, der tilbyder langsommere afspilning hastigheder.
- Kvantificere det samlede antal pote rører. Paw hånd opstår når musen rears (figur 5A), berører siden af cylinderen (figur 5B), efterfølgende forlader fartøjet med begge poter samtidigt (figur 5C) og lander (figur 5D). Poten kan eller ikke kan kontakte cylindervæggen med en fuld håndflade, men en vis kontakt med cylindervæggen skal ske. Vurdere paw hånd ved at tælle det antal gange musen får kontakt (uanset hvor kort) med cylindervæggen med den ene eller begge forpoter når den står på sine bagben i en bageste.
Bemærk, at kontakt med cylindervæggen kun regnes som en "pote touch" eller "pote-træk", hvis musen er i en bageste position - ståendepå sine bagben med både forpoter off af bordpladen. Hvis musen forbliver i en 3-punkts holdning - både bagben og en forpote på bordpladen og provenuet til at røre ved væggen med den gratis pote - dette er ikke regnes som en pote touch. Mus kan bagtil og røre cylindervæggen med en enkelt forepaw og dette regnes som en pote touch. Bemærk: en mus kan også flytte sin krop omkring cylinderen under en bageste, hvilket gør mere end to kontakter. Disse kontakter er optalt - en for hver venstre forpote touch og en for hver rigtige forepaw touch. - Kvantificere antallet af pote-drags. Paw-trække adfærd adskiller sig fra normale pote hånd.
- Hvis pote i kontakt med cylinderen væg med en fuld åben håndflade (figur 6B), vil det langsomt falde væk fra væggen, ofte med en let rysten. Bevægelsen begynder med cifrene trække mod cylindervæggen enten i en medial eller nedadgående retning, (figur 6C) før falder væk completely (figur 6D). Musen vil derefter afmontere med sin upåvirket pote (figur 6E) før landing på alle fire (figur 6F). Dette betragtes som en pote-træk og skal tælles i en oversigt.
- Hvis poten ikke kontakte cylindervæggen med en helt åben håndflade, vil det græsser cylindervæggen med sine tal, før det faldt væk fra cylindervæggen. Tilsvarende kan en mus trække sin pote mod cylindervæggen, men ikke frigive det helt før afmontering. Disse er begge betragtes pote-slæber samt hånd og bør regnes som både i en optælling.
- Poten kan også trække langs cylindervæggen, mens en mus udforsker cylinderen. I dette tilfælde vil poten følge vridning af mus torso som det udforsker venstre eller højre for sin oprindelige position (figur 7A-D) før afmontering (figur 7E). Dette betragtes ikke som en pote-træk, da det afhænger af musen tilfældigt vælgeen retning for at udforske og ikke afhænger af hvilken kortikale halvkugle blev beskadiget.
- Paw-drags er udtrykt som en procentdel af pote-slæber pr samlede antal pote rører under en session. Udtrykke antallet af pote-drags som en procentdel af de samlede pote kontakter for hver forlem separat.
- Rører resulterer i en pote-træk tælle som en pote-træk og et touch på samme tid. Hvis således en mus trækker sin pote hver gang poten i kontakt med cylindervæggen, er pote-trække procentdel udtrykt som 100%.
6. Yderligere Experimental Design Forslag
- For at minimere uvedkommende variable:
- Test musene på samme tid på hver test dag. Test musene under deres vågne cyklus. Holde mus på en 12 hr reverse lyscyklus letter ydeevne.
- Mus kan være tilbageholdende med at udforske cylinderen hvis stresset enten ved støj eller en roman miljø. Afprøvning mus i deres dyr bedrift rum eller et rum, de har been fortrolig med reducerer stress. Dette kan ske, hvis rummet er støjende, hvis musen er jostled forud for indsættelsen i cylinderen eller på grund af tilvænning.
BEMÆRK: Afprøvning bør udføres en gang før eksperimentel manipulation til at tjene som en baseline læsning. Efter manipulation, prøvning dage er på eksperimentatorens skøn, selv om det tilrådes at undgå et for stort antal engagementer med cylinderen i løbet af en kort periode. - Mus kan blive tilbageholdende med at bagud efter 6-7 eksponeringer mod cylinderen. For den nuværende undersøgelse blev mus testet i cylinderen for i alt syv gange, før iskæmi og på dag 1, 3, 7, 14, 21 og 28 efter kirurgi.
BEMÆRK: I dette studie anvendte vi stammen FVBN musen. Vi har tidligere testet C57BL / 6-mus i cylinderen og observerede pote-trække adfærd efter en ET-1 iskæmisk skade (data ikke vist). C57BL / 6-mus var mere aktive end FVBN mus, når opdræt og ofte sprang op på kanten af cylinderenfør klatring ud. Taller cylindre bør bruges, hvis mus forsøger at flygte ved at hoppe.
7. Endothelin-1 Kirurgi og infarktvolumen Målinger
- Udfør Endothelin-1 kirurgi og infarkt volumen målinger i henhold til tidligere offentliggjorte protokoller 4. At målrette forreste forben motor cortex, bør hver mus modtage tre ET-1 injektioner ved følgende koordinater: (i) 0,7 anteriorposterior (AP) /1.5 medialt-lateral (ml) / - 1,2 dorsal-ventral (DV), ( ii) +0,4 AP / 1,25 ml / - 1,2 DV og (iii) +0,1 AP / 1,75 ml / -1.2 DV 4.
8. Statistisk analyse
- Der anbefales en to-vejs gentagne målinger variansanalyse (ANOVA) til at analysere procent af pote-trække for de berørte og upåvirkede poter på tværs af forskellige tidspunkter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har tidligere vist, at pote-trække adfærd vises efter en fokal iskæmisk skade på forben sensomotoriske cortex og er en positiv indikator for skade 4. Intra-corticale injektioner af ET-1 ind i forben sensomotoriske cortex blev anvendt til at inducere en iskæmisk læsion (figur 8A, B). Denne undersøgelse undersøgte, om pote-trække adfærd forlænges længere end 14 dage efter skaden for sin potentielle anvendelse til at vurdere funktionel genopretning. Mus blev testet i cylinderen test på dagen forud for ET-1 injektioner til præoperativ tidspunkt, og på dag 1, 3, 7, 14, 21 og 28 efter skaden. Ved hvert tidspunkt blev antallet af pote rører og paw drags kvantificeret for både påvirkede og upåvirkede pote. To vejs gentagne foranstaltninger ANOVA om antallet af pote hånd afsløret betydelige vigtigste virkninger af tid [F (6108) = 3.59, P = 0,0028] og emner [F (18108) = 2,38, P = 0,0032] men ingen effekt af behandling(Tabel 1). Henviser til, at anvendelse af den standard analyse af forben asymmetri for cylinderen test, som kvantificerer berørte paw hånd versus samlede paw hånd afsløret inkonsekvent forben adfærdsmæssige underskud. En en-vejs gentagne målinger ANOVA på procent af påvirkede pote brug afslørede en signifikant hovedvirkning af tid (p = 0,015), som efterfølges af Dunnetts post hoc test viste signifikante reduktioner i procent påvirkede pote brug på 7, 14 og 21 dage efter -surgery og nyttiggøres med 28 dage efter operationen (figur 8C). Derimod slæber en tovejs gentagne foranstaltninger ANOVA om antallet af pote afsløret betydelige vigtigste virkninger af tid [F (6108) = 7,09, P <0,0001], behandling [F (1.108) = 33,02, p <0,0001], interaktion [ F (6.108) = 9,89, P <0,0001] og fag [F (18.108) = 4,84, P <0,0001]. Yderligere Bonferroni post hoc analyse viste signifikante stigninger i antallet af pote slæber på hvert tidspunkt efter operationen (tabel 1). Ligeledes en tovejs gentagne målinger ANOVA sammenligne antallet af påvirkede pote-trækker versus samlede påvirkede pote rører afslørede signifikante vigtigste virkninger af tid [F (6.108) = 6,63, p <0,0001], behandling [F (1.108) = 20,46, p = 0,0003], interaktion [F (6108) = 8,21, p <0,0001], og fag (matching) [F (18108) = 7,35, p <0,0001]. Yderligere Bonferroni post-hoc analyse viste signifikant pote-trække adfærd op til 28 dage efter kirurgi (figur 8D). Poten-trække opførsel var specifik for de ramte led, som ingen forøgelse eller ændring i pote-trække blev observeret med det upåvirkede lem. Paw-trække adfærd med den sygdomsramte forpote blev signifikant forhøjet ved 1, 3, 7, 21 og 28 dage efter kirurgi (figur 8D). Paw-trække adfærd toppede ved 1 dag efter operation med> 30% af alle pote rører med den påvirkede forben resulterer i en pote-træk faldt derefter til ~ 15% ved 3 dage efter kirurgi, hvor den forblev til og med 28 dage post-kirurgi. Ved 28 dage efter operation, blev musene aflivet og infarktvolumener vurderes. Den gennemsnitlige infarktvolumen for gruppen var 3,2 ± 0,4 um 3 (n = 10 mus). Disse resultater viser, at små kortikale infarkter kan resultere i en betydelig og vedvarende adfærdsmæssige mangler som målt i cylinderen test. Sammenfattende viser disse data, at ikke alene er paw-trække stærkt reagerer på skader på forben sensomotoriske cortex, men pote-trække også vedvarer over tid og kan anvendes til at vurdere funktionel restitution.
Figur 1. Bracket steder at fastgøre spejlet på plads under tabellen. (A) forfra tabel over beslag steder på forbenene på bordet. (A) Højere forstørrelse af indsatte i A viser placering af beslag på forbenene. (B) Bagsiden af bordet showing ben beslag steder bageste. (B) Højere forstørrelse af indsatte i B indikerer beslag placering på bageste ben af bordet.
Figur 2. Mærkning placering for cylinderen placering på bordet. Foto af bordpladen indikerer placering af cylinderen med sorte linjer trukket rundt langs kanten af basen. Pile peger på de sorte linjer trukket på undersiden af de plexiglas anvendes til centrering af cylinderen på bordpladen.
Figur 3. forfra kamera og bordplade opsætning. Foto af bordpladen demonstrerer sigtelinien direkte gennem cylinderdelen (rød pil).
tynd-side = "altid"> 
Figur 4. Et sidebillede af kameraet og bordet opsætning. Kameraet er rettet direkte mod bunden af cylinderen. (A) Tabel og kamera setup taget fra oven. (B) Tabel og kamera setup taget på niveauet af bordet, der viser en mus opdræt i cylinderen.
Figur 5. En sekvens af billeder, der viser en uskadt mus opdræt. (A) Foto af en mus, inden en bageste. (B) Musen rører cylindervæggen med begge poter. (C) For at afmontere, vil musen skubbe mod cylindervæggen ved hjælp af både poter og (D) lander på alle fire poter. Lt = mus venstre pote, Rt = musens højre pote.
Figur 6. En sekvens af billeder, der viser en skadet mus pote-trække. (A) Foto af en mus, inden en bageste. (B) Musen vil berøre cylindervæggen med begge poter; (C) derefter langsomt lad cifrene på den påvirkede pote træk lodret ned cylindervæggen; (D) før udlejning poten falde væk fra væggen. (E) Musen vil derefter afmontere med deres upåvirket pote og (F) lander på alle fire poter. Høje forstørrelse mellemværker i B, C og D demonstrerer hvordan de berørte forpoteknogler kontakter cylindervæggen. Lt = mus venstre pote.
Figur 7. En "ikke pote-træk«. (A) Musen rører cylindervæggen med begge poter. (B) Musen vrider sin torso lateralt at udforske cylindervæggen. (C) Den muse re-positioner sin førende forpoteknogler til en ny position sideværts og slæber sin afsluttende pote i samme retning. (D) Den bageste pote er plantet solidt i sin nye placering, og begge poter bruges til at afmontere (E) for at vende tilbage til alle fire poter. Røde pilespidser angiver placeringen af poter på start og slut positioner. Røde pil viser bevægelse af bageste forpote langs cylindervæggen.
Figur 8. Paw-trække adfærd opretholdes i 4 uger efter et samlingspunkt kortikal, iskæmisk læsion. (A) Repræsentant ph otomicrograph af et cresylviolet-farvet koronale hjerne snit gennem en ET-1 iskæmisk læsion efter 28 dage efter kirurgi. (B) Højere forstørrelse af ET-1 læsion af indrammede areal i A. (C) Analyse af forben asymmetri i cylinderen test efter en ET-1 iskæmisk skade på forben sensomotoriske viser variable adfærdsmæssige underskud. Dataene er udtrykt som middelværdi ± SEM. Midler blev analyseret ved envejs gentagne målinger ANOVA der viser en signifikant hovedvirkning af tid (p = 0,015) og derefter efterfulgt af Dunnetts post hoc test, som sammenligner alle midler til organerne inden behandlingen. (D) Analyse af paw-trække adfærd i cylinderen testen afslører en forben adfærdsmæssige underskud fastholdes op til fire uger efter en ET-1-induceret iskæmisk skade. Midler blev analyseret ved to-vejs gentagne målinger ANOVA efterfulgt af Bonferroni posthoc test. (N = 10) * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52701/52701fig8large.jpg" target = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De vigtigste punkter for at fastslå, hvornår kvantificere pote-trække adfærd i cylinderen testen er følgende: i) kvantificere antallet af pote-trækker versus samlede pote finesser til hver pote før hjerneskade at etablere en baseline; ii) kvantificere antallet af pote-drags versus samlede pote finesser til hver pote efter den iskæmiske skade; og iii) diskriminerer mellem en pote-træk og den laterale bevægelse af poten langs cylindervæggen under lateral rotation af musen torso.
Paw-trække er en roman adfærd, der vises efter skade til forben sensomotoriske cortex. Udseendet af pote-trække adfærd kan derfor anvendes som en positiv indikator for, at forben sensomotoriske cortex er blevet beskadiget. De repræsentative resultater viser, at små ET-1 infarkter ca. 2-4 mm 3 i volumen og lokaliserede til forben sensomotoriske cortex resultat i pote-trække adfærd. Dette er i modsætning til forben asymMetry analyse, som undlader at opdage konsekvente underskud i procent af de ramte pote rører versus overordnede hånd efter ET-1 iskæmiske kortikale skader 4-6. Analyse af pote-trække adfærd derfor er mere følsom i forbindelse med afsløring skader på forben sensomotoriske cortex. På grund pote-trække blev opretholdt op til fire uger efter skaden det kan også være egnede til analyse genvinding af funktion. Som vi tidligere har vist, at pote-trække adfærd korrelerer med skader på forben sensomotoriske cortex 4, kan et vilkårligt antal skade modeller gavn i at have denne analyse af cylinderen test. Selv om store skader, såsom mellem-cerebral arterieokklusion og traumatiske hjerneskade 7,8 viser underskud på den klassiske forben asymmetri analyse af cylinderen test, disse underskud ofte løse med tiden. I disse tilfælde pote-trække, er et mere følsomt mål for beskadigelse af forben sensomotoriske cortex ville være useful at opdage kroniske, mere subtile underskud. Ligeledes i skade modeller, der viser mindre ensartede resultater med den klassiske forben asymmetri analyse, ville pote-trække analyse være nyttigt i forbindelse med afsløring mere konsistente adfærdsmæssige underskud. Paw-trække analyse af cylinderen testen har brede anvendelser for en række iskæmiske skade modeller, herunder mellem-cerebral arterieokklusion, photothrombosis, pial stripning og ET-1, som vist her.
Der er en række adfærdsmæssige tests, der anvendes til at analysere forben motoriske og sensoriske underskud efter skade på sensomotoriske cortex. Den Montoya trappe test vurderer forben at nå og gribe adfærd 9,10. Tilsvarende enkelt pille nå og pasta spise tests analysere finmotorisk aktivitet poterne og tal 11,12. Forben asymmetri analyse af cylinderen test er forbundet med postural støtte, når musen er op på sine bagben 1. Kun antalletaf kontakter hver pote danner med cylindervæggen kvantificeres. Hvordan poten får kontakt er ikke undersøgt, og kan yderligere tegn på skader. Tidligere undersøgelser har kvantificeret varigheden af støtte for hver forepaw touch og fundet flere konsekvente underskud i mus efter photothrombotic slagtilfælde 13,14. Vore resultater viser, at pote-trække i cylinderen vises følgende skade på forben sensomotoriske cortex og kan være relateret til en nedsat evne til at understøtte dens vægt med den påvirkede pote og / eller som følge af et tab af sensorisk modtagelse i poten. Poten observeres at få kontakt med væggen, men synes ikke at opretholde en støttende holdning eller hjælpe med at skubbe ud fra væggen, men snarere glider ud i det, vi kalder en pote-træk. Vi har observeret, at pote-trække Problemet opstår i næsten alle dyr med en skade på forben sensomotoriske cortex og indebærer en meget unik adfærdsmønster, hvilket gør det ganske stærk forudsige kortikal skade i sin egen right. I denne forstand, pote-trække er et nyttigt redskab i et batteri af adfærdsmæssige analyser. Det er kombinationen af en lav start-up omkostninger, let administration af testen, og pålideligheden af poten-trække analyse, der gør pote-trække analyse af cylinderen testen sådan et attraktivt valg forudsige fokal iskæmisk skade i mus .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi takker Mr. John Crowell og Mr. Terry Upshall for deres tekniske ekspertise og bistand med fotografering og videography. Dette arbejde blev støttet af driftstilskud til JLV fra den canadiske Institutes of Health Research og forskning og udvikling Corporation of Newfoundland og et hjerte & Stroke Foundation of Canada Canadisk Partnerskab for Stroke Recovery Catalyst tilskud. RBR var en modtager af en Keith Griffiths Memorial Heart & Stroke Foundation Graduate Scholarship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plexi-glass cylinder | 17.5 cm high, 9.5 cm outer diameter, 8.8 cm inner diameter, wall thickness 0.35 cm (or 3.5 mm) | ||
| viewing table | 54x56x66.5 cm (width x length x height), top of table is a 51x51 cm sheet of plexiglass. | ||
| mirror | 34x58 cm mirror | ||
| video camera | Sony | DCR-SR42 | Video camera with onboard storage, SD functionality, 40x optical zoom |
| computer | Dell | Optiplex 760 | Processor: Intel, 3.0 GHz, Memory 4.00GB (RAM) |
| computer monitor | Samsung | S22C350H | |
| Excel (Microsoft Office Professional Plus) | Microsoft | v14.0.7106.5003 | |
| VLC Media Player | Video LAN | v2.1.2 | Media player with playback speed modulation and video support |
| External Hard Drive | Western Digital | WDBAAU0020HBK-01 | 2 TB |
References
- Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).
- Kolb, B., et al. Growth factor-stimulated generation of new cortical tissue and functional recovery after stroke damage to the motor cortex of rats. J Cereb Blood Flow Metab. 27 (5), 983-997 (2007).
- Windle, V., et al. An analysis of four different methods of producing focal cerebral ischemia with endothelin-1 in the rat. Exp Neurol. 201 (2), 324-334 (2006).
- Roome, R. B., et al. A reproducible Endothelin-1 model of forelimb motor cortex stroke in the mouse. J Neurosci Methods. 233, 34-44 (2014).
- Tennant, K. A., Jones, T. A. Sensorimotor behavioral effects of endothelin-1 induced small cortical infarcts in C57BL/6 mice. J Neurosci Methods. 181 (1), 18-26 (2009).
- Wang, Y., Jin, K., Greenberg, D. A. Neurogenesis associated with endothelin-induced cortical infarction in the mouse. Brain Res. 1167, 118-122 (2007).
- Baskin, Y. K., Dietrich, W. D., Green, E. J. Two effective behavioral tasks for evaluating sensorimotor dysfunction following traumatic brain injury in mice. J Neurosci Methods. 129 (1), 87-93 (2003).
- Li, X., et al. Chronic behavioral testing after focal ischemia in the mouse: functional recovery and the effects of gender. Exp Neurol. 187 (1), 94-104 (2004).
- Clarke, J., Ploughman, M., Corbett, D. A qualitative and quantitative analysis of skilled forelimb reaching impairment following intracerebral hemorrhage in rats. Brain Res. , 204-212 (2007).
- Montoya, C. P., Campbell-Hope, L. J., Pemberton, K. D., Dunnett, S. B. The 'staircase test': a measure of independent forelimb reaching and grasping abilities in rats. J Neurosci Methods. 36 (2-3), 219-228 (1991).
- Farr, T. D., Whishaw, I. Q. Quantitative and qualitative impairments in skilled reaching in the mouse (Mus musculus) after a focal motor cortex stroke. Stroke. 33 (7), 1869-1875 (2002).
- Tennant, K. A., et al. The vermicelli and capellini handling tests: simple quantitative measures of dexterous forepaw function in rats and mice. J Vis Exp. (41), (2010).
- Clarkson, A. N., et al. AMPA receptor-induced local brain-derived neurotrophic factor signaling mediates motor recovery after stroke. J Neurosci. 31 (10), 3766-3775 (2011).
- Clarkson, A. N., Huang, B. S., Macisaac, S. E., Mody, I., Carmichael, S. T. Reducing excessive GABA-mediated tonic inhibition promotes functional recovery after stroke. Nature. 468 (7321), 305-309 (2010).
