Summary
Klassieke voorpoot asymmetrie analyse van de cilinder test wordt routinematig gebruikt om behavioral tekorten in ratten na hersenletsel of een beroerte te beoordelen; echter niet consistent tekorten sporen bij muizen. Deze studie toont aan dat het kwantificeren van poot-slepen gedrag is een meer gevoelige analyse van hersenletsel bij muizen.
Abstract
De cilinder test wordt routinematig gebruikt om focale ischemische schade aan de voorpoot motorische cortex bij knaagdieren voorspellen. Wanneer geplaatst in de cilinder, knaagdieren onderzoeken door het fokken en het aanraken van de muren van de cilinder met hun voorpoot poten voor posturale steun. Naar aanleiding van ischemische schade aan de voorpoot sensomotorische cortex, ratten rekenen zwaarder op hun onaangetast voorpoot poot voor posturale steun resulteert in minder aanrakingen met hun aangedane poot die wordt genoemd voorpoot asymmetrie. In tegenstelling, focale ischemische schade in de hersenen van muizen niet te resulteren in vergelijkbare consistente tekorten in voorpoot asymmetrie. Terwijl voorpoot asymmetrie tekorten zelden worden waargenomen, doen muizen een roman gedrag na een beroerte genoemd "poot-slepen" te tonen. Paw-slepen is de neiging om een muis te slepen haar aangedane poot langs de cilinderwand in plaats van direct te duwen off van de muur bij het demonteren van een achterste naar een vier-legged houding. We hebben eerder aangetoond datpoot-slepen gedrag is zeer gevoelig voor kleine corticale ischemische verwondingen aan de voorpoot motorische cortex. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor-poot slepen analyse. We definiëren wat een poot-drag is en demonstreren hoe-poot te slepen gedrag te kwantificeren. De cilinder test is een eenvoudige en goedkope test te beheren en vereist geen pre-training of voedsel ontbering strategieën. Bij het gebruik van-poot te slepen analyse met de cilinder test, het vult een niche voor het voorspellen van corticale ischemische verwondingen zoals photothrombosis en endotheline-1 (ET-1) geïnduceerde ischemie - twee modellen die worden steeds populairder en produceren van kleinere focale blessures dan midden cerebrale slagader occlusie. Tenslotte meet-poot te slepen gedrag in de cilinder test zal studies van functioneel herstel na corticale letsel met behulp van een grote cohort van transgene muizenstammen, waar vorige voorpoot asymmetrie analyse heeft nagelaten om consistente tekorten op te sporen mogelijk te maken.
Introduction
Het doel van de neurale regeneratie strategieën is om zowel weefselherstel en functioneel herstel te tonen. Functioneel herstel wordt gewoonlijk geëvalueerd gedragstesten die functionele gebreken gemeten, in dit geval met motorische vaardigheden die op schade aan de specifieke hersengebieden. Traumatisch hersenletsel of ischemische schade aan de sensorimotorische voorpoot gebied van de cortex kan worden aangetoond door een aantal gedragstesten. Een dergelijke test wordt de cilinderproef veelvuldig gebruikt in ratten functionele gebreken beoordelen voorpoot activiteit 1. De test heeft een lage set-up kosten waarvoor slechts een cilinder, camera en een tafel met een transparante top. Het is gemakkelijk om te dienen als het is gebaseerd op de natuurlijke verkennende gedrag van knaagdieren, dus pre-training en voeding ontbering of beloningen zijn niet nodig. Ondanks deze vele voordelen, wordt de cilinder-test onderbenut te voorpoot tekorten beoordelen in muizen na focale verwondingen aan de voorpoot sensorimotor cortex, die wij toeschrijven aan de analyse van muis volledig in de cilinder proef. Voorpoot asymmetrie is de klassieke maatstaf voor de analyse van de cilinder-test. Wanneer geplaatst in de cilinder, knaagdieren natuurlijk de muren van de cilinder te verkennen met het grootbrengen op hun achterpoten en het aanraken van de cilinderwanden met hun voorpoot poten voor posturale balans. Het aantal poot raakt de wand bij elke voorpoot gemakkelijk gekwantificeerd door filmen knaagdieren tijdens deze verkenning van de cilinder. Forelimb asymmetrie ontstaat wanneer de aangetaste poot voorpoot maakt minder raakt met de wand dan de gezonde voorpoot poot en illustreert schade aan de contralaterale sensorimotorische cortex. Bij ratten intra-corticale injecties van de vasoconstrictieve agens, Endotheline (ET-1), in de voorpoot sensorimotorische cortex veroorzaakt een focale ischemische laesie waardoor gedragsgebreken in de contralaterale voorpoot. Tekorten in contralaterale voorpoot gebruik gemakkelijk worden gedetecteerd als veranderingen in de forelimb asymmetrie in de cilinder-test bij ratten 1-3. In tegenstelling tot ratten Veranderingen in voorpoot asymmetrie zijn variabel en minder consistent bij muizen na vergelijkbare ET-1 injecties 4-6. Hier laten we zien een nieuwe analyse van de voorpoot gedrag in de cilinder-test - analyse van de poot te slepen gedrag. We hebben eerder aangetoond dat paw slepen analyse is een gevoeligere maat voor beschadiging van de voorpoot sensorimotorische cortex in muizen dan de klassieke voorpoot asymmetrie analyse en derhalve is toepasbaar op verschillende focale corticale letsel modellen.
Onderzoek van hoe de voorpoot contact met de cilinder wand volgende ischemische schade aan de voorpoot sensomotorische cortex bleek een roman gedrag in muizen - poot-slepen 4. Een poot-drag optreedt wanneer een muis staat op zijn achterste benen om de cilinderwand verkennen vervolgens sleept zijn getroffen (contra-letsels) poot langs de cilinderwand naar zijn middellijn of de muur, terwijlhaar onaangetast forepaw biedt posturale steun tegen de muur. Paw-sleept zelden in uninjured muizen dan ook het uiterlijk van een poot-drag is een positieve indicator van de schade aan de voorpoot sensomotorische cortex 4. We hebben eerder gekwantificeerd-paw slepen gedrag bij muizen na ET-1 ischemische schade aan de voorpoot sensorimotorische cortex en hebben aangetoond langdurige paw slepen gedrag in muizen tot twee weken na een beroerte 4. Hier laten we zien dat-poot te slepen gedrag wordt volgehouden tot vier weken na een beroerte. Analyse van-poot te slepen gedrag biedt een nieuwe en gevoelig instrument voor de beoordeling focale ischemische schade aan de voorpoot sensomotorische cortex bij muizen. Zijn goedkope set-up, gemak van toediening en scoren maken dit een eenvoudige, maar toch nuttig instrument om voorpoot behavioral tekorten snel evalueren in muizen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethics statement: Alle experimenten werden goedgekeurd door Memorial Universiteit van Animal Care Ethische Commissie van Newfoundland's volgens de richtlijnen van de Canadese Raad van Animal Care.
1. Muizen
- Gebruik volwassen muizen. In deze studie werden volwassen mannelijke FVBN muizen (n = 10) tussen 2-4 maanden gebruikt. Huis muizen op een 12:12 hr omgekeerde licht-donker cyclus en bieden standaard knaagdieren chow en water ad libitum.
2. Materialen Vereist voor de Cilinder Test
- Zorg voor een tafel met een transparante top naar de cilinder testen filmen. De afmetingen van de tafel zijn irrelevant, de top moet plexiglas of glas zijn, en dat er genoeg ruimte een spiegel onder de tabel positie. Dit maakt de muis worden gefilmd van onderen. Gebruik een spiegel onder de tafel om het beeld door de cilinder te reflecteren. Als alternatief gebruikt een omgekeerd camera indien beschikbaar. De afmetingen van de tabel die in dit protocol zijn 54 x 56 x 66,5 cm (BxDxH) met een 51 x 51cm boven (bxl).
- Zorg voor een spiegel. De afmetingen van de spiegel die in dit protocol zijn 34 x 58 cm (bxl).
- Zorg voor een transparant / plexiglas cilinder voor de muis om in te voeren. De afmetingen van de cilinder die in dit protocol zijn 17,5 cm hoog, 8,8 cm ID, 9,5 cm OD met een wanddikte van 0.35cm. Een groter cilinder worden om bijvoorbeeld het actieve muizenstammen.
- Plaats de cilinder op het tafelblad en filmen de reflectie in de onderstaande spiegel.
- Een videocamera en statief vereist. Video's opnemen op ongeveer 650Kb / s, die ongeveer is 190MB per 5 min van de cilinder video. Zorg ervoor dat de camera een zoom-functie zodat de cilinder omvat het gehele gezichtsveld.
OPMERKING: De videocamera gebruikt in dit protocol is een Sony DCR-SR42, 40x optische zoom, 2,000x digitale zoom, 680kpix die standaard definitie, NTSC interlaced video gebruikt). - Verkrijgen van software voor analyse - een media-player met video-ondersteuning en afspeelsnelheid modulatie. De mediaspeler gebruikt in dit protocol is de VLC Media Player v2.1.2.
- Zorg voor een computer met een besturingssysteem kunnen draaien de mediaspeler en een monitor.
- Elektronische opslag van video vereist. Download video's naar een externe harde schijf of kopiëren naar dvd's voor de lange termijn opslag.
NB: Bij 190MB per video, zal 84 sessies past op een 16 GB SD-kaart en 168 sessies zal passen op een 32 GB SD-kaart. Door de relatieve inexpensiveness SD media en de onzekerheid in hoeveel tijd sommige muizen vereisen 20 rears voltooien, wordt een 32 GB kaart aanbevolen. In de huidige studie werden de video's gekopieerd van de camera naar een 2TB externe harde schijf en vervolgens gekopieerd naar dvd's als back-up.
3. experimentele opstelling van de Cilinder Test
- Bevestig spiegel onder de tafel in een hoek van 45 graden naar het tafelblad. Doe dit met behulp van twee steunbeugels aan de tafelpoten aan support de bovenkant en onderkant van de spiegel resp. Beugel locaties worden vermeld in een zij-aanzicht over de tafel (Figuur 1A) en een gezicht- aanzicht over de tafel (Figuur 1B).
- Plaats de cilinder in het midden van de tafel. Trek vier equidistante lijnen waar de cilinder zit op de tafel met een zwarte marker (Sharpie), zodat de cilinder kan worden opgetild en weer in dezelfde positie (figuur 2). Uitwerking daarvan op de onderzijde van de transparante tafelblad kan het tafelblad te reinigen tussen dierproeven zonder oplossen van de marker inkt.
- Bevestig de camera en statief. Richt de camera op de spiegel, zodat het beeld direct op zoek is door de loop van de cilinder. Controleer de volledige binnenwand van de cilinder zichtbaar en ongehinderd door de basis (figuur 3). Zie een zijdelingse weergave van de configuratie, inclusief de relatieve hoek van de camera en spiegel instelling, van boven (figuur 4A) en dehet niveau van de tafel, zoals een muis kweken (figuur 4B).
- Bereid cue kaarten aan elke muis voorafgaand aan het filmen te identificeren. Zorg ervoor dat de kaarten omvatten gewoonlijk een identificatienummer voor elke muis, het tijdpunt van de test (bijv., 3 dagen na behandeling) en de datum van de filmen sessie. Laat de behandelde groep op de cue-kaart niet inbegrepen om ervoor te zorgen de experimentator wordt verblind.
- Film in standaard indoor lichtomstandigheden als dit lichtniveau is nodig om duidelijk de muisbewegingen rond de cilinder.
OPMERKING: Indien beschikbaar filmen in het donker met een rood licht camera kan volstaan, maar zou men eerst moeten testen of poot accenten en sleept zijn duidelijk zichtbaar voor de kwantificering.
4. Uitvoering
- Start filmen. Geef het juiste muis cue-kaart in de voorkant van de camera lens.
- Laat de muis in de cilinder van de open top direct na het filmen van de cue-kaart.
- Begin met het filmen van de muis. Ruis te minimaliseren in deze tijd, zoals muizen interesse kunnen verliezen in het verkennen als geschrokken.
- Neem de muizen achterzijde naar de cilinder te verkennen. Vastleggen van de video totdat de muis voert een minimum van twintig opsteekt.
OPMERKING: Een achterzijde ontstaat wanneer beide voorpoten verliest het contact met de vloer en de muis staat op zijn achterste benen. - Veeg tafelblad en cilinder met een geschikt reinigingsmiddel tussen elke muis te saneren en te verwijderen muis geuren.
- Invriezen is wanneer muizen stoppen verkennen en blijven rustig zitten op handen en voeten voor ongeveer 5 min. Als muizen bevriest voor twintig rears voordoen, kan het noodzakelijk zijn ze uit de cilinder verwijderd voor 10-20 min vóór hervatting van de proef. Als muizen niet twintig steigert presteren, worden ze verwijderd uit de studie.
LET OP: In onze ervaring, muizen hebben nooit moest worden uitgesloten als gevolg van het falen van de cilinder te verkennen.
5. Evaluatie van de Cilinder Test met behulp van Paw-SlepenAnalyse
- Speel de video op een snelheid van tussen 0,25x en 0,67 x normale snelheid, afhankelijk van hoe snel de muis verkent de cilinder. Gebruik een mediaspeler die langzamer afspelen snelheden biedt.
- Kwantificeren van het totale aantal poot accenten. Paw raakt optreden wanneer de muis rears (figuur 5A), tegen de zijkant van de cilinder (figuur 5B), vervolgens stijgt af met beide poten tegelijkertijd (figuur 5C) en gebieden (figuur 5D). De poot kan al dan niet met de cilinderwand een volledige handpalm, maar enig contact met de cilinderwand moet plaatsvinden. Beoordelen poot raakt door het tellen van het aantal keren dat de muis maakt contact (hoe kort) met de cilinder wand met een of beide voorpoten terwijl je op zijn achterste benen tijdens een achterzijde.
Merk op dat het contact met de cilinder wand wordt alleen geteld als een 'poot touch "of" poot-drag "als de muis is in een achterste positie - staandop zijn achterste benen met beide voorpoten off van het tafelblad. Als de muis blijft in een 3-punts houding - zowel achterpoten en een voorpoot op het tafelblad en gaat aan de muur te raken met de gratis poot - dit wordt niet geteld als een poot touch. Muizen kunnen achter en raak de cilinderwand met een enkele voorpoot en deze wordt geteld als een poot touch. Let op: een muis kan ook zijn lichaam te bewegen rond de cilinder tijdens een achterste, het maken van meer dan twee contactpersonen. Deze contacten zijn geteld - één voor elke linker voorpoot aanraking en één voor elke juiste voorpoot touch. - Kwantificeren van het aantal poot-sleept. Paw-slepen gedrag is verschillend van normale poot accenten.
- Als de poot contact met de cilinder muur met een volledige open palm (figuur 6B), zal het langzaam weg te vallen van de muur, vaak met een lichte trilling. De beweging begint met de cijfers slepen tegen de cilinderwand hetzij in een mediale of neerwaartse richting (figuur 6C) voor afvallend completEly (figuur 6D). De muis zal dan demonteren met zijn onaangetast poot (figuur 6E) voor de landing op handen en voeten (figuur 6F). Dit wordt beschouwd als een poot-drag en moet worden geteld in een telling.
- Als de poot niet raakt de cilinderwand met een volledig open palm, zal de cilinderwand met cijfers weid alvorens te vallen vanaf de cilinderwand. Evenzo kan een muis zijn poot te slepen tegen de cilinderwand, maar het niet helemaal loslaat voordat demontage. Deze worden zowel beschouwd poot-sleept evenals accenten en moet worden geteld als zowel in een telling.
- De poot kan ook langs de cilinderwand slepen terwijl een muis verkent de cilinder. In dit geval wordt de poot het verdraaien van de romp van de muis volgen links of rechts van zijn oorspronkelijke positie (figuur 7A-D) onderzoekt Voor het uitbouwen (Figuur 7E). Dit wordt niet beschouwd als een poot-drag, omdat het afhankelijk is van de muis willekeurig te kiezeneen richting te verkennen en hangt niet af van welke corticale halfrond is beschadigd.
- Paw-sleept worden uitgedrukt als een percentage van de poot-sleept per totale aantal poot raakt tijdens een sessie. Express het aantal poot-sleept als een percentage van de totale poot contacten voor elke voorpoot afzonderlijk.
- Touches resulteert in een poot-drag tellen als een poot-drag en een vleugje tegelijk. Dus als een muis sleept zijn poot telkens zijn poot in aanraking met de cilinderwand, wordt de poot slepen percentage uitgedrukt als 100%.
6. Extra Experimental Ontwerp Tips
- Om externe variabelen te minimaliseren:
- Test de muizen op hetzelfde moment op elke testdag. Test de muizen in hun kielzog cyclus. Het houden van muizen op een 12 hr omgekeerde lichtcyclus vergemakkelijkt prestaties.
- Muizen kunnen aarzelen om de cilinder indien benadrukt hetzij door ruis of een nieuwe omgeving te verkennen. Het testen van muizen in hun dierlijke bedrijf of een kamer hebben ze bEen vertrouwd met stress vermindert. Dit kan gebeuren als de kamer is luidruchtig, als de muis is verdrongen voorafgaand aan het invoeren van de cilinder of als gevolg van gewenning.
Opmerking: Het testen moet eenmaal vóór experimentele manipulatie worden uitgevoerd om te dienen als een nulmeting. Na manipulatie, het testen van dagen zijn naar keuze van de experimentator, maar het is aangeraden om een te groot aantal van vorderingen op de cilinder over een korte periode van tijd te vermijden. - Muizen kunnen aarzelen om achter na 6-7 blootstellingen aan de cilinder te worden. Voor de huidige studie werden de muizen getest in de cilinder voor een totaal zeven keer, vóór ischemie en op dagen 1, 3, 7, 14, 21 en 28 na de operatie.
LET OP: In deze studie gebruikten we de FVBN muizenstam. We hebben eerder geteste C57BL / 6 muizen in de cilinder en waargenomen-paw slepen gedrag na een ET-1 ischemisch letsel (data niet getoond). C57BL / 6-muizen waren actiever dan FVBN muizen, indien gehouden en regelmatig sprong op de rand van de cilindervoordat klimmen uit. Taller cilinders moet worden gebruikt als muizen proberen te ontsnappen door te springen.
7. Endotheline-1 Chirurgie en Infarct Volume Metingen
- Voer Endotheline-1 operatie en infarct volume metingen volgens eerder gepubliceerde protocollen 4. Om de voorste voorpoot motorische cortex richten, moet elke muis drie ET-1 injecties op de volgende coördinaten: (i) 0,7 anteriorposterior (AP) of 1,5 mediaal-lateraal (ml) / - 1,2 dorsale-ventrale (DV), ( ii) 0,4 AP / 1,25 ml / - 1,2 DV en (iii) 0,1 AP / 1,75 ml / DV -1,2 4.
8. Statistische analyse
- Een twee-weg herhaalde metingen variantieanalyse (ANOVA) wordt aanbevolen om het percentage-paw slepen voor de getroffen en niet-aangetaste poten in verschillende tijdstippen geanalyseerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We hebben eerder aangetoond dat-poot te slepen gedrag verschijnt na een focale ischemische schade aan de voorpoot sensomotorische cortex en is een positieve indicator van schade 4. Intra-corticale injecties van ET-1 in de voorpoot sensorimotorische cortex werden gebruikt om een ischemisch letsel (figuur 8A, B) induceren. Deze studie onderzocht of-poot te slepen gedrag verlengd voor langer dan 14 dagen na het letsel voor zijn potentieel gebruik om functioneel herstel te evalueren. Muizen werden getest in de cilindertest de dag voor ET-1 injecties van het pre-operatie tijdstip en op dagen 1, 3, 7, 14, 21 en 28 na het letsel. Op elk tijdstip, het aantal poot accenten en poot sleept werden gekwantificeerd voor zowel de getroffen en onaangetast poot. Twee weg herhaalde metingen ANOVA op het aantal poot raakt onthulde significant belangrijkste effecten van de tijd [F (6,108) = 3,59, p = 0,0028] en onderwerpen [F (18.108) = 2,38, p = 0,0032] maar geen effect van de behandeling(Tabel 1). Overwegende dat, met behulp van de standaard analyse van de voorpoot asymmetrie voor de cilinder test die aangedane poot raakt kwantificeert versus totale poot accenten onthuld inconsistent voorpoot behavioral tekorten. Een one-way herhaalde metingen ANOVA op het percentage van de getroffen poot gebruik bleek een significant hoofdeffect van tijd (p = 0,015), die gevolgd door Dunnett's post hoc test toonde significante vermindering van het percentage aangetaste poot gebruik op 7, 14 en 21 dagen na de -surgery en herstelde met 28 dagen na de operatie (Figuur 8C). Daarentegen tweerichtingsverkeer herhaalde metingen ANOVA op het aantal poot sleept toonde significant hoofdeffect tijd [F (6,108) = 7,09, p <0,0001], behandeling [F (1,108) = 33,02, p <0,0001], interactie [ F (6,108) = 9.89, p <0,0001] en onderwerpen [F (18.108) = 4,84, p <0,0001]. Verdere Bonferroni post hoc analyse toonde significante toename in het aantal paw trekkers op elk tijdstip na een operatie (tabel 1). Ook een in twee richtingen herhaalde metingen ANOVA het vergelijken van het aantal getroffen poot-sleept versus totale aangetaste poot accenten onthuld aanzienlijke belangrijkste effecten van de tijd [F (6,108) = 6,63, p <0,0001], de behandeling [F (1,108) = 20.46, p = 0,0003], interactie [F (6,108) = 8.21, p <0,0001] en onderwerpen (matching) [F (18.108) = 7.35, p <0,0001]. Verdere Bonferroni post hoc analyse toonde significante-poot te slepen gedrag tot 28 dagen na de operatie (Figuur 8D). De poot te slepen gedrag was specifiek voor de getroffen ledemaat als geen verhoging of verandering in de poot-slepen werd waargenomen met de niet-aangedane ledemaat. -Paw slepen gedrag van de voorpoot betrokken was significant verhoogd bij 1, 3, 7, 21 en 28 dagen na de ingreep (Figuur 8D). Paw-slepen gedrag piekte op 1 dag na de operatie met> 30% van alle poot raakt met de getroffen voorpoot wat resulteert in een poot-sleep vervolgens gedaald tot ~ 15% in 3 dagen na de operatie waar het bleef tot en met 28 dagen na de operatie. Bij 28 dagen na de operatie, werden de muizen gedood en infarct volumes beoordeeld. De gemiddelde infarct volume van de groep 3,2 ± 0,4 pm 3 (n = 10 muizen). Deze resultaten tonen aan dat kleine corticale infarcten kan resulteren in aanzienlijke en aanhoudende gedragsgebreken gemeten in de cilinder proef. Samengevat tonen deze gegevens aan dat niet alleen-paw slepen zeer gevoelig voor beschadiging van de voorpoot sensomotorische cortex, maar paw-slepen blijft ook in de tijd en kan worden gebruikt om functioneel herstel te evalueren.
Figuur 1. Beugel locaties om de spiegel vast in plaats onder de tafel. (A) Vooraanzicht van de tabel met beugel locaties op voorpoten van de tafel. (A ') Hogere vergroting van inzet in A met de locatie van de beugels op voorpoten. (B) Achterzijde van tafel tonening achterste been beugel locaties. (B ') Hogere vergroting van inzet in B aangeeft beugel locatie op achterpoten van tafel.
Figuur 2. markeren de locatie cylinder plaatsing op de tafel. Foto van het tafelblad aangeeft plaatsing van de cilinder met zwarte lijnen getekend rond de omtrek van de basis. Pijlen wijzen naar de zwarte lijnen op de onderzijde van het plexiglas voor het centreren van de cilinder op het tafelblad.
Figuur 3. Vooraanzicht van de camera en het tafelblad set-up. Foto van het tafelblad het aantonen van de lijn van het zicht direct via de cilinder vat (rode pijl).
thin-page = "always"> 
Figuur 4. Een zijaanzicht van de camera en de tafel opzet. De camera is direct gericht op de basis van de cilinder. (A) Tabel en instellen van de camera van boven. (B) Tabel en camera instellen op het niveau van de tafel, die een muis kweken in de cilinder.
Figuur 5. Een reeks foto's demonstreren een ongedeerd muis grootbrengen. (A) Foto van een muis voorafgaand aan een achterzijde. (B) De muis raakt de cilinder wand met beide poten. (C) Demontage de muis duwen tegen de cilinderwand met beide poten, en (D) grond aan alle vier poten. Linkerpoot Lt = muis, rechts poot Rt = muis.
Figuur 6. Een reeks foto's demonstreren een gewonde muis poot-slepen. (A) Foto van een muis voorafgaand aan een achterzijde. (B) De muis zal de cilinder wand met beide poten raken; (C), dan langzaam laten de cijfers op de aangetaste poot sleep verticaal naar beneden de cilinder wand; (D) voor het laten van de poot van de muur vallen. (E) De muis zal dan afstappen met hun onaangetast poot en (F) grond op alle vier poten. Sterke vergroting bijvoegsels in B, C en D tonen hoe de aangedane voorpoot contact met de cilinderwand. Linkerpoot Lt = muis.
Figuur 7. Een 'non-poot drag'. (A) De muis raakt de cilinderwand beide poten. (B) De muis verdraait de romp zijkanten aan de cilinderwand verkennen. (C) De muis opnieuw posities zijn leidende forepaw naar een nieuwe positie lateraal en sleurt de achterste poot in dezelfde richting. (D) De achterstand poot wordt stevig in haar nieuwe locatie, en beide poten worden gebruikt om te demonteren (E) om terug te keren naar alle vier de poten. Red pijlpunten wijzen locatie van poten aan het begin en het einde posities. Rode pijl geeft beweging van trailing voorpoot langs de cilinderwand.
Figuur 8. Paw-slepen gedrag wordt volgehouden gedurende 4 weken na een focale corticale, ischemische laesie. (A) Vertegenwoordiger ph otomicrograph van een cresyl violet-gekleurde coronale sectie hersenen door een ET-1 ischemische laesie op 28 dagen na de operatie. (B) Hogere vergroting van de ET-1 laesie van de boxed gebied A. (C) Analyse van voorpoot asymmetrie in de cilinder proef na een ET-1 ischemisch letsel aan de voorpoot sensorimotorische toont variabele gedragsgebreken. Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM. Middelen werden geanalyseerd door one-way herhaalde metingen ANOVA onthullen van een significant hoofdeffect van tijd (p = 0,015), gevolgd door Dunnett's post hoc-test vergelijken alle middelen om de middelen voor de behandeling. (D) Analyse van paw slepen gedrag in de cilinder test toont een voorpoot gedrags tekort opgelopen tot vier weken na een ET-1 geïnduceerde ischemische schade. Middelen werden geanalyseerd door twee-weg herhaalde metingen ANOVA gevolgd door Bonferroni posthoc testen. (N = 10) * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52701/52701fig8large.jpg" target = "_ blank"> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De belangrijkste punten om vast te stellen wanneer het kwantificeren-poot te slepen gedrag in de cilinder-test zijn de volgende: i) het kwantificeren van het aantal poot-sleept versus totale poot accenten voor elke poot vóór hersenletsel naar een basislijn vast te stellen; ii) kwantificeren van het aantal poot-sleept versus totale poot accenten voor elke poot na de ischemische verwonding; en iii) onderscheid te maken tussen een poot-slepen en de zijwaartse beweging van de poot langs de cilinderwand tijdens laterale rotatie van de romp van de muis.
Paw-slepen is een roman gedrag dat lijkt na letsel aan de voorpoot sensomotorische cortex. Het uiterlijk van paw slepen gedrag daarom worden gebruikt als een positieve indicator dat de voorpoot sensorimotorische cortex is beschadigd. De representatieve resultaten tonen aan dat kleine ET-1 infarcten ongeveer 2-4 mm 3 in volume en gelokaliseerd aan de voorpoot sensomotorische cortex resultaat in-poot te slepen gedrag. Dit in tegenstelling tot asym voorpootmetrie analyse die er niet in slaagt om een consistente tekorten op te sporen in het percentage van de getroffen poot raakt versus totale accenten volgende ET-1 ischemische corticale verwondingen 4-6. Analyse van-poot te slepen gedrag is daarom gevoeliger bij het opsporen van schade aan de voorpoot sensomotorische cortex. Bovendien, omdat de poot-slepen werd gehandhaafd tot vier weken na het letsel het kan ook geschikt zijn voor het analyseren van het herstel van de functie. Zoals we eerder hebben laten zien dat-poot te slepen gedrag correleert met schade aan de voorpoot sensomotorische cortex 4, kan een aantal verwondingen modellen profiteren in het hebben van deze analyse van de cilinder-test. Hoewel grote verwondingen, zoals midden cerebrale slagader occlusie en traumatisch hersenletsel 7,8 vertonen tekorten op de klassieke voorpoot asymmetrie analyse van de cilinder test, deze tekorten vaak op te lossen in de tijd. In deze gevallen poot-slepen die een gevoeligere maat voor beschadiging van de voorpoot sensorimotorische cortex zou useful bij het opsporen van chronische, subtieler tekorten. Zo ook in letsel modellen die minder consistente resultaten met de klassieke voorpoot asymmetrie analyse blijkt, zou-poot te slepen analyse nuttig bij het opsporen van meer consistente gedragsmatige tekorten zijn. Paw-slepen analyse van de cilinder test moet vele toepassingen voor uiteenlopende ischemie modellen die middelste cerebrale arterie occlusie photothrombosis, pial strip- en ET-1, zoals hier getoond.
Er zijn een aantal gedragstesten gebruikt voorpoot motorische en sensorische stoornissen na letsel aan de sensorimotorische cortex analyseren. De Montoya trap-test beoordeelt voorpoot reiken en grijpen gedrag 9,10. Zo ook enkele pellet bereiken en pasta eten testen analyseren de fijne motorische activiteit van de poten en cijfers 11,12. Forelimb asymmetrie analyse van de cilindertest is gekoppeld houdingsondersteuning wanneer de muis op de achterpoten 1. Alleen het aantalcontacten elke poot maakt met de cilinder wand wordt gekwantificeerd. Hoe de poot contact maakt is niet onderzocht en kan verder een indicatie van schade. Eerdere studies hebben de duur van de steun van elke voorpoot aanraking gekwantificeerd en vond consistenter tekorten in muizen na fototrombotisch beroerte 13,14. Onze resultaten tonen aan dat paw slepen in de cilinder lijkt na letsel aan de voorpoot sensorimotorische cortex en kan worden gerelateerd aan een verminderd vermogen om het gewicht te dragen van de aangedane poot en / of als gevolg van een verlies van sensorische ontvangst in de poot. De poot wordt waargenomen om contact met de muur te maken, maar lijkt niet te een ondersteunende houding handhaven of te helpen bij het afzetten van de muur, maar glijdt af in wat we een poot-drag noemen. We hebben waargenomen dat-poot te slepen gedrag treedt in bijna elk dier met een letsel aan de voorpoot sensomotorische cortex en het gaat om een zeer unieke patroon van gedrag, waardoor het heel sterk in het voorspellen van corticale letsel in zijn eigen rechts. In deze zin, poot-slepen is een nuttig instrument in een batterij van behavioral analyses. Het is de combinatie van een lage start-up kosten, gemakkelijke toediening van de test en de betrouwbaarheid van de poot slepen analyse-paw verslepen analyse van de cilindertest dergelijke aantrekkelijke keuze maakt voorspellen focale ischemische schade in de muis .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
We danken de heer John Crowell en de heer Terry Upshall om hun technische expertise en ondersteuning bij de fotografie en videografie. Dit werk werd ondersteund door exploitatiesubsidies voor JLV van de Canadese Institutes of Health Research en de Research en Development Corporation van Newfoundland en een Hart & Stroke Foundation van Canada Canadese Partnership for Stroke Recovery Catalyst subsidie. RBR was een ontvanger van een Keith Griffiths Memorial Heart & Stroke Foundation Graduate Scholarship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plexi-glass cylinder | 17.5 cm high, 9.5 cm outer diameter, 8.8 cm inner diameter, wall thickness 0.35 cm (or 3.5 mm) | ||
| viewing table | 54x56x66.5 cm (width x length x height), top of table is a 51x51 cm sheet of plexiglass. | ||
| mirror | 34x58 cm mirror | ||
| video camera | Sony | DCR-SR42 | Video camera with onboard storage, SD functionality, 40x optical zoom |
| computer | Dell | Optiplex 760 | Processor: Intel, 3.0 GHz, Memory 4.00GB (RAM) |
| computer monitor | Samsung | S22C350H | |
| Excel (Microsoft Office Professional Plus) | Microsoft | v14.0.7106.5003 | |
| VLC Media Player | Video LAN | v2.1.2 | Media player with playback speed modulation and video support |
| External Hard Drive | Western Digital | WDBAAU0020HBK-01 | 2 TB |
References
- Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).
- Kolb, B., et al. Growth factor-stimulated generation of new cortical tissue and functional recovery after stroke damage to the motor cortex of rats. J Cereb Blood Flow Metab. 27 (5), 983-997 (2007).
- Windle, V., et al. An analysis of four different methods of producing focal cerebral ischemia with endothelin-1 in the rat. Exp Neurol. 201 (2), 324-334 (2006).
- Roome, R. B., et al. A reproducible Endothelin-1 model of forelimb motor cortex stroke in the mouse. J Neurosci Methods. 233, 34-44 (2014).
- Tennant, K. A., Jones, T. A. Sensorimotor behavioral effects of endothelin-1 induced small cortical infarcts in C57BL/6 mice. J Neurosci Methods. 181 (1), 18-26 (2009).
- Wang, Y., Jin, K., Greenberg, D. A. Neurogenesis associated with endothelin-induced cortical infarction in the mouse. Brain Res. 1167, 118-122 (2007).
- Baskin, Y. K., Dietrich, W. D., Green, E. J. Two effective behavioral tasks for evaluating sensorimotor dysfunction following traumatic brain injury in mice. J Neurosci Methods. 129 (1), 87-93 (2003).
- Li, X., et al. Chronic behavioral testing after focal ischemia in the mouse: functional recovery and the effects of gender. Exp Neurol. 187 (1), 94-104 (2004).
- Clarke, J., Ploughman, M., Corbett, D. A qualitative and quantitative analysis of skilled forelimb reaching impairment following intracerebral hemorrhage in rats. Brain Res. , 204-212 (2007).
- Montoya, C. P., Campbell-Hope, L. J., Pemberton, K. D., Dunnett, S. B. The 'staircase test': a measure of independent forelimb reaching and grasping abilities in rats. J Neurosci Methods. 36 (2-3), 219-228 (1991).
- Farr, T. D., Whishaw, I. Q. Quantitative and qualitative impairments in skilled reaching in the mouse (Mus musculus) after a focal motor cortex stroke. Stroke. 33 (7), 1869-1875 (2002).
- Tennant, K. A., et al. The vermicelli and capellini handling tests: simple quantitative measures of dexterous forepaw function in rats and mice. J Vis Exp. (41), (2010).
- Clarkson, A. N., et al. AMPA receptor-induced local brain-derived neurotrophic factor signaling mediates motor recovery after stroke. J Neurosci. 31 (10), 3766-3775 (2011).
- Clarkson, A. N., Huang, B. S., Macisaac, S. E., Mody, I., Carmichael, S. T. Reducing excessive GABA-mediated tonic inhibition promotes functional recovery after stroke. Nature. 468 (7321), 305-309 (2010).
