Summary
Klassisk forbena asymmetri analyse av sylinderen test er rutinemessig brukes til å vurdere atferds underskudd i rotter etter hjerneskade eller slag; men ikke klarer å oppdage konsistente underskudd i mus. Denne studien viser at kvantifisering pote-flytte atferd er en mer sensitiv analyse av hjerneskade hos mus.
Abstract
Sylinderen testen rutinemessig brukt til å forutsi focal ischemisk skade på forbena motor cortex hos gnagere. Når plassert i sylinderen, gnagere utforske med oppdrett og berøre veggene i sylinderen med sine forbena poter for postural støtte. Etter iskemisk skade på forbena sensorisk cortex, rotter stole mer tungt på deres upåvirket forbena labben for postural støtte resulterer i færre innslag med sine berørte foten som betegnes forbena asymmetri. I motsetning til dette, focal ischemisk skade i musehjerne unnlater å resultere i sammenlign konsistente underskudd i forbens asymmetri. Mens forbena asymmetri underskuddene i enkelte tilfeller observert, trenger mus viser en ny atferd post hjerneslag kalt "paw-dra". Paw-dregging er tendensen for en mus å dra sin berørte foten langs sylinderveggen i stedet for direkte dytte bort fra veggen når du har gått av en bakre til en fire-legged holdning. Vi har tidligere demonstrert atpaw-dra oppførsel er svært følsom for små kortikale iskemiske skader på forbena motor cortex. Her gir vi en detaljert protokoll for pote-dra analyse. Vi definerer hva en pote-drag er og vise hvordan å kvantifisere pote-dra atferd. Sylinderen test er en enkel og billig test for å administrere og krever ikke forhåndstrening eller mat deprivasjon strategier. Ved å bruke pote-dra analyse med sylinderen test, det fyller en nisje for å forutsi kortikale iskemiske skader som photothrombosis og Endothelin-1 (ET-1) -indusert iskemi - to modeller som er stadig økende i popularitet og produsere mindre brennskader enn midt cerebral arterieokklusjon. Til slutt vil måle pote-dra oppførsel i sylinderen test tillater studier av funksjonell bedring etter kortikal skade ved bruk av et bredt kohort av transgene musestammer der forrige forbena asymmetri analyse har mislyktes i å oppdage konsistente underskudd.
Introduction
Målet med nevrale regenerering strategier er å vise både vev reparasjon og funksjonell bedring. Funksjonelle utvinning er vanligvis evaluert med atferds tester som måler funksjonelle underskudd, i dette tilfellet involverer motoriske ferdigheter som er forbundet med skade på bestemte områder av hjernen. Traumatisk hjerneskade eller iskemisk skade på sensorimotoriske forbena område av cortex kan demonstreres ved en rekke adferdstester. En slik test er sylinderen test i utstrakt bruk i rotter for å vurdere funksjonsproblemer i forbena aktivitet en. Testen har en lav set-up kostnader krever bare en sylinder, kamera og bord med en gjennomsiktig topp. Det er lett å administrere som den er basert på naturlig utforskende oppførsel av gnagere, så pre-trening og mat deprivasjon eller belønning er ikke nødvendig. Til tross for disse mange fordeler, er sylinderen test lite benyttet for å vurdere forbena underskudd i mus etter fokale skader på forbena sensorimotor cortex, som vi tillegger til analyse av muse oppførsel i sylinderen test. Forbena asymmetri er den klassiske måling av analyse for sylinderen test. Når plassert i sylinderen, gnagere naturlig utforske veggene i sylinderen ved stell på sine bakben og rørende sylinderveggene med sine forbena poter for postural balanse. Antallet labb berører med veggen med hver forbena lett kvantifiseres ved å filme gnagere i løpet av denne undersøkelse av sylinderen. Forbena asymmetri oppstår når påvirket forbena pote gjør færre elementer med veggen enn upåvirket forbena labben og er en indikasjon på skade på den kontralaterale sensorimotoriske cortex. Hos rotter intra-kortikale injeksjoner av vasoconstrictive agent, Endothelin (ET-1), inn forbena sensorisk cortex fører til et samlings iskemisk lesjon som resulterer i atferds underskudd i kontralaterale forbena. Underskudd i kontralateral forbena bruk er lett oppdages som endringer i forelimb asymmetri i sylinderen test i rotter 1-3. I motsetning til rotter imidlertid endringer i forbena asymmetri er variable og mindre konsekvent i mus etter sammenlign ET-1 injeksjoner 4-6. Her viser vi en ny analyse av forbena atferd i sylinderen test - analyse av pote-dra atferd. Vi har tidligere vist at pote-flytte-analyse er en mer følsom måling av skade på forbena sensorisk-cortex hos mus enn den klassiske forbena asymmetri analyse og derfor er anvendbar for en rekke knutepunkter kortikale skademodeller.
Undersøkelse av hvordan forpotens i kontakt med sylinderveggen følgende ischemisk skade på forbena sensorisk-cortex avslørt en ny adferd hos mus - pote-flytte 4. En pote-drag oppstår når en mus står på sine bakben å utforske sylinderveggen og deretter drar sin berørte (kontra angrepne) labben langs sylinderveggen mot sin midtlinjen eller ned veggen menssin upåvirket forepaw gir postural støtte mot veggen. Paw-slodder forekommer sjelden i uskadde mus derfor inntrykk av en pote-drag er en positiv indikator for skader på forbena sensorisk cortex 4. Vi har tidligere kvantifisert pote-dra oppførsel i mus etter ET-1 iskemisk skade på forbena sensorimotoriske cortex og har vist vedvarende pote-dra adferd hos mus opptil to uker etter hjerneslag fire. Her viser vi at labben trene atferd opprettholdes inntil fire uker etter hjerneslag. Analyse av pote-dra oppførsel tilveiebringer en ny og følsomt verktøy for å bedømme focal ischemisk skade på forbena sensorisk-cortex hos mus. Dens billig oppsett, enkel administrasjon og scoring gjør dette til en enkel, men nyttig verktøy for å vurdere raskt forbena adferdsmessige mangler hos mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etikk uttalelse: Alle forsøkene ble godkjent av Memorial University of Newfoundland Animal Care Ethics Committee i henhold til retningslinjene i den kanadiske Council on Animal Care.
1. Mus
- Bruk voksne mus. I denne studien ble voksen mann FVBN mus (n = 10) mellom 2-4 måneder anvendt. Huset mus på en 12:12 timers lys-mørke-revers syklus og gir standard gnagerfor og vann ad libitum.
2. Materialer som kreves for Cylinder Test
- Skaff en tabell med en gjennomsiktig topp å filme sylinderen test. Dimensjonene av tabellen er irrelevant, toppen må være plexiglass eller glass, og det må være tilstrekkelig plass til å plassere et speil under tabellen. Dette gjør det mulig for musen til å bli tatt opp på video nedenfra. Bruke et speil under bordet for å reflektere bildet gjennom sylinderen. Som et alternativ, kan du bruke en opp-ned-kamera hvis tilgjengelig. Dimensjonene av tabellen som brukes i denne protokollen er 54 x 56 x 66.5cm (wxlxh) med en 51 x 51cm øverst (BxL).
- Skaff et speil. Dimensjonene av speilet som brukes i denne protokollen er 34 x 58cm (BxL).
- Skaff en gjennomsiktig / plexiglass sylinder for musen til å utføre i. Dimensjonene av sylinderen som brukes i denne protokollen er 17.5cm høy, 8,8 cm ID, 9.5cm OD med en veggtykkelse på 0.35cm. En høyere sylinder kan være nødvendig for mer aktive musestammer.
- Plasser sylinderen på bordplaten og filme i speilet under.
- Et videokamera og stativ er påkrevd. Spille inn videoer på ca 650Kb / s, som er omtrent 190Mb per 5 min av sylinder video. Påse at kameraet har en zoom-funksjonalitet for å sikre at sylinderen omfatter hele synsfeltet.
MERK: videokamera som brukes i denne protokollen er et Sony DCR-SR42, 40x optisk zoom, 2,000x digital zoom, 680kpix som bruker standard definisjon, NTSC interlaced video). - Anskaffe programvare for analyse - en medie plAyer med videostøtte og avspillingshastigheten modulering. Mediespilleren som brukes i denne protokollen er VLC Media Player v2.1.2.
- Skaff en datamaskin med et operativsystem som kan kjøre mediespilleren og en skjerm.
- Elektronisk lagring for videoer er nødvendig. Last ned videoer til en ekstern harddisk eller kopiere den på DVD for langtidslagring.
MERK: På 190Mb per video, vil 84 økter passe på en 16 GB SD-kort og 168 sesjoner vil passe på en 32 GB SD-kort. På grunn av den relative inexpensiveness av SD media, og usikkerheten i hvor mye tid noen mus trenger for å fullføre 20 steiler, er en 32 GB-kort anbefales. I denne studien ble videoene kopiert fra kameraet til en 2TB ekstern harddisk og deretter recopied på DVD som backup.
3. Eksperimentell Oppsett av Cylinder Test
- Fest speil under bordet i en 45 graders vinkel i forhold til bordplaten. Gjør dette ved hjelp av to konsoller festet til bordben til SUPPORt toppen og bunnen av speilet, respektivt. Braketten steder er nevnt i en side-visning av tabellen (figur 1A) og et ansikt på visning av tabellen (figur 1B).
- Plasser sylinderen på midten av bordet. Tegn fire ekvidistante linjer der sylinderen sitter på bordet med en svart markør (Sharpie) slik at sylinderen kan løftes og returneres til den samme posisjon (figur 2). Trekker dem på undersiden av den transparente bord tillater bordplaten som skal rengjøres mellom dyreforsøk uten å oppløse markør blekk.
- Fest kamera og stativ. Rett kameraet mot speilet slik at bildet ser direkte gjennom løpet av sylinderen. Sikre at hele innerveggen av sylinderen er synlig og uhindret av basisen (figur 3). Se en side-på visning av oppsettet, inkludert den relative vinkel på kameraet og speil setup, ovenfra (Figur 4A) og franivå av bordet, inkludert en mus merden (figur 4B).
- Forbered sufflørkortene å identifisere hver mus før filming. Pass på at kortene inkluderer vanligvis et identifikasjonsnummer for hver mus, tids poenget med testen (f.eks., 3 dager etter behandling) og dato for filming økten. Inkluderer ikke behandlingsgruppen på cue kortet for å sikre eksperimentator er blindet.
- Film i standard belysning innendørs forhold som dette nivået av lys er nødvendig for å tydelig se musebevegelser rundt sylinderen.
MERK: Hvis tilgjengelig filming i mørket med et rødt lys kamera kan være nok, men man må først teste om labb innslag og drags er godt synlig for kvantifisering.
4. Execution
- Begynn å filme. Vise riktig muse cue kort foran kameralinsen.
- Senk mus inn i sylinderen fra den åpne toppen umiddelbart etter filming stikkordet kortet.
- Begynn å filme musen. Redusere støy i løpet av denne tiden, som musene kan miste interessen for å utforske Hvis forskrekket.
- Observere mus bak for å utforske sylinderen. Fange video før musen utfører et minimum av tjue steiler.
MERK: En bakre oppstår når begge forpotene mister kontakt med gulvet og musen står på bakbena. - Tørk tabletop og sylinder med et passende rengjøringsmiddel mellom hver mus for å rense og fjerne muse dufter.
- Frysing er når mus slutte å utforske og forbli rolig sitter på alle fire for ca 5 min. Hvis musene fryse før tyve steiler oppstår, kan det være nødvendig å fjerne dem fra sylinderen i 10-20 min før gjenopptar testen. Dersom musene ikke utfører tjue steiler, blir de fjernet fra studien.
MERK: I vår erfaring, mus har aldri trengte å bli ekskludert på grunn av manglende utforske sylinderen.
5. Evaluering av Cylinder Test ved hjelp Paw-TrekkingAnalyse
- Spille av video med en hastighet på mellom 0,25x og 0.67x vanlig hastighet avhengig av hvor raskt musen utforsker sylinderen. Bruk en mediespiller som tilbyr lavere avspillingshastigheter.
- Kvantifisere det totale antall paw innslag. Pote berører oppstår når musen steiler (figur 5a), berører siden av sylinderen (figur 5B), deretter dismounts med begge labber samtidig (figur 5C) og landområder (figur 5d). Labben kan eller ikke kan ta kontakt med sylinderveggen med en full flaten, men noen kontakt med sylinderveggen må skje. Vurdere pote innslag ved å telle antall ganger musen gjør kontakt (uansett hvor kort) med sylinderveggen med én eller begge forpotene mens stående på sine bakben under en bakre.
Vær oppmerksom på at kontakt med sylinderveggen er bare regnet som en "paw touch" eller "paw-dra" hvis musen er i en bakre posisjon - ståendepå sine bakben med begge forpotene av av bordplaten. Hvis musen er fortsatt i en 3-punkts holdning - både bakbena og en forepaw på bordplaten og fortsetter å berøre veggen med gratis labben - dette regnes ikke som en pote touch. Mus kan bak og berører sylinderveggen med et enkelt forepaw og dette regnes som en pote touch. Merk: en mus kan også bevege kroppen rundt sylinderen i løpet av en bakre, slik at mer enn to kontakter. Disse kontaktene er telt - ett for hver venstre forepaw touch og ett for hvert riktig forepaw touch. - Kvantifisere antallet paw-drags. Paw-dra oppførsel er forskjellig fra normale paw innslag.
- Hvis labb kontakter sylinderveggen med en full åpen håndflate (figur 6B), vil det sakte falle bort fra veggen, ofte med en svak skjelving. Bevegelsen begynner med sifrene dra mot sylinderveggen enten i en medial eller nedover, (figur 6C) før den falt bort completEly (figur 6D). Musen vil da stige med sin upåvirket labben (figur 6E) før landing på alle fire (figur 6F). Dette regnes som en pote-drag og skal regnes i en oversikt.
- Hvis labb ikke kontakt sylinderveggen med en helt åpen håndflate, vil det beiter sylinderveggen med sine tall før frafall fra sylinderveggen. Tilsvarende kan en mus dra labben mot sylinderveggen, men ikke slipp den helt før demontering. Disse er begge regnet pote-drar samt innslag og skal regnes som både i et telleapparat.
- Labben kan også dra langs sylinderveggen mens en mus utforsker sylinderen. I dette tilfellet vil labben følge vridning av musens torso som det tar for til venstre eller høyre av sin opprinnelige stilling (figur 7A-D) før demonteringen (figur 7E). Dette regnes ikke som en pote-drag, da det avhenger av musen tilfeldig valgten retning for å utforske og er ikke avhengig av hvilket kortikale halvkule ble skadet.
- Paw-drags er uttrykt som en prosentandel av pote-drags per totalt antall paw innslag under en sesjon. Uttrykke antall paw-drags i prosent av totale paw kontakter for hver forbena separat.
- Berører resulterer i en pote-drag telle som en pote-drag og en touch samtidig. Således, hvis en mus trekker labben hver gang labben i kontakt med sylinderveggen, er pote-flytte prosent uttrykt som 100%.
6. Andre Eksperimentell design forslag
- For å minimere unødvendige variabler:
- Test på mus på samme tid hver dag på testing. Test musene under våkne syklus. Holde-mus på en 12 timers lyssyklus omvendt letter ytelse.
- Mus kan være motvillige til å utforske den sylinder hvis understreket enten støy eller en roman miljø. Testing mus i deres dyr å holde rom eller et rom de har been kjent med reduserer stress. Dette kan skje hvis rommet er støyende, hvis musen har blitt hevet røsten før innreise sylinderen eller på grunn av tilvenning.
MERK: Testing bør utføres en gang før eksperimentell manipulasjon for å tjene som en baseline lesing. Etter manipulasjon, testing dager er på experimenter skjønn, men det anbefales å unngå en overdreven antall eksponeringer til sylinderen over en kort periode. - Mus kan bli motvillige til bak etter 6-7 eksponeringer til sylinderen. For denne studien ble musene testet i sylinderen for totalt sju ganger, før ischemi og på dagene 1, 3, 7, 14, 21 og 28 etter operasjonen.
MERK: I denne studien brukte vi FVBN musestamme. Vi har tidligere testet C57Bl / 6 mus i sylinderen og observerte paw-dra atferd etter en ET-1 iskemisk skade (data ikke vist). C57BL / 6-mus var mer aktive enn FVBN mus ved oppdrett og ofte hoppet på kanten av sylinderenfør klatring ut. Taller sylindere bør brukes hvis mus prøver å unnslippe ved å hoppe.
7. Endothelin-en kirurgi og infarktvolum Målinger
- Utfør Endothelin-en kirurgi og infarkt volummålinger i henhold til tidligere publiserte protokoller 4. Å målrette anterior forbena motor cortex, bør hver mus får tre ET-1 injeksjoner på følgende koordinater: (i) 0,7 anteriorposterior (AP) /1.5 medial-lateral (ml) / - 1.2 dorsal-ventral (DV), ( ii) 0,4 AP / 1,25 ml / - 1.2 DV og (iii) 0,1 AP / 1,75 ml / -1,2 DV 4.
8. Statistisk analyse
- En to-veis gjentatt tiltak variansanalyse (ANOVA) anbefales å analysere prosent av pote-dra for de berørte og upåvirket poter på tvers av ulike tidspunkter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har tidligere demonstrert at pote-flytte atferd synes å følge en focal ischemisk skade på forbena sensorimotoriske cortex og er en positiv indikator på skade på fire. Intra-kortikale injeksjoner av ET-1 i forbena sensorisk-cortex ble anvendt for å indusere en ischemisk lesjon (figur 8A, B). Denne studien undersøkte om pote-dra atferd utvidet i mer enn 14 dager etter skade for dens potensielle bruk for å vurdere funksjonell bedring. Mus ble testet i sylinderen test på dagen før ET-1 injeksjoner for pre-kirurgi tidspunkt, og på dagene 1, 3, 7, 14, 21 og 28 etter skade. På hvert tidspunkt, ble antall paw innslag og labb drags kvantifisert for både berørte og upåvirket labben. Toveis gjentatte tiltak ANOVA på antall paw innslag viste signifikante viktigste effektene av tid [F (6108) = 3,59, p = 0,0028] og fag [F (18108) = 2,38, p = 0,0032] men ingen effekt av behandling(Tabell 1). Mens du bruker standard analyse av forbena asymmetri for sylinderen test som kvantifiserer berørte foten berører versus totalt paw berører avslørt inkonsekvent forbena atferds underskudd. En enveis gjentatte tiltak ANOVA på prosent av berørte foten bruk viste en signifikant hovedeffekt av tid (p = 0,015), som etterfølges av Dunnetts post hoc test viste betydelige reduksjoner i prosent berørte foten bruk på 7, 14 og 21 dager etter -surgery og utvinnes av 28 dager etter operasjonen (Figur 8C). I motsetning til dette, en toveis repeterte målinger ANOVA på antall pote slodder viste signifikante hovedeffekter av tids [F (6,108) = 7,09, p <0,0001], behandling [F (1,108) = 33,02, p <0,0001], interaksjon [ F (6108) = 9,89, p <0,0001] og fag [F (18108) = 4,84, p <0,0001]. Videre Bonferroni post hoc-analyse viste betydelige økninger i antall pote sleper ved hvert tidspunkt etter operasjonen (Tabell 1). Tilsvarende er en toveis gjentatt tiltak ANOVA sammenligne antall berørte pote-drags versus totalt berørte foten berører viste signifikante viktigste effektene av tid [F (6108) = 6,63, p <0,0001], behandling [F (1108) = 20,46, p = 0,0003], samhandling [F (6108) = 8,21, p <0,0001] og fag (matching) [F (18108) = 7,35, p <0,0001]. Videre Bonferroni post hoc-analyse viste signifikant pote-dra atferd opp til 28 dager etter operasjonen (figur 8D). Labben trene atferd var bestemt til det berørte lem som ingen økning eller endring i pote-dregging ble observert med upåvirket lem. Paw-dra atferd med de berørte forepaw ble signifikant forhøyet på 1, 3, 7, 21 og 28 dager etter operasjonen (figur 8D). Paw-dra atferd nådde en dag etter operasjonen med> 30% av alle labb innslag med de berørte forbena resulterer i en pote-dra deretter falt til ~ 15% etter 3 dager etter kirurgi der den forble frem til og med 28 dager etter operasjonen. 28 dager etter kirurgi ble musene avlivet og infarktvolumene vurdert. Gjennomsnittet infarktvolum for konsernet var 3,2 ± 0,4 mikrometer 3 (n = 10 mus). Disse resultatene viser at små kortikale infarkter kan føre til betydelige og vedvarende adferdsmessige mangler som målt i sylinderen test. Oppsummert disse dataene viser at det ikke bare er labben trene svært responsive til skade på forbena sensorisk cortex, men at pote-dregging vedvarer også over tid, og kan brukes til å vurdere funksjonell bedring.
Figur 1. Bracket steder å feste speilet på plass under tabellen. (A) forfra tabell som viser brakett steder på forse beina på bordet. (A ') Høyere forstørrelse av innfelt i A som viser plasseringen av brakettene på forbena. (B) Sett bakfra av tabellen visering bakre beinet brakett steder. (B ') Høyere forstørrelse av innfelt i B indikerer braketten beliggenhet på bakbena av tabellen.
Figur 2. Merking stedet for sylinderen plassering på bordet. Bilde av bordplaten som indikerer plassering av sylinderen med svarte linjer trukket rundt omkretsen av bunnen. Pilene peker på de svarte linjer trukket på undersiden av pleksiglass som brukes til sentrering av sylinderen på bordplaten.
Figur 3. Fronten på kameraet og tabletop oppsett. Bilde av bordplaten viser siktlinje direkte gjennom sylinder (rød pil).
tynn-side = "always"> 
Figur 4. viser et sideriss av kameraet og bordet set-up. Kameraet er rettet direkte mot bunnen av sylinderen. (A) Tabell og kameraets innstillinger tatt ovenfra. (B) Tabell og kamera oppsett tatt på nivået av tabellen, viser en mus stell i sylinderen.
Figur 5. En sekvens av bilder som viser en uskadd mus oppdragelse (A) Bilde av en mus før en bakre.. (B) Musen berører sylinderveggen med begge poter. (C) For å demontere, vil musen presse mot sylinderveggen ved hjelp av begge poter, og (d) lande på alle fire poter. Lt = venstre muse labb, Rt = høyre muse labben.
Figur 6. En sekvens av bilder som viser en skadet mus pote-dregging. (A) Bilde av en mus før en bakre. (B) Musen vil berøre sylinderveggen med begge labbene; (C) deretter sakte la sifrene på berørte foten dra vertikalt ned sylinderveggen; (D) før la labben falle bort fra veggen. (E) Musen vil da stige med deres upåvirket labben og (F) landet på alle fire poter. Høy forstørrelse innfellinger i B, C og D demonstrere hvordan de berørte forpotens kontakter sylinderveggen. Lt = venstre muse pote.
Figur 7. En "non pote-drag". (A) Musen berører sylinderveggen med begge poter. (B) Musen vrir dens torso sideveis for å utforske sylinderveggen. (C) Musen re-posisjoner sin ledende forpotens til en ny posisjon sidelengs og drar sin avsluttende labb i samme retning. (D) Den etterfølgende labb er godt plantet i den nye plasseringen, og begge poter brukes til å demontere (E) for å gå tilbake til alle fire poter. Røde pilspisser indikerer plasseringen av poter på start- og sluttposisjonen. Røde pilen indikerer bevegelse av etterfølgende forepaw langs sylinderveggen.
Figur 8. Paw-dra atferd opprettholdes for fire uker etter et samlings cortical, iskemisk lesjon. (A) Representant ph otomicrograph av en cresylfiolett-farget koronale hjernen snitt gjennom en ET-1 iskemisk lesjon i 28 dager etter operasjonen. (B) Høyere forstørrelse av ET-1 lesjon i eske området i A. (C) Analyse av forbena asymmetri i sylinderen test etter en ET-1 iskemisk skade på forbena sensorimotor viser variable atferds underskudd. Dataene er uttrykt som middelverdi ± SEM. Middel ble analysert ved en-veis gjentatte målinger ANOVA avsløre en signifikant hovedeffekt av tiden (p = 0,015) og deretter etterfulgt av Dunnetts post hoc test for sammenligning alle midler til de midler før behandling. (D) Analyse av pote-dra oppførsel i sylinderen test avslører en forbena atferds underskudd opprettholdes inntil fire uker etter en ET-1-indusert iskemisk skade. Middel ble analysert ved to-veis gjentatte målinger ANOVA etterfulgt av Bonferroni posthoc test. (N = 10) * P <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52701/52701fig8large.jpg" target = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De viktigste punktene for å etablere når kvantifisere pote-dra oppførsel i sylinderen testen er følgende: i) kvantifisere antall pote-drags versus totalt paw innslag for hver pote før hjerneskade å etablere en baseline; ii) kvantifisere antallet paw-drags versus totalt paw innslag for hver pote etter iskemisk skade; og iii) skille mellom et pote-drag og sideveis bevegelse av labben langs sylinderveggen under sideveis dreining av musens torso.
Paw trene er en roman atferd som vises etter skade på forbena sensorisk cortex. Utseendet av pote-dra oppførsel kan derfor anvendes som en positiv indikator på at forbena sensorisk-cortex er blitt skadet. De representative Resultatene viser at små ET-1 infarkter ca 2-4 mm 3 i volum og lokalisert til forbena sensorisk cortex resultat i pote-dra atferd. Dette er i motsetning til forbena asymmetry analyse som ikke klarer å oppdage konsistente underskudd i prosent av berørte paw berører versus generelle innslag følgende ET-1 iskemiske kortikale skader 4-6. Analyse av pote-dra atferd er derfor mer sensitiv i å oppdage skader på forbena sensorisk cortex. Videre, fordi pote-flytte ble opprettholdt i opptil fire uker post-skade det kan også være egnet for å analysere gjenvinning av funksjon. Som vi tidligere har vist at pote-flytte oppførsel korrelerer med skade på forbena sensorisk-cortex 4, kan hvilket som helst antall skade modellene fordel i å ha denne analysen av sylinderen testen. Selv om store skader, slik som tilstopping av midtre cerebralarterie og traumatisk hjerneskade 7,8 V underskudd på klassisk forbena asymmetri analyse av sylinderen test disse mangler ofte løse over tid. I disse tilfeller pote-flytte, å være en mer følsom måling av skade på forbena sensorisk-cortex ville være useful påvise kronisk, mer subtile underskudd. Tilsvarende i skademodeller som viser mindre konsistente resultater med den klassiske forbena asymmetri analyse, ville pote-dra-analyse være nyttig for å avdekke mer konsistente atferds underskudd. Paw-dra analyse av sylinderen testen har brede programmer for en rekke iskemisk skade modeller, inkludert midten cerebral arterie okklusjon, photothrombosis, pial stripping og ET-1, som demonstrert her.
Det finnes en rekke forskjellige adferdstester som benyttes for å analysere forbena motoriske og sensoriske mangler etter skade i sensorimotoriske cortex. Den Montoya trapp test vurderer forbena nå og fatte atferd 9,10. Tilsvar enkelt pellet nå og pasta spise tester analysere fin motorisk aktivitet av potene og sifre 11,12. Forbena asymmetri analyse av sylinderen testen er forbundet med postural støtte når musen opp på sine bakben 1. Kun antallav kontakter hver pote danner med sylinderveggen blir kvantifisert. Hvor labben gjør kontakt ikke er undersøkt, og kan være ytterligere indikasjon på skade. Tidligere studier har kvantifisert varigheten av støtte fra hver forepaw touch og funnet flere konsistente underskudd i mus etter photothrombotic hjerneslag 13,14. Våre resultater viser at pote-dra i sylinderen vises følgende skader på forbena sensorimotoriske cortex og kan være relatert til en redusert evne til å støtte sin vekt med berørte foten og / eller på grunn av tap av sensorisk mottak i labben. Labben er observert å ta kontakt med veggen, men synes ikke å opprettholde en støttende holdning eller bistå i å skyve ut fra veggen, men heller sklir ut i det vi kaller en pote-drag. Vi har observert at pote-dra skjer i nesten alle dyr med en skade på forbena sensorimotoriske cortex og innebærer en svært unikt mønster av atferd, noe som gjør det ganske sterk i forutsi kortikal skade i sin egen right. I denne forstand er pote-dra et nyttig verktøy i et batteri av atferdsanalyser. Det er kombinasjonen av en lav kostnad oppstart, lette administrasjonen av testen, og påliteligheten av pote-flytte-analyse som gjør pote-flytte-analyse av sylinderen test et attraktivt valg for å forutsi focal ischemisk skade hos mus .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi takker Mr. John Crowell og Mr. Terry Upshall for sin tekniske ekspertise og hjelp med fotografering og videoopptak. Dette arbeidet ble støttet av driftstilskudd til JLV fra den kanadiske Institutes of Health Research og Forskning og Utvikling Corporation of Newfoundland og et hjerte og Stroke Foundation of Canada kanadiske Partnerskap for Stroke Recovery Catalyst stipend. RBR var en mottaker av en Keith Griffiths Memorial Heart & Stroke Foundation Graduate Scholarship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plexi-glass cylinder | 17.5 cm high, 9.5 cm outer diameter, 8.8 cm inner diameter, wall thickness 0.35 cm (or 3.5 mm) | ||
| viewing table | 54x56x66.5 cm (width x length x height), top of table is a 51x51 cm sheet of plexiglass. | ||
| mirror | 34x58 cm mirror | ||
| video camera | Sony | DCR-SR42 | Video camera with onboard storage, SD functionality, 40x optical zoom |
| computer | Dell | Optiplex 760 | Processor: Intel, 3.0 GHz, Memory 4.00GB (RAM) |
| computer monitor | Samsung | S22C350H | |
| Excel (Microsoft Office Professional Plus) | Microsoft | v14.0.7106.5003 | |
| VLC Media Player | Video LAN | v2.1.2 | Media player with playback speed modulation and video support |
| External Hard Drive | Western Digital | WDBAAU0020HBK-01 | 2 TB |
References
- Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).
- Kolb, B., et al. Growth factor-stimulated generation of new cortical tissue and functional recovery after stroke damage to the motor cortex of rats. J Cereb Blood Flow Metab. 27 (5), 983-997 (2007).
- Windle, V., et al. An analysis of four different methods of producing focal cerebral ischemia with endothelin-1 in the rat. Exp Neurol. 201 (2), 324-334 (2006).
- Roome, R. B., et al. A reproducible Endothelin-1 model of forelimb motor cortex stroke in the mouse. J Neurosci Methods. 233, 34-44 (2014).
- Tennant, K. A., Jones, T. A. Sensorimotor behavioral effects of endothelin-1 induced small cortical infarcts in C57BL/6 mice. J Neurosci Methods. 181 (1), 18-26 (2009).
- Wang, Y., Jin, K., Greenberg, D. A. Neurogenesis associated with endothelin-induced cortical infarction in the mouse. Brain Res. 1167, 118-122 (2007).
- Baskin, Y. K., Dietrich, W. D., Green, E. J. Two effective behavioral tasks for evaluating sensorimotor dysfunction following traumatic brain injury in mice. J Neurosci Methods. 129 (1), 87-93 (2003).
- Li, X., et al. Chronic behavioral testing after focal ischemia in the mouse: functional recovery and the effects of gender. Exp Neurol. 187 (1), 94-104 (2004).
- Clarke, J., Ploughman, M., Corbett, D. A qualitative and quantitative analysis of skilled forelimb reaching impairment following intracerebral hemorrhage in rats. Brain Res. , 204-212 (2007).
- Montoya, C. P., Campbell-Hope, L. J., Pemberton, K. D., Dunnett, S. B. The 'staircase test': a measure of independent forelimb reaching and grasping abilities in rats. J Neurosci Methods. 36 (2-3), 219-228 (1991).
- Farr, T. D., Whishaw, I. Q. Quantitative and qualitative impairments in skilled reaching in the mouse (Mus musculus) after a focal motor cortex stroke. Stroke. 33 (7), 1869-1875 (2002).
- Tennant, K. A., et al. The vermicelli and capellini handling tests: simple quantitative measures of dexterous forepaw function in rats and mice. J Vis Exp. (41), (2010).
- Clarkson, A. N., et al. AMPA receptor-induced local brain-derived neurotrophic factor signaling mediates motor recovery after stroke. J Neurosci. 31 (10), 3766-3775 (2011).
- Clarkson, A. N., Huang, B. S., Macisaac, S. E., Mody, I., Carmichael, S. T. Reducing excessive GABA-mediated tonic inhibition promotes functional recovery after stroke. Nature. 468 (7321), 305-309 (2010).
