Summary
Классический анализ передней конечности асимметрия испытания цилиндров обычно используется для оценки поведения дефицит у крыс после черепно-мозговой травмы или инсульта; Однако, это не удается обнаружить последовательные дефицита у мышей. Это исследование показывает, что поведение количественная лапы перетаскивание более чувствительны анализ мозговой травмы у мышей.
Abstract
Тест цилиндра обычно используется для прогнозирования локальной ишемии повреждение передней конечности в моторной коре грызунов. При размещении в цилиндре, грызуны исследовать по воспитанию и касаясь стенок цилиндра с их передних конечностей лапами за постуральной поддержки. После ишемического повреждения в передней конечности сенсомоторной коры крыс в большей степени опираться на их передних конечностей незатронутой лапы для осанки поддержки, в результате меньшего количества прикосновений с их пораженной лапой которая называется передних конечностей асимметрию. В противоположность этому, фокусное ишемического повреждения головного мозга мыши терпит неудачу, чтобы привести в сопоставимых последовательных дефицитов в передних конечностей асимметрии. В то время как дефицит передней конечности асимметрия наблюдается нечасто, мыши вы продемонстрировать новый поведение после инсульта называют "лапа-перетаскивание". Лапы-перетаскивание тенденция к мыши, чтобы перетащить его пострадавшего лапу по стенке цилиндра, а не непосредственно оттолкнуться от стены, когда демонтаж от задней к четвероногим позиции. Ранее нами было показано, чтолапа перетаскивания поведение весьма чувствителен к малым корковых ишемических повреждений в передней конечности моторной коры. Здесь мы предлагаем подробный протокол для лапы перетаскиванием анализа. Мы определяем, что лапы перетаскивания и продемонстрировать, как количественно лапу перетаскивания поведение. Тест цилиндр простой и недорогой тест, чтобы управлять, и не требуют предварительной подготовки или-стратегии лишение пищи. При использовании лапки перетаскивания анализ с тестом цилиндра, он заполняет нишу для прогнозирования корковых ишемических травм, таких как фототромбоза и эндотелина-1 (ET-1), индуцированного ишемией - двух моделей, которые когда-либо увеличивающихся в популярности, и производят меньше координационные травмы чем окклюзии средней мозговой артерии. Наконец, измерения лапу перетаскивания поведение в тесте цилиндров позволит исследования функционального восстановления после травмы, используя корковой широкий когорту трансгенных линий мышей, где предыдущий анализ передней конечности асимметрия не удалось обнаружить последовательной дефицита.
Introduction
Цель нейронных стратегий регенерации, чтобы продемонстрировать как восстановление тканей и функциональное восстановление. Функциональное восстановление обычно оценивается с поведенческими тестами, которые измеряют функционального дефицита, в этом случае с участием двигательных навыков, которые связаны с повреждением определенных областях головного мозга. Травматическое повреждение головного мозга или ишемическое повреждение сенсомоторной области передних конечностей коры может быть продемонстрировано с помощью ряда поведенческих тестов. Один такой тест, тест цилиндр широко используется в крыс для оценки функционального дефицита в передних конечностей деятельности 1. Тест имеет низкую наладки стоимость требующий только цилиндр, камеру и стол с прозрачной верхней. Это легко управлять, поскольку она основана на естественном исследовательское поведение грызунов, так предпродажную подготовку и лишение пищи или награды не требуется. Несмотря на эти многочисленные преимущества, тест цилиндр малоиспользуемых оценить дефицит передних конечностей у мышей после координационных травмы передних конечностей сensorimotor мозга, которые мы относим к анализу поведения мыши в тесте цилиндров. Передних конечностей асимметрия классическая мера анализа для теста цилиндра. При размещении в цилиндре, грызуны, естественно, исследовать стены цилиндра воспитания на их задних конечностей и касаясь стенок цилиндра с их передних конечностей лапами за постуральной баланса. Лапы прикосновений номер со стеной с каждым передних конечностей легко количественно съемок грызунов во время этого исследования цилиндра. Передних конечностей асимметрия возникает, когда затронуты передняя конечность лапа делает меньше штрихи к стене, чем непораженной передних конечностей лапы и указывает повреждения противоположной сенсомоторной коры. У крыс, внутри коры инъекции сосудосуживающего агента, эндотелина (ET-1), в передней конечности сенсомоторной коры приводит к локальной ишемии повреждение в результате чего нарушений поведения в контралатеральной передней конечности. Дефицит противоположной использования передних конечностей легко обнаружить, как изменения в Forelimb асимметрию в тесте цилиндров у крыс 1-3. В отличие от крыс однако, изменения в передних конечностей асимметрии являются переменными и менее последовательны в мышей после сопоставимых ET-1 инъекций 4-6. Здесь мы показываем, новый анализ поведения передних конечностей в тесте цилиндров - анализ лапы перетаскиванием поведения. Ранее мы показали, что лапы перетаскиванием анализ является более чувствительной мерой повреждения передних конечностей сенсомоторной коре у мышей, чем классического анализа асимметрии передней конечности и, следовательно, применима к различным корковых координационных моделей травмы.
Экспертиза того, как лапы контактов стенки цилиндра при ишемическом повреждения передней конечности сенсомоторной коры показало новый поведение у мышей - лапы тащит 4. Лапа перетащите происходит, когда мышь стоит на своих задних ногах, чтобы исследовать стенки цилиндра, то тащит его пораженный (Contra-поврежденной лапой) вдоль стенки цилиндра к его средней линии или вниз к стене,его неизменным лапка обеспечивает поддержку постуральной к стене. Лапы-драг редко встречаются в неповрежденных мышей поэтому появление лапы-перетаскивания положительным показателем повреждения передних конечностей сенсомоторной коры 4. Ранее мы уже количественно лапу перетаскивания поведение у мышей после ЭТ-1 ишемического повреждения в передних конечностей сенсомоторной коры и показали устойчивый лапу перетаскивания поведение у мышей до двух недель после инсульта 4. Здесь мы показываем, что лапа перетаскивания поведение поддерживается до четырех недель после инсульта. Анализ лапы перетаскивания поведения обеспечивает новый и чувствительный инструмент для оценки локальной ишемии повреждение передней конечности сенсомоторной коре у мышей. Его недорогой набор вверх, простота администрирования и забил сделать это простой, но полезный инструмент, чтобы быстро оценить передних конечностей поведенческие дефициты в мышах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Заявление по этике: Все эксперименты были одобрены Мемориального университета Комитета по этике ухода за животными Ньюфаундленда в соответствии с руководящими принципами Канадского совета по уходу за животными.
1. Мыши
- Используйте взрослых мышей. В этом исследовании были использованы взрослый мужчина FVBN мышей (п = 10) между 2-4 месяцев. Дом мышей на 12:12 часов обратного цикла свет-темнота и обеспечивают стандартный корм для грызунов и воду без ограничений.
2. Необходимые материалы для испытания цилиндров
- Получить таблицу с прозрачным верхом, чтобы снять тест цилиндров. Размеры таблице значения, верх должен быть из плексигласа или стекла, и должно быть достаточно места, чтобы расположить зеркало ниже таблице. Это позволяет мыши, чтобы быть на видеопленку снизу. Используйте зеркало ниже таблице, чтобы отразить изображение через цилиндр. В качестве альтернативы, используйте перевернутый камеру, если имеется. Размеры стола, используемые в настоящем Протоколе 54 х 56 х 66.5cm (ШхДхВ) с 51 х 51см (верхней WXL).
- Получить зеркало. Размеры зеркала, используемые в настоящем Протоколе 34 х 58см (ШхД).
- Получить прозрачный плексиглас / цилиндр для мыши для выполнения в. Размеры цилиндра, используемые в настоящем Протоколе 17,5 высокой, 8.8cm ID, 9.5cm ОД с толщиной стенки 0.35cm. Выше цилиндра может потребоваться для более активных штаммов мыши.
- Поместите цилиндр на стол и снять свое отражение в зеркале ниже.
- Видеокамеры и штатив не требуется. Запись видео в примерно 650Kb / с, что примерно 190Mb за 5 мин цилиндра видео. Убедитесь, что камера имеет функции масштабирования, чтобы убедиться, что цилиндр охватывает все поле зрения.
ПРИМЕЧАНИЕ: видеокамера используется в данном протоколе является Sony DCR-SR42, 40x оптический зум, цифровой зум 2,000x, 680kpix который использует стандартное определение, NTSC видео с чересстрочной разверткой). - Получить программное обеспечение для анализа - медиа плАйер с поддержкой видео и скорости воспроизведения модуляции. Медиа-плеер используется в данном протоколе является v2.1.2 VLC Media Player.
- Получить компьютер с операционной системой, способной работать в медиа-плеер и монитор.
- Электронное хранение видео требуется. Скачать видео на внешний жесткий диск или скопировать его на DVD-диски для долгосрочного хранения.
ПРИМЕЧАНИЕ: В 190Mb на видео, 84 сессий будет соответствовать на GB SD карты 16 и 168 сессий будет соответствовать на SD карту 32 ГБ. Из-за относительной дешевизны УР СМИ, и неопределенность в том, как много времени некоторые мыши требуют, чтобы завершить 20 тылы, 32 Гб карта рекомендуется. В текущем исследовании, видео были скопированы с камеры на 2 Тб внешний жесткий диск, а затем переписал на DVD-диски в качестве резервного.
3. Экспериментальная установка Теста цилиндров
- Закрепите зеркало ниже таблице под углом 45 градусов к поверхности стола. Сделать это, используя две скобы поддержки, прикрепленные к ногам стол для Supporт верхнюю и нижнюю часть зеркала, соответственно. Места для кронштейна отмечены в боковой вид на таблицы (рис 1А) и номинальной-обозрения таблицы (рис 1B).
- Поместите цилиндр на центре стола. Нарисуйте четыре равноудаленные линии, где цилиндр сидит на столе с черным маркером (Шулера), так что цилиндр может быть поднят и вернулся на то же место (рис 2). Рисунок их на нижней стороне прозрачной столешницей позволяет настольный быть очищены от тестов на животных без растворения маркера чернила.
- Прикрепите камеру и штатив. Направьте камеру на зеркало так, чтобы картинка, глядя прямо через ствол цилиндра. Убедитесь, что полный внутренняя стенка цилиндра видна и беспрепятственно от основания (рис 3). См вид сбоку-на настройки, в том числе относительного угла установки камеры и зеркала, сверху (рис 4А) и отУровень таблицы, в том числе мыши выращивания (фиг.4В).
- Подготовьте ключевые карты для идентификации каждого мышь до съемок. Убедитесь, что карты, как правило, включают в себя идентификационный номер для каждой мыши, время-точка испытания (например., Через 3 дня после лечения) и дату съемки сессии. Не включать группу лечения на бильярдном карты, чтобы гарантировать экспериментатор ослеплен.
- Фильм в стандартных внутренних условиях освещения, как этого уровня света требуется четко видеть движения мыши вокруг цилиндра.
ПРИМЕЧАНИЕ: При наличии съемок в темноте с камеры красного света может быть достаточно, однако можно было бы в первую очередь необходимо проверить, является ли лапа штрихи и тащит явно открыты для количественного определения.
4. Выполнение
- Начало съемок. Отображение соответствующего мыши кий карту перед объективом камеры.
- Опустите курсор в цилиндр с открытым верхом сразу после съемок кий карту.
- Начните съемок мыши. Минимизировать шум в течение этого времени, а мыши могут потерять интерес в изучении, если поражен.
- Соблюдайте мышей тыл, чтобы исследовать цилиндр. Захват видео, пока мышь не выполняет минимум двадцать тылам.
ПРИМЕЧАНИЕ: задний происходит, когда оба передние лапы теряют контакт с полом и мыши стоит на задних лапах. - Протрите столешницы и цилиндр с соответствующим чистящим раствором между каждой мыши, чтобы дезинфицировать и удалить запахи мыши.
- Замораживание, когда мыши остановить изучение и остаются спокойно сидеть на четвереньках течение примерно 5 минут. Если мышей заморозить до возникновения двадцать задние, это может быть необходимо, чтобы удалить их из цилиндра в течение 10-20 мин перед возобновлением тест. Если мыши не выполнять двадцать тылы, они удаляются из исследования.
ПРИМЕЧАНИЕ: В нашем опыте, мышей никогда не нужно быть исключены из-за отказа посетить цилиндр.
5. Оценка Теста цилиндров с помощью перетаскивания PawАнализ
- Воспроизведение видео со скоростью между 0.25X и 0.67x обычной скоростью в зависимости от того, как быстро мыши исследует цилиндр. Используйте медиа-плеер, который предлагает более низкую скорость воспроизведения.
- Количественно общее количество лап прикосновений. Подушечки штрихи возникают, когда задние мыши (фиг.5А), прикасается к стороне цилиндра (фиг.5В), затем отключает с обеих лап одновременно (5С) и земель (рис 5D). Лапа может или не может связаться со стенкой цилиндра с полным ладони, но некоторые контакта со стенкой цилиндра должно происходить. Оценка лапы штрихи от не подсчета количества раз мышь вступает в контакт (независимо от того, как краткое) со стенкой цилиндра с одного или обоих передних лапах, стоя на задних конечностей во время сзади.
Обратите внимание, что контакт со стенкой цилиндра Обновляется как "лапы ощупь" или "лапа-сопротивления", если мышь находится в заднем положении - стояна задних конечностях с обеих передних лап офф столешницы. Если мышь остается в 3-точка позиции в - обе задние конечности и один переднюю лапу на столе и продолжается коснуться стены со свободным лапы - это не считается лапы ощупь. Мыши могут задней и коснуться стенки цилиндра с одной передней лапы, и это засчитывается как лапы ощупь. Примечание: мышь также может двигаться свое тело вокруг цилиндра во время сзади, что делает более двух контактов. Эти контакты подсчитаны - по одному для каждой передней лапы ощупь левой и один для каждого правой передней лапы ощупь. - Количественно число лапы тащит. Лапы перетаскивания поведение отличается от обычных лап прикосновений.
- Если лапы контактов стенки цилиндра с полным открытой ладонью (рис 6В), он будет медленно падать от стены, часто с небольшим тремором. Движение начинается с цифр перетаскивания против стенки цилиндра или в медиальной или вниз (рис 6C), прежде чем упасть от CompletЭли (рис 6D). Мышь будет демонтировать с незатронутой лапы (рис 6E) до посадки на четвереньках (рис 6F). Это считается лапы и перетащить должны учитываться в подсчете.
- Если лапа не касалась стенки цилиндра с полностью открытой ладонью, он будет пасти стенки цилиндра с его цифр, прежде чем упасть от стенки цилиндра. Точно так же, возможно, мышь перетащите его лапу к стене цилиндра, но не освободить его полностью прежде, чем демонтаж. Они оба считаются лапы тащит, а также затрагивает и должны учитываться и как в подсчет.
- Лапа может перетащить на стенки цилиндра, а мышь исследует цилиндр. В этом случае, лапа будет следовать скручивание туловища мыши, как она исследует влево или право от своего первоначального положения (рис 7А-D) перед разборкой (рис 7E). Это не считается лапу-сопротивления, так как это зависит от случайного выбора мышиНаправление, чтобы исследовать и не зависит от которого была повреждена кортикальной полушарии.
- Подушечки-тащит выражены в процентах от лапы-за таскает общего количества лап прикосновений во время сеанса. Экспресс число лапы тащит в процентах от общего объема лапы контактов для каждого отдельно передней конечности.
- Прикосновения результате в лапы-сопротивления считаться лапы-сопротивления и одновременно оттенком. Таким образом, если мышь тащит лапу каждый раз лапой контакты стенки цилиндра, лапа-перетаскивания процент выражается как 100%.
6. Дополнительные предложения Экспериментальный дизайн
- Чтобы свести к минимуму посторонние переменные:
- Испытание мышей одновременно на каждый день тестирования. Проверьте мышей во время бодрствования цикла. Ведение мышей на 12 ч фара цикла облегчает работу.
- Мыши могут неохотно исследовать цилиндр, если подчеркнул либо шумов или новой среде. Тестирование мышей в своей животной выдержки комнате или комнате они бееп ознакомился с уменьшает стресс. Это может произойти, если номер шумно, если мышь была толкались перед входом в цилиндр или из-за привыкания.
Примечание: Тестирование следует проводить один раз перед экспериментальной манипуляции, чтобы служить в качестве базового чтения. После манипуляций, тестирование дни по усмотрению экспериментатора, хотя это рекомендуется, чтобы избежать чрезмерного количества экспозиций в цилиндр в течение короткого периода времени. - Мыши могут стать неохотно задней через 6-7 экспозиций в цилиндре. В текущем исследовании, мыши были протестированы в цилиндре в общей сложности семь раз, до ишемии и на 3, 7, 14, 21 и 28 после операции дни 1,.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании мы использовали штамм FVBN мыши. Ранее мы тестировали мышей C57BL / 6 в цилиндре и наблюдаемой лапы перетаскивания поведение после ЕТ-1 ишемического повреждения (данные не показаны). C57BL / 6 мышей были более активны, чем FVBN мышей при выращивании и часто прыгнули на обод цилиндраперед восхождением из. Taller цилиндры должны быть использованы, если мышей пытаются убежать, прыгнув.
7. эндотелина-1 Хирургия и инфаркта Объем Измерения
- Выполните эндотелина-1 операцию и измерения объема инфаркта согласно ранее опубликованным протоколам 4. Чтобы настроить таргетинг на передней передней конечности двигателя мозга, каждая мышь должны получить три ET-1 инъекции в следующих координатах: (я) 0,7 anteriorposterior (AP) /1.5 медиальной-боковой (мл) / - 1,2 спинной-вентральной (DV), ( II) 0,4 AP / 1,25 мл / - 1.2 Д.В. и (III) 0,1 AP / 1,75 мл / -1.2 Д. 4.
8. Статистический анализ
- Двусторонний повторные измерения дисперсионного анализа (ANOVA) рекомендуется проанализировать процентов лапы перетаскивания для пострадавших и не пострадавших лапы в различных временных точках.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ранее мы показали, что лапы перетаскивания поведение появляется после локальной ишемии повреждение передних конечностей сенсомоторной коры и является положительным показателем повреждения 4. Intra-кортикальные инъекции ET-1 в передней конечности сенсомоторной коры были использованы для индуцирования ишемического поражения (фиг.8А, В). Это исследование изучило, распространяется ли лапа перетаскивания поведение дольше, чем 14 дней после травмы для его потенциальное использование для оценки функционального восстановления. Мыши были испытаны в тесте на цилиндр за день до ЕТ-1 инъекций для момента времени перед операцией, так и на 3, 7, 14, 21 и 28 после травмы дни 1,. В каждый момент времени, количество лап прикосновений и подушечки тащит количественно как для пораженной и непораженной лапы. Два пути повторил меры ANOVA по количеству лап прикосновений выявлены значительные основные эффекты времени [F (6108) = 3,59, р = 0,0028] и предметы [F (18108) = 2,38, р = 0,0032], но никакого эффекта лечения(Таблица 1). В то время как, используя стандартный анализ передних конечностей асимметрии для испытания цилиндров, которые количественно пострадавших лап штрихи по сравнению с общей лап прикосновений показал противоречит передних конечностей поведенческие дефициты. Односторонний повторные меры ANOVA на процент пораженной использования лапы выявлено значительное главный эффект времени (р = 0,015), который с последующим тестом постфактум Даннетта показали значительное снижение в процентном пострадавшего использования лапы на 7, 14 и 21 дней поста -surgery и восстановлены 28 дней после операции (рис 8в). В отличие от этого, два пути повторяется ANOVA меры по числу лапы тащит выявлены значительные основные эффекты времени [F (6108) = 7,09, p <0,0001], лечение [F (1,108) = 33,02, p <0,0001], взаимодействие [ F (6108) = 9,89, p <0,0001] и предметы [F (18108) = 4,84, p <0,0001]. Кроме того Бонферрони постфактум анализ показал значительное увеличение числа лапы тащит в каждый момент времени после операции (таблица 1), Точно так же, двусторонний повторяется ANOVA меры, сравнивающие количество пострадавшего лапы-тащит против общего пострадавших лап прикосновений выявлены значительные основные эффекты времени [F (6108) = 6,63, р <0,0001], лечение [F (1,108) = 20,46, р = 0,0003], взаимодействие [F (6108) = 8,21, р <0,0001] и субъекты (соответствие) [F (18108) = 7,35, р <0,0001]. Кроме того Бонферрони постфактум анализ показал значительное лапу перетаскивания поведение до 28 дней после операции (рис 8D). Поведение лапы перетаскиванием конкретно к пораженной конечности, как без увеличения или изменения лапы проволочек наблюдалось с непораженной конечности. Лапы перетаскивания поведение с пораженной лапы была значительно выше в 1, 3, 7, 21 и 28 дней после операции (рис 8D). Лапы перетаскивания поведение достиг 1 день после операции с> 30% всех лап штрихи с пораженной передней конечности в результате чего лапы-сопротивления затем упала до ~ 15% при 3-х дней после операции, где он оставался вплоть до 28 дней после операции. В 28 дней после операции, мышей умерщвляли и объемы инфаркта оценены. Среднее инфаркта объем для группы составила 3,2 ± 0,4 мкм 3 (N = 10 мышей). Эти результаты показывают, что малые корковые инфаркты могут привести к значительным и устойчивым дефицитом поведенческих как измерено в тесте цилиндров. Таким образом, эти данные показывают, что не только лапы перетаскиванием высокое быстродействие к повреждению передней конечности сенсомоторной коры, но лапы перетаскивание также сохраняется в течение долгого времени, и может быть использован для оценки функционального восстановления.
Рисунок 1. места для кронштейна для крепления зеркала в месте ниже таблице. (A) вид спереди таблица, показывающая местоположения кронштейна на передних ногах таблицы. (') Высшее Увеличение вставке в показ расположения скобках передних ног. (Б) Вид сзади таблице, показывают,ING задние места нога кронштейна. (В ') Высшее Увеличение вставке в B указанием кронштейн место на задних ногах таблицы.
Рисунок 2. Маркировка места расположения цилиндров на столе. Фотография столешницу с указанием размещение цилиндра с черными линиями по периметру основы. Стрелки указывают на черных линий, проведенных на нижней стороне оргстекла, используемых для центровки цилиндра на столе.
Рисунок 3. Вид спереди камеры и настольный набор. Фото столешницы, демонстрируя линии визирования непосредственно через ствол цилиндра (красная стрелка).
тонкий страницах = "всегда"> 
Рисунок 4. Вид сбоку камеры и таблицы настройки. Камера направлена прямо на основания цилиндра. () Таблица и установки камеры взяты из выше. (B), стол и настройки камеры принято на уровне стола, показывая воспитание мыши в цилиндре.
Рисунок 5. Последовательность фотографий, демонстрирующих неповрежденную воспитание мыши. () Фото мыши до задней. (Б) мыши касается стенки цилиндра с обеих лап. (С) Для демонтажа, мыши нажать на стенки цилиндра, используя обе лапы, и (D) земли, на всех четырех лапах. Левая лапа Lt = мыши, правая лапа RT = мыши.
Рисунок 6. Последовательность фотографий, демонстрирующих раненого мыши лапой перетаскивания. () Фото мыши до задней. (B), мышь будет касаться стенки цилиндра с обеих лап; (С), то медленно пусть цифры на пораженной лапы сопротивления вертикально вниз стенке цилиндра; (D), прежде чем дать лапу отпасть от стены. (Е) мышь будет выйти вместе с незатронутой лапы и (F) земли на всех четырех лапах. Высокое увеличение вставки в B, C и D показывают, как пострадавшие передних лап контакты стенки цилиндра. Левая лапа Lt = мыши.
Рисунок 7. А 'не лапа перетащите ». (А) Мышь касается стенки цилиндра с обеих лап. (Б) мыши поворачивает его туловище с боков, чтобы исследовать стенки цилиндра. (С) мышка-позиции лидирующие лапы к новой позиции в боковом и тащит его завершающий лапу в том же направлении. (D), уступая лапа прочно посадил в своем новом месте, и оба лапы используются для отключения (E), чтобы вернуться на все четыре лапы. Красные стрелки указывают расположение лап на начальных и конечных положениях. Красная стрелка указывает перемещение задней переднюю лапу по стенке цилиндра.
Рисунок 8. Лапы перетаскивания поведение сохраняется в течение 4 недель после координационного корковых, ишемического поражения. () Представитель тел otomicrograph из крезил фиолетово-окрашенной корональной разделе мозга через ET-1 ишемического поражения в 28 дней после операции. (Б) Высшее увеличения в ET-1 поражением коробочной области в с. (С) Анализ передних конечностей асимметрии в тесте цилиндров следующей ЕТ-1 ишемической травмы передних конечностей сенсомоторной показывает переменные поведенческие дефициты. Данные выражены в виде среднего ± SEM. Средства были проанализированы с помощью одностороннего дисперсионного анализа повторных измерений, раскрывающих значительное Основной эффект времени (р = 0,015), а затем следуют апостериорный тестом Даннетта сравнению все средства для средств перед обработкой. (D) Анализ лапы перетаскиванием поведения в тесте цилиндра показывает передней конечности поведенческий дефицит, поддерживается до четырех недель после ЕТ-1-индуцированного ишемического повреждения. Средства были проанализированы с помощью двусторонней повторных измерений ANOVA с последующим тестом Бонферрони posthoc. (П = 10) * Р <0,05, ** Р <0,01, *** р <0,001.F = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52701/52701fig8large.jpg" цель = "_ пустое"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ключевые моменты, чтобы установить, когда количественного лапу перетаскивания поведение в тесте цилиндра следующее: я) определить число лапы-тащит против общего лап штрихи для каждой лапе перед черепно-мозговой травмой, чтобы установить базовый; II) определить число лапы тащит против общего лап штрихи для каждой лапе после ишемического повреждения; и III) различать лапу-сопротивления и бокового движения лапы вдоль стенки цилиндра во время вращения боковой части туловища мыши.
Лапы-перетаскивание роман поведение, которое появляется после повреждения передней конечности сенсомоторной коры. Появление лапы перетаскивания поведение, следовательно, может быть использован в качестве положительного индикатора, сенсомоторной коре передней конечности была повреждена. Представительные результаты показывают, что малые ET-1 инфаркты примерно 2-4 мм 3 в объеме и локализованные в передней конечности сенсомоторной коры результате в лапы перетаскиванием поведения. Это в отличие от передних конечностей асимметрия анализ, который не удается обнаружить в соответствии дефицит в процентах пострадавших лап прикосновений по сравнению с общими штрихами следующего ET-1 ишемических повреждений коры 4-6. Анализ лапы перетаскиванием поведения, следовательно, более чувствительны в обнаружении повреждения передней конечности сенсомоторной коры. Кроме того, из-за лапы перетаскивание поддерживалась до четырех недель после травмы она может также быть пригодны для анализа восстановление функции. Как мы уже ранее показали, что лапы перетаскиванием поведение коррелирует с повреждением передней конечности сенсомоторной коры 4, любое количество моделей травмы может извлечь выгоду в том, этот анализ теста цилиндра. Хотя больших травмах, таких как окклюзии средней мозговой артерии и травматическое повреждение мозга 7,8 шоу дефицитов на классического анализа асимметрии передней конечности теста цилиндра, эти дефициты часто устранить с течением времени. В этих случаях, лапы перетаскиванием, будучи более чувствительной мерой повреждения передней конечности сенсомоторной коры будет usefuл в обнаружении хронических, более тонкие дефициты. Аналогичным образом, в модели травмы, которые показывают менее последовательные результаты с классического анализа передней конечности асимметрии, лапы перетаскиванием анализ будет полезен в обнаружении более последовательные поведенческие дефициты. Лапы перетаскивания анализ теста цилиндра имеет широкое применение для различных ишемических моделях травмы, включая окклюзии средней мозговой артерии, фототромбоза, мягкой мозговой оболочки и зачистки ET-1, как показано здесь.
Есть множество поведенческих тестов, используемых для анализа передних конечностей моторные и сенсорные дефициты следующие травмы сенсомоторной коры. Тест Монтойя лестница оценивает достижения передней конечности и, схватив поведения 9,10. Аналогично один осадок достижения и макаронные испытания в еде анализировать мелкую моторику активности лапами и цифр 11,12. Передних конечностей анализ асимметрии теста цилиндра связан с постуральной поддержку, когда мышь на задних конечностях 1. Только номерконтактов друг с лапой делает стенки цилиндра количественно. Как лапа делает контакт не рассматривается и может быть дополнительно свидетельствует ущерба. Предыдущие исследования количественно продолжительность поддержку каждого передней лапы ощупь и найти более последовательного дефицита у мышей после инсульта фототромботической 13,14. Наши результаты показывают, что лапы перетаскиванием в цилиндре появляется после повреждения передних конечностей сенсомоторной коры и может быть связано с пониженной способностью поддерживать его вес с пораженной лапой и / или из-за потери сенсорной приеме в лапу. Лапа наблюдается в контакт со стенкой, но, кажется, не поддерживать благоприятную позицию или оказания помощи в отталкивании от стены, а соскальзывает в том, что мы называем лапы перетащить. Мы заметили, что лапа перетаскивания происходит почти каждого животного с повреждением передней конечности сенсомоторной коры и включает в себя уникальный образец поведения, что делает его достаточно сильным в прогнозировании корковой травмы в своей гIGHT. В этом смысле, лапа-перетаскивание является полезным инструментом в батарее поведенческих анализов. Это сочетание низкой пускового стоимости, легкости введения испытуемого и надежность лапы перетаскивания анализа, что делает лапы перетаскиванием анализа тестируемого цилиндра например привлекательным для прогнозирования фокусное ишемического повреждения у мышей ,
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Acknowledgments
Мы благодарим г-на Джона Кроу и Терри Upshall их технической экспертизы и помощи с фотографией и видеосъемка. Эта работа была поддержана операционной гранты JLV из Канадского института исследований в области здравоохранения и научных исследований и разработок корпорации Ньюфаундленда и сердце и инсульта Фонда Канады канадского партнерства для хода восстановления катализатора гранта. RBR был получателем Кейт Гриффитс Мемориал сердца и инсульта Фонд Высшей стипендии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plexi-glass cylinder | 17.5 cm high, 9.5 cm outer diameter, 8.8 cm inner diameter, wall thickness 0.35 cm (or 3.5 mm) | ||
| viewing table | 54x56x66.5 cm (width x length x height), top of table is a 51x51 cm sheet of plexiglass. | ||
| mirror | 34x58 cm mirror | ||
| video camera | Sony | DCR-SR42 | Video camera with onboard storage, SD functionality, 40x optical zoom |
| computer | Dell | Optiplex 760 | Processor: Intel, 3.0 GHz, Memory 4.00GB (RAM) |
| computer monitor | Samsung | S22C350H | |
| Excel (Microsoft Office Professional Plus) | Microsoft | v14.0.7106.5003 | |
| VLC Media Player | Video LAN | v2.1.2 | Media player with playback speed modulation and video support |
| External Hard Drive | Western Digital | WDBAAU0020HBK-01 | 2 TB |
References
- Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).
- Kolb, B., et al. Growth factor-stimulated generation of new cortical tissue and functional recovery after stroke damage to the motor cortex of rats. J Cereb Blood Flow Metab. 27 (5), 983-997 (2007).
- Windle, V., et al. An analysis of four different methods of producing focal cerebral ischemia with endothelin-1 in the rat. Exp Neurol. 201 (2), 324-334 (2006).
- Roome, R. B., et al. A reproducible Endothelin-1 model of forelimb motor cortex stroke in the mouse. J Neurosci Methods. 233, 34-44 (2014).
- Tennant, K. A., Jones, T. A. Sensorimotor behavioral effects of endothelin-1 induced small cortical infarcts in C57BL/6 mice. J Neurosci Methods. 181 (1), 18-26 (2009).
- Wang, Y., Jin, K., Greenberg, D. A. Neurogenesis associated with endothelin-induced cortical infarction in the mouse. Brain Res. 1167, 118-122 (2007).
- Baskin, Y. K., Dietrich, W. D., Green, E. J. Two effective behavioral tasks for evaluating sensorimotor dysfunction following traumatic brain injury in mice. J Neurosci Methods. 129 (1), 87-93 (2003).
- Li, X., et al. Chronic behavioral testing after focal ischemia in the mouse: functional recovery and the effects of gender. Exp Neurol. 187 (1), 94-104 (2004).
- Clarke, J., Ploughman, M., Corbett, D. A qualitative and quantitative analysis of skilled forelimb reaching impairment following intracerebral hemorrhage in rats. Brain Res. , 204-212 (2007).
- Montoya, C. P., Campbell-Hope, L. J., Pemberton, K. D., Dunnett, S. B. The 'staircase test': a measure of independent forelimb reaching and grasping abilities in rats. J Neurosci Methods. 36 (2-3), 219-228 (1991).
- Farr, T. D., Whishaw, I. Q. Quantitative and qualitative impairments in skilled reaching in the mouse (Mus musculus) after a focal motor cortex stroke. Stroke. 33 (7), 1869-1875 (2002).
- Tennant, K. A., et al. The vermicelli and capellini handling tests: simple quantitative measures of dexterous forepaw function in rats and mice. J Vis Exp. (41), (2010).
- Clarkson, A. N., et al. AMPA receptor-induced local brain-derived neurotrophic factor signaling mediates motor recovery after stroke. J Neurosci. 31 (10), 3766-3775 (2011).
- Clarkson, A. N., Huang, B. S., Macisaac, S. E., Mody, I., Carmichael, S. T. Reducing excessive GABA-mediated tonic inhibition promotes functional recovery after stroke. Nature. 468 (7321), 305-309 (2010).
