השימוש ברזולוציה גבוהה אינפרא אדום תרמוגרפיה (HRIT) לחקר הקרח נוקלאציה וקרח רביה בצמחים

Introduction

טמפרטורות מקפיאות המתרחשות כאשר צמחים גדלים באופן פעיל יכול להיות קטלני, במיוחד אם המפעל יש סובלנות הקפאה קטנה או לא. יש אירועים כאלה לעתים קרובות כפור השפעות הרסניות על ייצור חקלאי וגם יכולים לשחק תפקיד חשוב בעיצוב מבנה קהילה באוכלוסיות טבעיות של צמחים, במיוחד באלפיני, מערכות אקולוגיות תת-ארקטי והארקטי ^1-6. פרקים של כפור האביב החמור היו השפעות עיקריות על ייצור פירות בארה"ב ובדרום אמריקה בשנים האחרונות ^7-9 והוחמרו על ידי ההתפרצות המוקדמת של מזג אוויר חם ואחרי טמפרטורות נמוכות ממוצעים אופייניות יותר. מזג האוויר החם גורם לתחילת ניצנים לשבור, הפעלת הצמיחה של יורה, עלים, פרחים וחדשים שכולן יש מעט מאוד לא סובלנות כפור ^1,3,10-12. דפוסי מזג אוויר בלתי יציבים כגון דווחו להיות השתקפות ישירה של שינויי האקלים מתמשכים וצפויים להיות דפוס מזג אוויר משותף לforesעתיד eeable ^13. מאמצים כדי לספק טכניקות חסכוניות, יעילות, וידידותיות לסביבה ניהול או להגנת הצומח שיכול לספק סובלנות כפור מוגברת היו הצלחה מוגבלת לשורה של סיבות, אבל זה יכול להיות מיוחס בחלקה לאופי המורכב של הקפאת סובלנות והקפאת מנגנוני הימנעות בצמחים. ¹⁴

מנגנוני ההסתגלות הקשורים להישרדות כפור בצמחים באופן מסורתי מתחלקים לשתי קטגוריות, הקפאת סובלנות והימנעות ההקפאה. הקטגוריה לשעבר מזוהה עם מנגנונים ביוכימיים מוסדרים על ידי קבוצה מסוימת של גנים המאפשרים לצמחים לעמוד בעקות קשורות בנוכחות והשפעת dehydrative של קרח ברקמות שלו. בעוד הקטגוריה השנייה היא בדרך כלל, אך לא רק, הקשורים להיבטים מבניים של צמח שקובעים אם, מתי והיכן צורות קרח במפעל ^14. למרות השכיחות של הימנעות הקפאה כמודעהמנגנון aptive, מחקר קטן הוקדש בתקופה האחרונה להבנת מנגנוני ויסות של הימנעות הקפאת הבסיס. הקורא מופנה לסקירה האחרונה ¹⁵ לפרטים רבים יותר בנושא זה.

בעוד היווצרות הקרח בטמפרטורות נמוכות אולי נראית כמו תהליך פשוט, גורמים רבים תורמים לקביעת הטמפרטורה שבה הקרח nucleates ברקמות צמח וכיצד הוא מתפשט בתוך המפעל. פרמטרים כגון הנוכחות של חיצוני ופנימי קרח nucleators, אירועי נוקלאציה הטרוגנית לעומת הומוגנית, תרמית-hysteresis (נוזל לרדיאטור) חלבונים, נוכחות של סוכרים ספציפיים וosmolytes האחר, וכן שורה של היבטים מבניים של הצמח יכול לשחק כל משמעותי תפקיד בתהליך ההקפאה בצמחים. באופן קולקטיבי, פרמטרים אלה משפיעים על הטמפרטורה שבה צמח קופא, שבו קרח הוא יזם ואיך הוא גדל. הם יכולים גם להשפיע על המורפולוגיה של גבישי קרח שנוצרו.שיטות שונות שימשו ללמוד את תהליך ההקפאה בצמחים בתנאי מעבדה, כוללים ספקטרוסקופית תהודה מגנטית גרעינית (NMR) ^16, הדמיה בתהודה מגנטית (MRI) ^17, cryo-מיקרוסקופיה ^18-19, ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק בטמפרטורה נמוכה (LTSEM ). ²⁰ הקפאה של צמחים שלמים בהגדרות מעבדה ושדה, לעומת זאת, בעיקר במעקב עם צמדים תרמיים. השימוש בצמדים ללמוד הקפאה מבוסס על השחרור של חום (אנתלפיה של היתוך) כאשר מים עוברים שלב מעבר מנוזל למוצק. הקפאה אז נרשמה כאירוע אקסותרמית. ^21-23 למרות צמדים הם השיטה האופיינית לבחירה בלימוד הקפאה בצמחים, יש שימושם מגבלות רבות המגבילות את כמות המידע שהושג במהלך אירוע הקפאה. לדוגמא, עם צמדים קשה כמעט בלתי אפשרי לקבוע היכן קרח הוא יזם בצמחים, איך זה מתפשט,אם זה מתפשט באפילו שיעור, ואם כמה רקמות להישאר חופשיות של קרח.

התקדמות בתרמוגרפיה ברזולוציה גבוהה אינפרא אדום (HRIT) ^24-27, לעומת זאת, הגדילה באופן משמעותי את היכולת לקבל מידע על תהליך ההקפאה בכל צמחים, במיוחד בעת שימוש במצב הדמיה ההפרש. ^28-33 בדו"ח הנוכחי, אנחנו מתאר את השימוש בטכנולוגיה זו כדי ללמוד היבטים שונים של תהליך ההקפאה ופרמטרים שונים המשפיעים בו ובאיזה טמפרטורת קרח הוא יזם בצמחים. פרוטוקול יוצג שידגים את היכולת של חיידק קרח התגרענות-אקטיבי (INA), Pseudomonas syringae (CIT-7) לפעול כnucleator חיצוני ייזום הקפאה בצמח עשבוני בטמפרטורה גבוהה, שמתחת לאפס.

מצלמה אינפרא אדום ברזולוציה גבוהה

הפרוטוקול ודוגמאות מתועדות בדו"ח זה לנצל רזולוציה גבוהה אינפרא אדומותרדיומטר וידאו. מד הקרינה (איור 1) מספקת שילוב של תמונות ספקטרום אינפרא אדום ונראה לעין ונתוני טמפרטורה. תגובת הרפאים של המצלמה היא בטווח של 7.5-13.5 מיקרומטר ומספקת 640 x 480 פיקסלים ברזולוציה. תמונות ספקטרום הנראה נוצרו על ידי מצלמה ניתן התמזגה עם IR-תמונות בזמן אמת, המאפשר הפרשנות של תמונות מורכבות, תרמית-בנבנה. מגוון של עדשות למצלמה יכול לשמש להכנה מקרוב ותצפיות מיקרוסקופיות. המצלמה יכולה לשמש במצב עצמאי, או ממשק ובשליטה עם מחשב נייד באמצעות תוכנת propietary. התוכנה יכולה לשמש כדי להשיג מגוון רחב של נתונים תרמיים המשובצים בקטעי הווידאו המוקלטים. חשוב לציין כי מגוון רחב של radiometers אינפרא אדום זמין מסחרי. לכן, זה הכרחי כי החוקר לדון היישום המיועד שלהם עם מהנדס מוצר וידע שחוקר לבדוק את יכולתו של כל ספציפיתרדיומטר ג לספק את המידע הדרוש. רדיומטר ההדמיה משמש בפרוטוקול המתואר ממוקם בתיבת אקריליק (איור 2) מבודד עם קלקר אני n כדי להרתיע חשיפה לעיבוי בפרוטוקולי ההתחממות והתקררות. הגנה זו אינה נחוצה לכל המצלמות או יישומים.

Protocol

1. הכנת צמח חומרים

1. השתמש באחת עלים או צמחים שלמים של חומר צמחי נושא (SPP Hosta. או vulgaris Phaseolus).

2. הכנת פתרונות מים המכילים חיידקים הקרח נוקלאציה פעילים (INA)

1. תרבות חיידק INA, Pseudomonas syringae (הזנים Cit-7) בצלחות פטרי של 25 מעלות צלזיוס בPseudomonas אגר F מוכן עם L / 10 גרם של 100% לגליצרול הכיוון של היצרן.
2. לאחר התרבויות גדלו מספיק, מקום על 4 מעלות צלזיוס עד צורך אבל לשמור על 4 מעלות צלזיוס במשך יומיים לפני להבטיח רמה גבוהה של פעילות נוקלאציה קרח.
3. לגרד חיידקים מצלחת אחת מפני שטח של אגר עם פלסטיק, חד פעמי או לשימוש חוזר מרית מתכת בעת השימוש ומקום ב10-15 מיליליטר של מים ללא יונים בקובט חד פעמי 25 מיליליטר. הריכוז צריך להיות בטווח של 1 x ^07-01 אוקטובר x 10 ^{9 ·} -1. הפתרון יופיע מעונן. אין צורך לאשר את הריכוז באמצעות hemocytometer או ספקטרופוטומטר, כריכוז צריך רק להיות מקורב.
4. מערבולת קובט למינימום של 10 שניות כדי לפזר את החיידקים.
   הערה: הריכוז המסוים של תערובת INA וכתוצאה מכך הוא לא חשוב והפרוטוקול המתואר יספק יותר מ רמה נאותה של פעילות נוקלאציה קרח. תערובת זו של חיידקים ומים INA תשמש מאוחר יותר בניסויי ההתגרענות.

3. הגדרת ניסוי הקפאה

1. מניחים את המצלמה ברזולוציה הגבוהה אינפרא אדום (SC-660) בתוך קופסא אקריליק מגן, כך שהפרויקטים העדשה דרך הפתח בחלק הקדמי של התיבה וחוטי חיבור המצלמה ליציאת מכשיר נייד או הקלטה דרך הפתח האחורי של התיבה . אבטח את מכסה הקופסה ולמקם את התיבה בתוך החדר או במקפיא הסביבתי במיקום שכל רצוןow להיראות החומר צמחי נושא.
   1. לספק רקע כהה סביב החומר הצמחי על ידי המצפה את הקירות של החדר עם נייר הבנייה שחור כדי למנוע הפרעות מאנרגיה אינפרא אדומה משתקפת.
   2. להתאים את החדר עם תאורת LED כדי למזער חימום ממקור האור כאשר תמונות הקלטה באורכי גל נראים לעין נדרש. רק מינימום של תאורה, כגון אור ארון הפועל על סוללות או מכשיר LED קטן אחר, נדרש לצמחים להיות גלויים על ידי המצלמה.
      1. ברגע שתמונות גלויות של החומר צמחי נושא נלקחות, לכבות את תאורת LED. להפיץ כל חיבורים החיצוניים קווית (חיבור FireWire למחשב, כבל חשמל, וכו ') למצלמה דרך יציאה או פתיחה אחרת בתא.
   3. מלא כל שטח נוסף בנמל או הפתיחה עם חומר בידוד קצף כדי למנוע או להפחית הדרגתיים טמפרטורה בתוך התא. הגדר את הטמפרטורה ההתחלתית של קאמרי ב 1 מעלות צלזיוס.
2. יישר צמחים או חלקי צמח, כך שהחומר הצמחי הוא בשדה הראייה של-של המצלמה והחומר הצמחי הוא גלוי על מסך הצפייה מרחוק או בתוכנה שבחר.
3. מאפשר לצמחים לאזן ל 1 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לשעה 1, תלוי בגודל של החומר הצמחי, לפני ייזום ניסוי הקפאה מבוקר. זה מבטיח שהטמפרטורה של הצמח לא לפגר טמפרטורת אוויר על ידי מעלות רבות לאחר שניסוי ההקפאה הוא יזמה. איזון יושג כאשר הטמפרטורה של החומר הצמחי היא בתוך 0.5 מעלות צלזיוס בטמפרטורת אוויר.
   1. מניחים שכבת בידוד קלקר על גבי האדמה של עציצים אם עציצים משמשים. ברגע שהצמחים equilibrated, להתחיל קירור של החדר.
      הערה: שכבת הבידוד על פני הקרקע של הסיר מפחיתה את כמות איבוד חום המשיך מהסיר לאוויר המקיף את המפעל, ומונעת מהשורשים freezing, כמו זה לא מתרחש בדרך כלל במהלך אירוע כפור בטבע בשל המאגר העצום של הווה חום השיורי בקרקע.
4. הגדר את הפרמטרים הרצויים מצלמה (לוח צבעים, טווח טמפרטורות, אזורים ספציפיים של עניין, וכו '), כפי שנדון ב3.4.1-3.4.4.
   1. בחר את הצבעים הקשת כדי להציג את השינויים בטמפרטורה בזמן הצפייה בתמונה בשידור חי.
   2. הגדר את טווח הטמפרטורה עד 5 מעלות צלזיוס על ידי התאמת סרגל הטמפרטורה ממוקם בדיוק מתחת לתמונה בתוכנה.
   3. בחר את קנה המידה ליניארי (אלגוריתם) להמרת נתונים אינפרא אדומים לתמונת צבע השווא כהגדרתו בפלטה שנבחרה (קשת) ולהגדיר את טווח הטמפרטורה עד 5 מעלות צלזיוס ולעקוב אחר אופן אוטומטי בהתבסס על התמונה. לחלופין, להתאים מגוון להגדיר באופן ידני בעת ביצוע הניסוי.
      1. השתמש בטמפרטורה של נקודה ספציפית או טמפרטורה ממוצעת באזור המוגדר של עניין הניתן על ידי softwהם. לאחזר את נתוני הטמפרטורה של כל הפיקסלים מרצף וידאו המוקלט או מהמידע הגלום בקובץ התמונה. איור 3 מראה מסך טיפוסי מתוך תוכנת ResearchIR.
   4. מניחים את סמן על מיקום על רקמות הצמח שמייצגת נקודת העניין ספציפית. הגדר את תחומי עניין של נקודות (1 -3 פיקסלים בגודל), תיבות, קווים, אליפסות, או חוגים. שילובים רבים של נקודות או צורות יכולים להיות ממוקמים מעל התמונה.
5. הקלטת רצף וידאו
   1. הגדר את המצלמה כדי להקליט בתדר 60 הרץ ולהקלטה ללהיפסק באופן ידני.
   2. לציין את המיקום במחשב או בכונן חיצוני שבה קובץ וידאו המוקלט יוצב.
   3. להתחיל הקלטה.
      הערה: הקלטה לכונן קשיח חיצוני מומלצת ביותר מאז קבצי וידאו גדולים יופקו. קבצי וידאו מוקלטים ניתן מאוחר יותר עריכה ומכילים רק את החלק המכיל את neמידע cessary. זה מאוד יקטין את גודל הקובץ.
   4. מנמיכים את הטמפרטורה של החדר בהדרגה ב -0.5 -1.0 מעלות צלזיוס. חכה עד שטמפרטורת הצמח equilibrates עם טמפרטורת אוויר ולאחר מכן להוריד את הטמפרטורה שוב על ידי 0.5-1.0 מעלות צלזיוס. בהתאם למסה של רקמת הצמח שנצפה והמורפולוגיה שלה, איזון יכול לקחת 10 עד 15 דקות. לפיכך, נותן קצב קירור של כ -4 מעלות צלזיוס / שעה.
   5. המשך בדרך זו עד הצמח קופא ותצפיות הושלמו. לסיים את ההקלטה כאשר הושלם תהליך ההקפאה.
      הערה: רקמת צמח equilibrated עם טמפרטורת אוויר כאשר החומר הצמחי והרקע הוא באותו צבע שכן הם באותה הטמפרטורה. מאז טמפרטורת הרקע ואת הטמפרטורה של רקמת הצמח זהה, זה עלול להיות קשה לדמיין את החומר הצמחי עד ששוב מוריד את הטמפרטורה ויש ההפרש טמפרטורה בין רקמות הצמח וטמפרטורת IR.

Representative Results

פעילות הקרח nucleating של הקרח + חיידק, Pseudomonas syringae (זן Cit-7)

ירידה של 10 μl של מים ו -10 μl של מים המכיל פ syringae (CIT-7) הונחו על פני השטח abaxial של עלה Hosta (Hosta spp.) (איור 4). כפי שמודגם, הירידה של מים המכילים חיידקי INA קפאה ראשונה והייתה אחראי לגרימת העלה להקפיא בעוד טיפת מים על פני השטח העלה נשארה יצאה מן ההקפאה.

הקפאה ורביית קרח בצמח וודי

איור 5 ממחיש שני ייזום הקרח והתפשטות קרח בגזע של עץ האלון (Quercus Robur). היווצרות קרח ביוזמת באזור השיפה cambium כלי הדם של הגזע ומופצת circumferentially סביב הגזע. שיעור התפשטות קרח במפעל וודי נובע הוא הרבה יותר גדול בכיוון אורך יותר מאשר ברוחב וcircumfeכיוון rential. ³¹

מחירים של קרח רביה וחסמים לרביית קרח

קרח החל בגזע של צמח שעועית (vulgaris פ) באתר שבו חיידקי INA הונחו (איור 6 א, חץ). בעקבות אירוע ההקפאה הראשוני, קרח מופץ למעלה ולמטה הגזע (איור 6-ג). שימוש ברצף הווידאו, שבו יש חותמת זמן, ומדידת מרחק על הגזע, מאפשר אחד כדי לחשב את שיעור התפשטות קרח על פני מרחק נתון. הגרף באיור 6 מציג את שיעור התפשטות קרח עד הגזע של צמח השעועית מנקודת הקיפאון ראשוני ומדגים שיעור ירידה של התפשטות קרח כמו הקרח עובר דרך אזור קטרי של הצמח. שימוש בתרמוגרפיה אינפרא אדום מאפשרת גם אחד כדי לקבוע את הנוכחות של כל מחסומים פיזיים המונעים ההתפשטות של קרח לרקמות ספציפיות. איור 7 </ Strong> ממחיש הקפאה במיני אלפיני, procumbens Loiseleuria, שבו החלק וגטטיבי (גזע ועלים) של הצמח הקפיא אבל ניצני פרחי המסוף יישארו יצאה מן ההקפאה. היווצרות קרח לא עלתה עד 126-164 דק 'לאחר ההקפאה של הגבעול ועלים שהתרחשו והתגובה אקסותרמית וכתוצאה מכך התפוגגה. כיורה רבייה של מינים עציים אלפיני מקפיא רגיש ^3,33, הקפאת הימנעות היא מכריע חשובה להצלחת רבייה.

יכולת של מחסומי הידרופובי להקפאת הבלוק הסביבתי על קרח נוקלאציה מושרה

צמח עגבנייה (Solanum lycopersicum) היה מצופה בחומר מבוסס קאולין הידרופובי (איור 8 א) על מנת לקבוע אם המכשול הידרופובי יכול לחסום הקפאת נוקלאציה קרח חיצונית מושרה. מידת הקשר של טיפות של נוזל עם משטח העלה הייתה הרבה יותר גדולה בעלים ללא ציפוי ( (איור 8C). כפי שמודגם באיור 8D, צמחים ללא ציפוי (מימין) הציגו אירוע אקסותרמית טיפוסי של אירוע הקפאה, ואילו צמחים מצופים (משמאל) נשארו יצאה מן ההקפאה והקירור לכ -6.0 מעלות צלזיוס. ניתן למצוא את פרטים של ניסויים אלה ובישנייבסקי et al. ³⁴ מגמה של הידרופוביות גדולה יותר במבנה העלה של מיני צמחים מקומיים לאורך שיפוע גובה כבר צוינה על ידי Aryal ונוינר. ³⁵

איור 1. ברזולוציה גבוהה אינפרא אדום מדי קרינה. המודל המאויר היא מצלמה FLIR SC-660 אינפרא אדום וידאו.

איור 2. מארז מגן עבור מצלמת אינפרא אדום. תיבת אקריליק משמשת לבית המצלמה ולמנוע עיבוי מלהרכיב על מצלמת אינפרא אדום במהלך הקפאה והפשרת ניסויים. () תיבה עם מצלמה העליונה הוסר. (ב) הוכנס לתיבת אקריליק ומכסה סגור.

איור 3. צפייה וניתוח תמונות אינפרא אדום ומרוחק מצלמה בקרה. צילום מסך מהתוכנה ResearchIR. התוכנה משמשת כדי להציג את התמונה בשידור חי, לשנות את הגדרות מצלמה, תמונות בודדות שיא, לבצע הקלטות וידאו, ולנתח את נתוני טמפרטורה בתמונות. הכנס על ימין מראה אפשרויות לשינוי הגדרות מצלמה בעת הוספה על שמאלי תחתון מציגה היסטוגרמה טמפרטורה של התמונה בשידור חי.

הקפאת איור 4. התגרענות סביבתית על מושרה של עלה Hosta (Hosta spp.). טיפות מוקפאות של מים וחיידקים INA, Pseudomonas syringae (זן Cit-7), נמצאים על פני השטח abaxial של העלה (). אגל INA מקפיא ראשון (B) ויוזם הקפאה של העלה (C). קרח מתפשט בכל העלה (D) ולמרות ההקפאה של העלה, טיפת המים נשארת יצאה מן ההקפאה (E). טיפה של מים על פני השטח של עלים קופאת אחרי כל העלה הקפיא ומתחיל להתקרר בקצותיה (F).

איור 5. ייזום קרח והתפשטות בגזע של צמח וודי (Robur Quercus) שמאל פנל:. חתך של גזע עצי של עץ אלון. (AH) ייזום של הקפאת אירוע באזור של השיפה וcambium כלי דם () והתקדמות של קרח היווצרות סביב הגזע (B - H). Kuprian ונוינר, לא פורסם.

איור 6. ערי התפשטות קרח במפעל שעועית (vulgaris Phaseolus) מחושבת באמצעות תרמוגרפיה אינפרא אדום ברזולוציה גבוהה. () קרח יזם בגזע (חץ). (ב - ג) התפשטות קרח למעלה ולמטה הגזע. גרף בחלק העליון של דמות מציג את שיעור התפשטות קרח מוצג כקרח המרחק נסע לאורך זמן כפי שהוא עבר את הגזע מהאתר המקורי של הקפאה. עיכוב באניחלה התפשטות לסה"נ כקרח עבר דרך חלק קטרי של גזע הצמח. נתון זה היה שונה ומישנייבסקי et al. ²⁴

איור 7. מכשול להיווצרות קרח במפעל וודי אלפיני, procumbens Loiseleuria (אזליה אלפיני). תמונת אור גלויה של הגזע של אזליה אלפיני מראה גזע מרכזי, עלים מצורפים, וניצני מסוף (). הקפאת - (B C) היא יזם בגזע והקרח מתפשט החוצה אל עלים. ניצני מסוף יישארו יצאה מן ההקפאה. (D - E) ניצני מסוף להקפיא באופן עצמאי 126-164 דקות לאחר הקפאה ראשונית של גבעול ועלים. במהלך תקופה זו את החום של אנתלפיה מיוצרת על ידי ההקפאה של הגבעול ועלים כבר התפוגג. Kuprian ונוינר, unpublished.

8. מחסומי הידרופובי איור לחסום הקפאת התגרענות המושרית חיצונית של עגבניות (Lycopersicon Solanum). () חומר מבוסס קאולין הידרופובי להחיל צמחי עגבניות. (ב - ג). רמה מופחתת של קשר בין משטח העלה וטיפות של נוזל המכיל חיידקי INA על מצופה (ב ') מול ללא ציפוי עלים (C). (ד) מפעל ללא ציפוי (מימין) עובר תגובה אקסותרמית קשורה עם הקפאה של הצמח ואילו מפעל מצופה נשאר בקירור, ויצא מן ההקפאה בכ -6 מעלות צלזיוס. נתון זה שונה ומישנייבסקי et al. ³⁴

Discussion

יש מים היכולת מדליקה לטמפרטורות נמוכות 0 מעלות צלזיוס והטמפרטורה בה מים יקפאו יכולים להיות משתנים לגמרי. ³⁶ מגבלת הטמפרטורה לקירור של מים טהורים היא על -40 מעלות צלזיוס ומוגדרת כנקודת נוקלאציה הומוגנית. כאשר מים קופאים בטמפרטורות חמה יותר מאשר -40 ° C זה הוא הביא על ידי הנוכחות של הטרוגניים nucleators המאפשרים עוברי קרח קטנים כדי ליצור שלאחר מכן ישמש כזרז להיווצרות קרח וצמיחה. ³⁷ יש שפע של מולקולות בטבע ש לפעול סוכני nucleating הקרח כיעילים מאוד, ולכן רוב ההקפאה של מים בטבע מתרחש בטמפרטורות מתחת 0 ° C. היכולת לווסת או להשפיע על הפעילות של סוכני nucleating הטרוגניים יש פוטנציאל משמעותי כגישה חדשנית למתן הגנת כפור לצמחים. ההבנה כיצד צורות קרח ומתפשט בהקפאת צמחים רגישים והקפאה סובלנית חיונית לAChieving מטרה זו.

כפי שצוין במבוא, שיטות שונות שימשו ללמוד את תהליך ההקפאה בצמחים בתנאי מעבדה, לעומת זאת, הקפאה של צמחים בטבע בעיקר במעקב עם השימוש של צמדים תרמיים. תרמוגרפיה ברזולוציה גבוהה אינפרא אדום (HRIT) ^24-28,34, מציעה מספר יתרונות בולטים כמו שיטה ללימוד תהליך ההקפאה בצמחים. HRIT מאפשר לצפות באתר הראשוני של היווצרות קרח, מספר אירועי הקפאת צורך להקפיא כל צמח, למעשה לבחון כיצד קרח מופץ במפעל ואם כל מחסומים להתפשטות קרח נמצאים, ולקבוע אם כל חלקים של המפעל יישאר קרח בחינם. והכי חשוב, הוא מאפשר לאדם להתבונן בתהליך ההקפאה בכל מפעלים ולא מנות קטנות, מבודדות של צמח שהוסרו ממפעל ההורה.

הדו"ח הנוכחי מתאר את היישום של HRIT לחקר FreeZing בצמחים שלמים או חלקי צמח, ומספק כמה דוגמאות כיצד טכנולוגיה זו יכולה לשמש כדי לבחון מספר פרמטרים שיכולים להשפיע על איך ומתי צורות קרח בצמחים, ואיך קרח מופץ. היבטים קריטיים של ביצוע מחקרים אלה כרוכים ברגישות ודיוק של מצלמת אינפרא אדום, הפרמטרים המשמשים בהתקנה של המצלמה וההקלטה של ​​רצפי וידאו, קצב הקירור, המורכבות המבניות / מורפולוגיים של הנושא להיות שנצפו, וידע על מדע אינפרא אדום. פריטים אלה יטופלו בנפרד.

רגישות ודיוק של מצלמת אינפרא אדום (רדיומטר)

האירועים אקסותרמית במהלך ההקפאה של רקמות צמח כי הם דמיינו הם קטנים מאוד, הנעים בין <0.1 לכ -0.5 מעלות צלזיוס. לכן מצלמת אינפרא אדום חייבת להיות רגישה מספיק כדי להבחין בשינויים קטנים בטמפרטורה בקלות. דיוק טמפרטורה הוא גם היבט חשוב ודורש שהמצלמה מכוילת על בסיס קבוע (לפחות פעם בשנה). אמנם זה יכול להיעשות על ידי המשתמש, הוא דורש שימוש במספר גופים שחורים המכסים מגוון רחב של טמפרטורות. לכן, זה הכי טוב שיש מצלמה מכויל במפעל. אם רמה גבוהה של דיוק טמפרטורה היא חיונית, מומלץ מאוד שתרמי לשמש בשילוב עם קביעת מצלמת אינפרא אדום. זה יכול להיות מותקן בקרבת האובייקט נחקר לתת הערכה מדויקת של טמפרטורת אוויר.

פרמטרים מצלמה

שורה של פרמטרים יכולה להיות מותאמת על מצלמות אינפרא אדום מתקדמות, high-end. בשימוש במצלמה כדי להציג ו / או להקליט הקפאת אירועים, חשוב שמיצוע התמונה לשמש כדי להפחית תמונה רועשת, וכך קל יותר לדמיין חלקי צמח ואירועי הקפאה. מיצוע תמונה מתרחש כאשר תמונה באיכות גבוהה נבחרה בהגדרות המצלמה. מאז exotherm הקפאת הקטיןים צפוי, חשוב גם בעת הצפייה בתהליך ההקפאה כדי להגדיר את טווח הטמפרטורות של המצלמה כדי לכסות טווח טמפרטורה קטן (2-5 מעלות צלזיוס). זה נחוץ משום שהתוכנה תפיץ את pallette הצבע שנבחר על תוחלת המלאה שנקבעה למצלמה. לכן, אם יש 10 צבעים בpallette ויש אחד תוחלת נקבעה על 100 מעלות צלזיוס, יהיה רק ​​שינוי בצבע, אם חל שינוי C ° 10 בטמפרטורה. שיעור לכידה גבוה (עשרה פריימים לשניה) יש להשתמש בכך שאירועים אקסותרמית קטנים, שיתפוגגו במהירות, לא החמיצו. ניתן לבחור תבניות צבע שונות וסולמות אפורים מתפריט הנפתח. בחירה של הצבעים המתאימים ביותר צריכה להיות מבוססת על האם או לא זה מספק את האפשרות הטובה ביותר עבור לדמיין את האירועים התרמיים של עניין. מצלמות מתקדמות גם מציעות מספר אפשרויות להקלטת וידאו רצף ו / או לכידת תמונות בודדות. מספר מסוים של מסגרות על משך זמן מוגדר יכול להיות שנבחר.זה הוא הטוב ביותר עבור רצפי הקלטה של ​​זמן קצר (דקות) ולא שעות. לחלופין, מספר הפריימים לשניה יכול להיות מצויינים והמצלמה מוגדרת לעצור את ההקלטה באופן ידני או לאחר מספר מסוים של מסגרות. מצלמות מתקדמות מציעות גם האפשרות להקלטות להתחיל או סוף מבוססים על גורמים מוגדרים מראש (טמפרטורה או זמן).

קצב קירור

חשובה שהטמפרטורה של חומר צמחי שנצפתה אינה שונה באופן דרמטי מטמפרטורת האוויר במהלך קירור. אם הטמפרטורה יורדת מהר מדי, צמחים מדליקים ולהקפיא בטמפרטורת אוויר נמוכה יותר ממה שהם הייתם תחת שיעורי קירור טבעיים. רוב המחקרים ממליצים קצב קירור של שעה C ° 1-2 ^-1, במיוחד בטמפרטורות מעל -5 ° C, המספק מספיק זמן לצמחים להגיע לשיווי משקל עם טמפרטורת האוויר. למעשה, החומר הצמחי עלול לבוא בשיווי המשקל הרבה יותר מהר. זהניתן לקבוע על ידי השוואת הטמפרטורה של החומר הצמחי עם הטמפרטורה של הרקע סביב המפעל. אם הצמח נמצא בשיווי משקל, זה יהיה קשה להבחין בצמח מהרקע שלה בתמונה אינפרא אדום כפי שיהיה באותה הטמפרטורה כרקע והתמונה תופיע להיות כמעט הומוגנית בצבע.

שנצפו מורכבות המורפולוגית מבניים של האובייקט

מאז התמונות שנצפו מייצגות תמונות של טמפרטורה, אובייקטים חופפים יופיעו כאובייקטים רציפים ולא בדידים אובייקטים. זה יכול להפוך את ההבחנה שבו אירועי הקפאה הם מתרחשים קשים מאוד וגם להגביר את הקושי בקביעה כיצד קרח הוא למופץ במפעל. הדרך הטובה ביותר להתמודד עם בעיה זו היא עבודה ראשונה עם חפצים פשוטים (עלים בודדים, נובע, וכו ') ולאחר מכן לבנות עד אובייקטים מורכבים יותר. ניסיון בעבודה עם אמא ספציפיתיש terial ערך רב בהתמודדות עם בעיה זו. בנוסף, יכולת כיסוי תמונת אינפרא-אדומה בחלק העליון של תמונה דיגיטלית, גלויה-אור יכולה גם לסייע באופן משמעותי בניתוח והבנת נתונים אינפרא אדומים.

ידע של מדע אינפרא אדום

למרות שזה יהיה יתרון לאוכל פשוט כוון את המצלמה לאובייקט ויודע כי נתוני הטמפרטורה קיבלו הוא 100% מדויקים, הבנה כיצד אינפרא אדום אנרגיית אינטראקציה עם הסביבה שלו יכולה להגביר את ההבנה של הדרך הטובה ביותר להשתמש בדרגת המחקר אלה מאוד מצלמות אינפרא אדום ולפרש את הנתונים. אחד צריכה להיות קצת מכיר את פליטת מונחים, ההחזרה, וספיג. על פי רוב, ניתן להשתמש במצלמה מבלי לדאוג פרמטרים אלה, עם זאת, הם יכולים לעזור להסביר את טבעו של התמונה מוצגת והאיכות הכוללת שלה ודיוק. בקצרה, כאשר אנרגיית אינפרא אדום פוגעת אובייקט זה יכול להיות גם reflected או נספג ולאחר מכן נפלט. טבעו של האובייקט נחקר, ולכן, יכול להשפיע על הדיוק של הנתונים שמתקבל. אם אובייקט יש החזרה גבוהה, אחד יקבל תמונה יותר נציג של האובייקטים סביב הפולטים אנרגיה אינפרא אדומה מאשר האובייקט עצמו. הספיגה של אנרגיה אינפרא אדומה ללא פולט אנרגיית אינפרא אדום יכול גם להוביל לקבלת נתוני טמפרטורת שווא מהאובייקט נחקרת. חיישני המצלמה לזהות נפלטים אנרגיית אינפרא אדום, ולכן, הטמפרטורות מדויקות ביותר מתקבלות מאובייקטים שיש להם רמה גבוהה של פליטה. למרבה המזל, יש לי צמחי רמה גבוהה של פליטה המאפשרת מדידות טמפרטורה מדויקות. רמות נמוכות יותר של פליטה יכולות להיות מתוגמלות על ידי התאמת פרמטר זה בהגדרות המצלמה אז שתשתמשנה באלגוריתם להתאמה נאותה בקריאת נתוני הטמפרטורה.

היכולת לקבוע איך ומתי צמחים להקפיא באופן מדויקהוא חיוני להבנת האבולוציה של מנגנון הקפאה-הימנעות והתפקיד של מבנה מפעל בתהליך ההקפאה. הקפאה, למרות הפשטות לכאורה שלה, הוא תהליך מורכב וצמחים התפתחו שורה של התאמות מבניות כדי למנוע הקפאה, למדר היווצרות קרח, ולמנוע את ההתפשטות של קרח. תרמוגרפיה אינפרא אדום ברזולוציה גבוהה היא רומן וכלי רב עוצמה שיכול לשמש כדי לחקור את המורכבות של תהליך ההקפאה בצמחים ולהוביל לפיתוח שיטות חדשות יעילות של הגנת כפור. הבנה טובה יותר של הקפאה-הימנעות יכולה גם לעזור לנו להבין כיצד מנגנוני הסתגלות אלה התפתחו, והתפקיד שהם ממלאים בביולוגיה וההישרדות של מיני צמחים שונים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Infrared Camera	FLIR	SC-660	Many models available depending on application
Infrared Analytical Software	FLIR	ResearchIR 4.10.2.5	$3,500
Pseudomonas syringae (strain Cit-7)			Kindly provided by Dr. Steven Lindow, University of California  Berkeley icelab@berkeley.edu
Pseudomonas Agar F	Fisher Scientific	DF0448-17-1