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Environment

El uso de alta resolución Termografía Infrarroja (HRIT) para el Estudio de Hielo La nucleación y Hielo Propagación de Plantas

Published: May 8, 2015 doi: 10.3791/52703

Introduction

Congelación temperaturas que se producen cuando las plantas están creciendo activamente puede ser letal, particularmente si la planta tiene tolerancia a la congelación poco o no. Tales heladas suelen tener efectos devastadores en la producción agrícola y también pueden desempeñar un papel importante en la conformación de la estructura de la comunidad en las poblaciones naturales de las plantas, sobre todo en los Alpes, los ecosistemas sub-árticas y árticas 1-6. Los episodios de fuertes heladas de primavera han tenido un gran impacto en la producción de fruta en los EE.UU. y América del Sur en los últimos años 7-9 y se han agravado por la aparición temprana de clima cálido, seguido por las bajas temperaturas más típicas medias. El clima cálido temprana induce brotes de romper, activando el crecimiento de nuevos brotes, hojas y flores de todos los cuales tienen muy poca o ninguna tolerancia a las heladas 1,3,10-12. Tales patrones climáticos erráticos se han notificado a ser un reflejo directo del cambio climático en curso y se espera que sea un patrón de tiempo común para los foresfuturo eeable 13. Los esfuerzos para proporcionar técnicas de gestión económicos, eficaces y respetuosas del medio ambiente o agroquímicos que pueden proporcionar una mayor tolerancia a las heladas han tenido un éxito limitado por una serie de razones, pero esto puede ser parcialmente atribuido a la naturaleza compleja de la tolerancia a la congelación y congelación mecanismos de evasión en las plantas. 14

Los mecanismos adaptativos asociados con la supervivencia heladas en las plantas se han dividido tradicionalmente en dos categorías, tolerancia a la congelación y la congelación de evitación. La primera categoría se asocia con mecanismos bioquímicos regulados por un conjunto específico de genes que permiten a las plantas para tolerar las tensiones asociadas con la presencia y el efecto deshidratante de hielo en sus tejidos. Si bien esta última categoría es normalmente, pero no exclusivamente, asociado con aspectos estructurales de una planta que determinan si, cuándo, y dónde se forma hielo en una planta 14. A pesar de la prevalencia de la evitación de la congelación como un anunciomecanismo aptive, poca investigación se ha dedicado en los últimos tiempos a la comprensión de los mecanismos y regulación de evitar la congelación subyacentes. Se remite al lector a una revisión reciente 15 para mayores detalles sobre este tema.

Mientras que la formación de hielo a temperaturas bajas puede parecer un proceso simple, muchos factores contribuyen a la determinación de la temperatura a la que el hielo se nuclea en los tejidos vegetales y cómo se propaga dentro de la planta. Parámetros como la presencia de extrínseca e intrínseca nucleadores de hielo, frente a eventos de nucleación homogénea heterogéneos, térmica-histéresis (anticongelante) proteínas, la presencia de azúcares específicos y otros osmolitos, y una serie de aspectos estructurales de la planta todos pueden jugar un importante papel en el proceso de congelación en las plantas. Colectivamente, estos parámetros influyen en la temperatura a la que una planta se congela, donde se inicia hielo y cómo crece. También pueden afectar a la morfología de los cristales de hielo resultantes.Varios métodos han sido utilizados para estudiar el proceso de congelación en las plantas bajo condiciones de laboratorio, incluyendo espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN) 16, imágenes de resonancia magnética (MRI) 17, crio-microscopía 18-19, y microscopía electrónica de barrido de baja temperatura (LTSEM ). 20 Congelación de plantas enteras en la configuración de laboratorio y de campo, sin embargo, ha sido principalmente controlarse con termopares. El uso de termopares para estudiar la congelación se basa en la liberación de calor (entalpía de fusión) cuando el agua se somete a una transición de fase de líquido a un sólido. La congelación se registra entonces como un evento exotérmico. 21-23 A pesar de que los termopares son el método típico de elección en el estudio de la congelación en plantas, su uso tiene muchas limitaciones que limitan la cantidad de información obtenida durante un suceso de congelación. Por ejemplo, con termopares es difícil casi imposible determinar donde se inicia de hielo en las plantas, la forma en que se propaga,si se propaga a una velocidad constante, y si algunos tejidos permanecen libres de hielo.

Los avances en la termografía infrarroja de alta resolución (HRIT) 24-27, sin embargo, han aumentado de manera significativa la capacidad de obtener información sobre el proceso de congelación en plantas enteras, especialmente cuando se utiliza en un modo de imagen diferencial. 28-33 En el presente informe, describen el uso de esta tecnología para estudiar diversos aspectos del proceso de congelación y diversos parámetros que afectan a dónde y en qué hielo y la temperatura se inicia en las plantas. Un protocolo será presentado que demostrar la capacidad de la bacteria de hielo-nucleación-activo (INA), Pseudomonas syringae (Cit-7) para actuar como un nucleador extrínseca iniciar la congelación en una planta herbácea a una alta temperatura, a temperaturas bajo cero.

De alta resolución de la cámara de infrarrojos

El protocolo y ejemplos documentados en este informe utilizan una alta resolución de infrarrojosradiómetro de vídeo. El radiómetro (Figura 1) suministra una combinación de imágenes espectro de infrarrojos y visibles y datos de temperatura. La respuesta espectral de la cámara está en el rango de 7,5 a 13,5 micras y proporciona una resolución de 640 x 480 pixel. Imágenes espectro visible generados por la cámara puede ser fusionado con IR-imágenes en tiempo real, lo que facilita la interpretación de imágenes térmicas, complejos incorporado. Una gama de lentes para la cámara se puede utilizar para hacer primeros planos y observaciones microscópicas. La cámara se puede utilizar en un modo autónomo, o interconectado y controlado con un ordenador portátil usando software propietario. El software se puede utilizar para obtener una variedad de datos térmicos embebidos en los vídeos grabados. Es importante observar que una amplia variedad de radiómetros infrarrojos están disponibles comercialmente. Por lo tanto, es esencial que el investigador discutir su aplicación prevista con un ingeniero de producto bien informado y que el investigador probar la capacidad de cualquier específic radiómetro para proporcionar la información necesaria. El radiómetro de imágenes utilizado en el protocolo descrito se coloca en una caja de acrílico (Figura 2) con aislamiento de espuma de poliestireno i on el fin de disuadir a la exposición a la condensación durante los protocolos de calentamiento y enfriamiento. Esta protección no es necesaria para todas las cámaras o aplicaciones.

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Protocol

1. Preparación de materiales vegetales

  1. Utilice cualquiera de las hojas o plantas enteras de material de la asignatura planta (Hosta spp. O Phaseolus vulgaris).

2. Preparación de las soluciones de agua que contienen hielo nucleación activos (INA) Bacterias

  1. Cultura la bacteria INA, Pseudomonas syringae (Strain Cit-7) en placas de Petri a 25 ° C en Pseudomonas Agar F preparada con 10 g / L de 100% de glicerol por la dirección del fabricante.
  2. Después de culturas han crecido lo suficiente, a 4 ° C hasta que sea necesario, pero mantener a 4 ° C durante dos días previos para asegurar un alto nivel de actividad de nucleación de hielo.
  3. Raspar las bacterias de una sola placa de la superficie del agar con un plástico, desechable o reutilizable espátula de metal en el momento de uso y lugar en 10-15 ml de agua desionizada en una cubeta desechable de 25 ml. La concentración debe estar en el rango de 1 × 10 7 hasta 1 x 10 9 · -1. La solución aparecerá nublado. No hay necesidad de confirmar la concentración usando un hemocitómetro o espectrofotómetro, como concentración sólo necesita ser aproximada.
  4. Vórtex con la cubeta durante un mínimo de 10 seg para distribuir las bacterias.
    Nota: La concentración específica de la mezcla de INA resultante no es importante y el protocolo descrito proporcionará más de un nivel adecuado de actividad de nucleación de hielo. Esta mezcla de bacterias INA y el agua se utilizará más adelante en los experimentos de nucleación.

3. Configuración de un experimento de congelación

  1. Coloque la cámara de infrarrojos de alta resolución (SC-660) dentro de la caja protectora de acrílico para que los proyectos lente a través de la abertura en el frente de la caja y los cables que conectan la cámara a una salida del ordenador portátil o dispositivo de grabación a través de la abertura posterior de la caja . Asegure la tapa de la caja y colocar la caja dentro de la cámara ambiental o congelador en un lugar que lo hará todoflujo del material objeto planta para ser visto.
    1. Proporcionar un fondo oscuro en todo el material de la planta por el forro las paredes de la cámara con papel de construcción negro para evitar la interferencia de la energía infrarroja reflejada.
    2. Coloque la cámara con iluminación LED para minimizar el calentamiento de la fuente de luz cuando se requiere la grabación de imágenes en longitudes de onda visibles. Sólo un mínimo de iluminación, tal como una luz armario funciona con batería u otro dispositivo LED pequeña, se requiere para que las plantas sean visibles por la cámara.
      1. Una vez que se toman imágenes visibles de la materia objeto de la planta, apagar la iluminación LED. Distribuya todas las conexiones cableadas externos (conexión FireWire a la computadora, cable de alimentación, etc.) a la cámara a través de un puerto u otra abertura en la cámara.
    3. Rellene cualquier espacio extra en el puerto o abertura con material aislante de espuma para evitar o reducir los gradientes de temperatura dentro de la cámara. Ajuste la temperatura inicial de la cámara en 1 ° C.
  2. Alinear las plantas o partes de plantas de manera que el material de la planta se encuentra en el campo de visión de la cámara y el material vegetal es visible en la pantalla de visualización remota o dentro del software elegido.
  3. Permitir que las plantas se equilibre a 1 ° C durante 30 min a 1 hr, dependiendo del tamaño del material de planta, antes de iniciar un experimento de congelación controlada. Esto asegura que la temperatura de la planta no se quedará atrás temperatura del aire en muchos grados una vez que se inicia el experimento de congelación. La equilibración se logra cuando la temperatura del material vegetal está dentro de 0,5 ° C de temperatura del aire.
    1. Coloque una capa de aislamiento de espuma de poliestireno en la parte superior del suelo de las plantas en macetas si se utilizan las plantas en maceta. Una vez que las plantas hayan equilibrado, iniciar el enfriamiento de la cámara.
      Nota: La capa de aislamiento sobre la superficie del suelo de la olla reduce la cantidad de pérdida de calor continuación de la olla para el aire que rodea la planta, y evita que las raíces de freezing, ya que esto no sería típicamente ocurrir durante un evento de helada en la naturaleza debido al depósito masivo de calor residual presente en el suelo.
  4. Establezca los parámetros de la cámara que desee (paleta de colores, rango de temperatura, áreas específicas de interés, etc.), como se comenta en 3.4.1-3.4.4.
    1. Seleccione la paleta del arco iris para mostrar las variaciones de temperatura mientras se visualiza la imagen en directo.
    2. Ajuste el intervalo de temperatura de 5 ° C ajustando la barra de temperatura situado justo debajo de la imagen en el software.
    3. Elija la escala lineal (algoritmo) para convertir los datos infrarrojos en la imagen en color falso como se define en la paleta seleccionada (arco iris) y establecer el rango de temperatura de 5 ° C y para realizar un seguimiento de forma automática basándose en la imagen. Alternativamente, ajuste el rango establecido manualmente mientras que la realización del experimento.
      1. Utilice la temperatura de un punto específico o una temperatura promedio dentro del área definida de interés proporcionada por el softwson. Recuperar los datos de temperatura de todos los píxeles de la secuencia de vídeo grabado o de la información incrustada en el archivo de imagen. La figura 3 muestra una captura de pantalla típico desde dentro software ResearchIR.
    4. Colocar un cursor en una ubicación en el tejido de la planta que representa un punto específico de interés. Definir el área de interés como puntos (1 -3 píxeles de tamaño), cajas, líneas, elipses o círculos. Múltiples combinaciones de puntos o formas se pueden situar sobre la imagen.
  5. Grabación de una secuencia de vídeo
    1. Ajuste la cámara al grabar a 60 Hz y para la grabación se detenga manualmente.
    2. Indique la ubicación en el ordenador o disco duro externo donde se colocará el archivo de vídeo grabado.
    3. Comenzar la grabación.
      Nota: Grabación en un disco duro externo es muy recomendable ya que se generarán grandes archivos de video. Archivos de vídeo grabados se pueden editar más tarde para contener sólo la parte que contiene la neinformación nece-. Esto reducirá en gran medida el tamaño del archivo.
    4. Baje la temperatura de la cámara de forma incremental en un 0,5 -1,0 ° C. Espere hasta que la temperatura de la planta se equilibra con la temperatura del aire y luego bajar la temperatura de nuevo por 0,5 a 1,0 ° C. Dependiendo de la masa del tejido de la planta siendo observado y su morfología, de equilibrio puede tomar de 10 a 15 min. Por lo tanto, dando una tasa de enfriamiento de aproximadamente 4 ° C / hr.
    5. Continúe de esta manera hasta que la planta se congela y observaciones se han completado. Finalice la grabación cuando el proceso de congelación se ha completado.
      Nota: El tejido de la planta se ha equilibrado con la temperatura del aire cuando el material vegetal y el fondo son del mismo color, ya que son a la misma temperatura. Puesto que la temperatura de fondo y la temperatura del tejido de la planta son los mismos, puede ser difícil de visualizar el material vegetal hasta que de nuevo más baja la temperatura y no hay diferencial de temperatura entre el tejido de la planta y unatemperatura IR.

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Representative Results

Actividad Hielo-nucleación del hielo + bacteria, Pseudomonas syringae (cepa Cit-7)

Una gota 10 l de agua y 10 l de agua que contienen P. syringae (Cit-7) se colocaron en la superficie abaxial de una hoja de Hosta (Hosta spp.) (Figura 4). Como se ilustra, la gota de agua que contiene las bacterias INA congeló primero y fue responsable de la inducción de la hoja para congelar, mientras que la gota de agua sobre la superficie de la hoja se mantuvo sin congelar.

Congelación y Propagación de hielo en una planta leñosa

Figura 5 ilustra tanto la iniciación y propagación de hielo hielo en un tallo de roble (Quercus robur). La formación de hielo se inició en la región de floema cambium vascular del tallo y propaga circunferencialmente alrededor del tallo. La velocidad de propagación de hielo en la planta de tallos leñosos es mucho mayor en una dirección longitudinal que en un lateral y circumfedirección rential. 31

Precios de Hielo Propagación y Barreras a la propagación de Hielo

Hielo se inició en el tallo de una planta de frijol (P. vulgaris) en el sitio donde las bacterias INA habían sido colocados (Figura 6A, flecha). Tras el evento inicial de congelación, hielo propaga hacia arriba y abajo del tallo (Figura 6B-C). Usando la secuencia de vídeo, que tiene un sello de tiempo, y la medición de la distancia en el vástago, permite a uno para calcular la velocidad de propagación de hielo sobre una distancia dada. El gráfico en la Figura 6 presenta la velocidad de propagación de hielo hasta el tallo de la planta de frijol desde el punto de congelación inicial e ilustra una disminución de la tasa de propagación de hielo a medida que pasa a través de la región de hielo nodal de la planta. El uso de termografía infrarroja también permite determinar la presencia de cualquier barreras físicas que impiden la propagación de hielo en tejidos específicos. Figura 7 </ Strong> ilustra la congelación en una especie alpinos, procumbens Loiseleuria, donde la parte vegetativa (tallo y hojas) de la planta se ha congelado, pero los terminales botones florales permanecer congelada. La formación de hielo no se produjo hasta 126-164 minutos después de la congelación del tallo y las hojas se habían producido y la respuesta exotérmica resultante se había disipado. Como brotes reproductivos de las especies leñosas alpinos están congelando sensibles 3,33, la congelación de evitación es de crucial importancia para el éxito reproductivo.

Capacidad de Barreras hidrófobos a congelación Bloquear extrínseca Hielo nucleación inducida

Una planta de tomate (Solanum lycopersicum) se recubrió con un material a base de caolín hidrófobo (Figura 8A) con el fin de determinar si la barrera hidrofóbica podría bloquear extrínseca nucleación de hielo de congelación inducida. El grado de contacto de las gotitas de líquido con la superficie de la hoja fue mucho mayor en las hojas no revestidas ( (Figura 8C). Como se ilustra en la Figura 8D, las plantas sin recubrir (a la derecha) exhibieron un evento exotérmico típico de un evento de congelación, mientras que las plantas revestidas (izquierda) permanecieron sin congelar y sobreenfriadas a aproximadamente -6,0 ° C. Los detalles de estos experimentos se pueden encontrar en Wisniewski et al. 34 Una tendencia de una mayor hidrofobicidad en la estructura de la hoja de las especies de plantas nativas a lo largo de un gradiente altitudinal se ha señalado por Aryal y Neuner. 35

Figura 1
Figura 1.-radiómetro infrarrojo de alta resolución. El modelo ilustrado es una cámara FLIR SC-660 video infrarrojo.

Figura 2
Figura 2. caja protectora para la cámara de infrarrojos. Una caja de acrílico se utiliza para albergar a la cámara y evitar que se forme condensación en la cámara de infrarrojos durante la congelación y descongelación experimentos. (A) Caja con tapa eliminado. (B) Cámara insertada en la caja de acrílico y la tapa cerrada.

Figura 3
Figura 3. Visualización y análisis de imágenes de infrarrojos y control remoto de la cámara. Captura de pantalla del software ResearchIR. El software se utiliza para ver la imagen en vivo, cambiar la configuración de la cámara, grabar imágenes individuales, hacer grabaciones de vídeo, y analizar datos de temperatura en las imágenes. Inserte la derecha muestra opciones para cambiar ajustes de la cámara, mientras que en la parte inferior izquierda de inserción muestra un histograma temperatura de la imagen en vivo.

Figura 4 Figura 4. nucleación extrínseca congelación inducida de Hosta hoja (Hosta spp.). Gotitas no congelados de agua y bacterias INA, Pseudomonas syringae (cepa Cit-7), están presentes en la superficie abaxial de la hoja (A). INA gotita congela primero (B) y se inicia la congelación de la hoja (C). De hielo se propaga a lo largo de la hoja (D) y a pesar de la congelación de la hoja, la gota de agua permanece sin congelar (E). Gotita del agua en la superficie de la hoja se queda como después de la hoja entera se ha congelado y está empezando a enfriar en sus bordes (F).

Figura 5
Figura 5. iniciación y propagación de hielo en el tallo de una planta leñosa (Quercus robur) Panel izquierdo:. Sección transversal de un tallo leñoso de roble. (AH) Iniciación de congelación evento en la región del floema y cambium vascular (A) y la progresión de la formación de hielo alrededor del vástago (B - H). Kuprian y Neuner, inédito.

Figura 6
Figura 6. Tasa de propagación hielo en una planta de frijol (Phaseolus vulgaris), calculado utilizando alta resolución de la termografía infrarroja. (A) de hielo iniciada en el tallo (flecha). (B - C) la propagación de hielo arriba y abajo del tallo. Gráfico en la parte superior de la figura muestra la velocidad de propagación de hielo presenta como el hielo distancia recorrida en el tiempo, ya que se trasladó hasta el tallo desde el sitio original de la congelación. Un retraso en ipropagación ce ocurrió cuando trasladó hielo a través de la parte nodal del tallo de la planta. Esta cifra se modificó a partir Wisniewski et al. 24

Figura 7
Figura 7. Barrera a la formación de hielo en la planta leñosa alpino, procumbens Loiseleuria (azalea alpina). (A) Visible imagen luz del tallo de la azalea alpina mostrando tallo central, hojas unidas, y yemas terminales. (B - C) de congelación se inicia en el tallo y el hielo se propaga a cabo en hojas. Yemas terminales permanecen sin congelar. (D - E) yemas terminales congelan independientemente 126-164 minutos después de la congelación inicial de tallo y hojas. Durante este tiempo el calor de entalpía producida por la congelación del tallo y las hojas ya se ha disipado. Kuprian y Neuner, unpublished.

Figura 8
Figura 8. barreras hidrófobos bloquean extrínseca inducida nucleación congelación de tomate (Solanum lycopersicon). (A) material a base de caolín hidrófobo aplicado a plantas de tomate. (B - C). Reducción del nivel de contacto entre la superficie de las hojas y las gotas de líquido que contiene bacterias INA sobre recubierto (B) vs. sin recubrimiento (C) hojas. (D) la planta sin recubrimiento (derecha) se somete a una reacción exotérmica asociada con la congelación de la planta, mientras que la planta sigue siendo revestido superenfriada y sin congelar a aproximadamente -6 ° C. Esta cifra ha sido modificado desde Wisniewski et al. 34

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Discussion

El agua tiene la capacidad de superenfriar a temperaturas muy por debajo de 0 ° C y la temperatura a la que el agua se congele puede ser bastante variable. 36 El límite de temperatura para el subenfriamiento del agua pura es de aproximadamente -40 ° C y se define como el punto de nucleación homogénea. Cuando el agua se congela a temperaturas más cálidas a -40 ° C, se produce por la presencia de nucleantes heterogéneos que permiten a los pequeños embriones de hielo para formar y que constituirán un catalizador para la formación de hielo y el crecimiento. 37 Hay una multitud de moléculas en la naturaleza que actuar como agentes de nucleación de hielo como muy eficiente, por lo tanto la mayoría de congelación del agua en la naturaleza se produce a temperaturas justo por debajo de 0 ° C. La capacidad de regular o influir en la actividad de los agentes nucleantes heterogéneos tiene un potencial significativo como un enfoque novedoso para proporcionar protección contra las heladas a las plantas. La comprensión de cómo se forma hielo y se propaga en la congelación de las plantas sensibles y tolerantes de congelación es esencial para achieving este objetivo.

Como se ha indicado en la introducción, varios métodos se han utilizado para estudiar el proceso de congelación en las plantas bajo condiciones de laboratorio, sin embargo, la congelación de las plantas en la naturaleza ha sido supervisado principalmente con el uso de termopares. Termografía de alta resolución de infrarrojos (HRIT) 24-28,34, ofrece varias ventajas distintas como un método para estudiar el proceso de congelación en las plantas. HRIT permite observar el sitio inicial de la formación de hielo, el número de eventos de congelación necesarios para congelar una planta entera, en realidad observar cómo se propaga el hielo en una planta y si las barreras a la propagación de hielo están presentes, y determinar si cualquier parte de un planta permanezca libre de hielo. Lo más importante es que permite observar el proceso de congelación en plantas enteras en lugar de porciones pequeñas, aisladas de una planta que se han eliminado de la planta madre.

El presente informe describe la aplicación de HRIT al estudio de FreezING en plantas intactas o partes de plantas, y proporciona varios ejemplos de cómo esta tecnología puede usarse para examinar varios parámetros que pueden influir en cómo y cuando se forma hielo en las plantas, y cómo se propaga hielo. Aspectos críticos de la realización de estos estudios implican la sensibilidad y la exactitud de la cámara de infrarrojos, los parámetros utilizados en la configuración de la cámara y la grabación de secuencias de vídeo, la velocidad de enfriamiento, la complejidad estructural / morfológica del sujeto que se vieron, y conocimiento acerca de ciencia de infrarrojos. Estos artículos se abordarán de forma individual.

La sensibilidad y la exactitud de la cámara de infrarrojos (radiómetro)

Los eventos exotérmicas durante la congelación de tejidos de plantas que están siendo visualizados son muy pequeñas, que van desde <0,1 a aproximadamente 0,5 ° C. Por lo tanto la cámara de infrarrojos debe ser lo suficientemente sensible para diferenciar fácilmente los pequeños cambios en la temperatura. Precisión de la temperatura también es un aspecto importante yrequiere que la cámara se calibra de forma regular (al menos una vez al año). Si bien esto se puede hacer por el usuario, que requiere el uso de varios cuerpos negros que cubren una amplia gama de temperaturas. Por lo tanto, lo mejor es tener el calibrado de fábrica de la cámara. Si un alto nivel de precisión de la temperatura es absolutamente esencial, es muy recomendable que un termopar se utiliza en conjunción con la cámara infrarroja. Esto puede ser montado cerca del objeto en estudio para dar una estimación precisa de la temperatura del aire.

Parámetros de la cámara

Una gran cantidad de parámetros se puede ajustar en cámaras de infrarrojos avanzados, de alta gama. En el uso de la cámara para ver y / o grabar congelación eventos, es importante que un promedio de imagen se utiliza para reducir una imagen con ruido, por lo que es más fácil de visualizar partes de la planta y eventos de congelación. Promedio de imagen se produce cuando se selecciona una imagen de alta calidad en los ajustes de la cámara. Desde exotermia por congelación menors se espera, también es importante cuando se visualiza el proceso de congelación para establecer el período de tempertura de la cámara para cubrir un pequeño rango de temperatura (2-5 ° C). Esto es necesario porque el software distribuirá la paleta de color seleccionado en el lapso completo establecido para la cámara. Por lo tanto, si hay 10 colores de la paleta y uno tiene el lapso establecido en 100 ° C, su sólo sería un cambio de color si había un cambio de 10 ° C en la temperatura. Una tasa de captura de alta (diez fotogramas por segundo) se debe utilizar de manera que los pequeños eventos exotérmicas, que disipan rápidamente, no se pierdan. Los diferentes paletas de color y escala de grises se pueden seleccionar de un menú desplegable. La selección de la gama de colores más adecuada debe basarse en si es o no ofrece la mejor opción para la visualización de los eventos térmicos de interés. Cámaras avanzados también ofrecen varias opciones para la grabación de una secuencia de vídeo y / o la captura de imágenes individuales. Un número específico de fotogramas más de una duración de tiempo establecido se puede seleccionar.Este es el mejor para las secuencias de grabación de corta duración (minutos) en lugar de horas. Alternativamente, el número de fotogramas por segundo puede ser indicado y que la cámara ajuste para detener la grabación manualmente o después de un número específico de tramas. Cámaras avanzados también ofrecen la opción para las grabaciones que se inicien o finales sobre la base de disparadores predefinidos (temperatura o tiempo).

Velocidad de enfriamiento

Es importante que la temperatura del material de la planta que se está viendo no difiere drásticamente de la temperatura del aire durante el enfriamiento. Si la temperatura se baja demasiado rápido, las plantas supercool y congelar a una temperatura de aire inferior que lo harían bajo velocidades de enfriamiento naturales. La mayoría de los estudios recomiendan una velocidad de enfriamiento de 1-2 ° C hr -1, especialmente a temperaturas superiores a -5 ° C, que proporciona tiempo suficiente para que las plantas vienen a equilibrio con la temperatura del aire. En la actualidad, el material vegetal puede entrar en equilibrio mucho más rápido. Estese puede determinar mediante la comparación de la temperatura del material vegetal con la temperatura del fondo alrededor de la planta. Si la planta está en equilibrio, será difícil discernir la planta de su fondo en la imagen infrarroja, ya que será a la misma temperatura que el fondo y la imagen aparecerá a ser casi homogénea en color.

Estructural complejidad morfológica del objeto que se está viendo

Dado que las imágenes que se están vistos representan imágenes de la temperatura, los objetos que se superponen aparecerán como objetos contiguos en lugar de objetos discretos. Esto puede hacer que discernir donde los eventos de congelación se están produciendo muy difícil y también aumentar la dificultad en la determinación de cómo se propaga hielo en la planta. La mejor manera de lidiar con este problema es primer trabajo con objetos simples (hojas individuales, tallos, etc.) y luego construir hasta objetos más complejos. La experiencia en el trabajo con ma específicarial tiene un gran valor en el tratamiento de este problema. Además, la capacidad de superponer la imagen infrarroja en la parte superior de una imagen digital, luz visible también puede ayudar en gran medida en el análisis y la comprensión de los datos infrarrojos.

El conocimiento de la ciencia de infrarrojos

Aunque sería ventajoso ser capaz de simplemente apuntar la cámara hacia un objeto y saber que los datos de temperatura recibidos es fiable al 100%, la comprensión de cómo interactúa la energía infrarroja con su entorno puede aumentar considerablemente los comprensión de la mejor manera de utilizar el grado de investigación cámaras infrarrojas e interpretar los datos. Uno debe convertirse en algo familiarizado con los términos de emisión, reflexión y absorción. Para la mayor parte, la cámara se puede utilizar sin tener que preocuparse acerca de estos parámetros, sin embargo, pueden ayudar a explicar la naturaleza de la imagen que se muestra y su calidad y precisión global. Brevemente, cuando la energía infrarroja golpea un objeto que puede ser o bien reflected o absorbida y emitida a continuación. La naturaleza del objeto en estudio, por lo tanto, pueden afectar la exactitud de los datos que se recibió. Si un objeto tiene una alta reflectancia, uno recibirá una imagen más representativa de los objetos que lo rodean que están emitiendo la energía infrarroja que el objeto en sí. Absorbancia de energía infrarroja sin emitir la energía infrarroja también puede conducir a la obtención de datos de temperatura falsas desde el objeto en estudio. Los sensores de la cámara detectan emiten energía infrarroja, por lo tanto, las temperaturas más precisos se obtienen a partir de los objetos que tienen un alto nivel de emisividad. Afortunadamente, las plantas tienen un alto nivel de emisividad que permite mediciones precisas de temperatura. Niveles más bajos de emisividad se pueden compensar ajustando este parámetro en los ajustes de la cámara que luego utilizar un algoritmo para hacer un ajuste adecuado en la lectura de la temperatura.

La capacidad de determinar cómo y cuando las plantas se congelan con precisiónes esencial para entender la evolución del mecanismo de congelación-evitación y el papel de la estructura de la planta en el proceso de congelación. Congelación, a pesar de su aparente sencillez, es un proceso complejo y las plantas han desarrollado una serie de adaptaciones estructurales para evitar la congelación, compartimentar la formación de hielo, y prevenir la propagación de hielo. Alta resolución de la termografía infrarroja es una herramienta novedosa y potente que se puede utilizar para estudiar la complejidad del proceso de congelación en las plantas y conducir al desarrollo de nuevos métodos eficaces de protección contra las heladas. Una mejor comprensión de congelación-evitación también puede ayudarnos a comprender cómo han evolucionado estos mecanismos de adaptación, y el papel que jugar en la biología y la supervivencia de las diferentes especies de plantas.

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Disclosures

Los autores no tienen intereses financieros en competencia o conflictos de intereses.

Acknowledgments

Esta investigación fue financiada por el Fondo de Ciencias de Austria (FMF): P23681-B16.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Infrared Camera FLIR SC-660 Many models available depending on application
Infrared Analytical Software FLIR ResearchIR 4.10.2.5 $3,500
Pseudomonas syringae (strain Cit-7) Kindly provided by Dr. Steven Lindow, University of California  Berkeley icelab@berkeley.edu
Pseudomonas Agar F Fisher Scientific DF0448-17-1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Taschler, D., Beikircher, B., Neuner, G. Frost resistance and ice nucleation in leaves of five woody timberline species measured in situ during shoot expansion. Tree Physiol. 24, 331-337 (2004).
  2. Neuner, G., Hacker, J. Ice formation and propagation in alpine plants. Plants in alpine regions: Cell Physiology of adaptation and survival strategies. Lütz, C. , Springer. 163-174 (2012).
  3. Ladinig, U., Hacker, J., Neuner, G., Wagner, J. How endangered is sexual reproduction of high-mountain plants by summer frosts? - Frost resistance, frequency of frost events and risk assessment. Oecologia. 171, 743-760 (2013).
  4. Wisniewski, M. E., Gusta, L. V., Fuller, M. P., Karlson, D. Ice nucleation, propagation and deep supercooling: the lost tribes of freezing studies. Plant Cold Hardiness: from the laboratory to the field. Gusta, L. V., Wisniewski, M. E., Tanino, K. K. , CAB International. 1-11 (2009).
  5. Bokhurst, S., Bjerke, J. W., Davey, M. P., Taulavuori, K., Taulavuori, E., Laine, K., Callaghan, T. V., Phoenix, G. K. Impacts of extreme winter warming events on plant physiology in a sub-Arctic heath community. Physiol. Plant. 140, 128-140 (2010).
  6. Taulavuori, K., Laine, K., Taulavuori, E. Experimental studies on Vaccinium myrtillus.and Vaccinium vits-idea.in relation to air pollution and global change at northern high latitudes: A review. Env. Exp. Bot. 87, 191-196 (2013).
  7. Wisniewski, M., Glenn, D. M., Gusta, L., Fuller, M. Using infrared thermography to study freezing in plants. HortScience. 43, 1648-1651 (2008).
  8. Gu, L., et al. The 2007 eastern US spring freeze: increased cold damage in a warming world. BioScience. 58, 253-262 (2008).
  9. Augspurger, C. K. Spring warmth and frost: phenology, damage, and refoliation in a temperate deciduous forest. Func. Ecol. 23, Spring. 1031-1039 (2007).
  10. Neuner, G., Erler, A., Hacker, J., Ladinig, U., Wagner, J. Frost resistance of reproductive tissues in various reproductive stages of high alpine plant species. Physiol. Plant. 147, 88-100 (2013).
  11. Skre, O., Taulavuori, K., Taulavuori, E., Nilsne, J., Igeland, B., Laine, K. The importance of hardening and winter temperature for growth in mountain birch populations. Env. Exp. Bot. 62, 254-266 (2008).
  12. Hänninen, H., Tanino, K. Tree seasonality in a warming climate. Trends in Plant Science. 16, 412-416 (2011).
  13. Katz, R. W., Brown, B. G. Extreme events in a changing climate: variability is more important than averages. Climate Change. 21, 289-302 (1992).
  14. Wisniewski, M., Gusta, L. Understanding plant cold hardiness: an opinion. Physiol. Plant. 147, 4-14 (2013).
  15. Wisniewski, M., Gusta, L., Neuner, G. Adaptive mechanisms of freeze avoidance in plants. A brief update. Env. Exp. Bot. 99, 133-140 (2014).
  16. Burke, M. J., Gusta, L. V., Quamme, H. A., Weiser, C. J., Li, P. H. Freezing and injury in plants. Annu. Rev. Plant Physiol. 27, 507-528 (1976).
  17. Ishikawa, M., Price, W. S., Ide, H., Arata, Y. Visualization of freezing behaviors in leaf and flower buds of full-moon maple by nuclear magnetic resonance microscopy. Plant Physiol. 115 (4), 1515-1524 (1997).
  18. Ishikawa, M., Sakai, A. Characteristics of freezing avoidance in comparison with freezing tolerance: a demonstration of extra-organ freezing. Plant cold hardiness and freezing stress. Li, P. H., Sakai, A. , Academic Press. 325-340 (1982).
  19. Buchner, O., Neuner, G. Freezing cytorrhysis and critical temperature thresholds for photosystem II in the peat moss Sphagnum capillifolium. Protoplasma. 243 (1), 63-71 (2010).
  20. Pearce, R. S. Extracellular ice and cell shape in frost-stressed cereal leaves: A low temperature scanning electron microscopy study. Planta. 175, 313-324 (1988).
  21. Ashworth, E. N., Anderson, J. A., Davis, G. A., Lightner, G. W. Ice formation in Prunus persica. under field conditions. J. Am. Soc. Hort. Sci. 110 (3), 322-324 (1985).
  22. Ashworth, E. N., Davis, G. A. Ice formation in woody plants under field conditions. HortSci. 21, 1233-1234 (1986).
  23. Pramsohler, M., Hacker, J., Neuner, G. Freezing pattern and frost killing temperature of apple (Malus domestica.) wood under controlled conditions and in nature. Tree Physiol. 32 (7), 819-828 (2012).
  24. Wisniewski, M., Lindow, S. E., Ashworth, E. N. Observations of ice nucleation and propagation in plants using infrared video thermography. Plant Physiol. 113 (2), 327-334 (1997).
  25. Lutze, J. L., et al. Elevated atmospheric [CO2] promotes frost damage in evergreen tree seedlings. Plant Cell Environ. (6), 631-635 (1998).
  26. Ball, M. C., et al. Space and time dependence of temperature and freezing in evergreen leaves). Func. Plant Biol. 29 (11), 1259-1272 (2002).
  27. Sekozawa, Y., Sugaya, S., Gemma, H. Observations of ice nucleation and propagation in flowers of Japanese Pear (Pyrus Pyrifolia). Nakai) using infrared video. 73 (1), 1-6 (2004).
  28. Hacker, J., Neuner, G. Ice propagation in plants visualized at the tissue level by IDTA (infrared differential thermal analysis). Tree Physiol. 27, 1661-1670 (2007).
  29. Hacker, J., Neuner, G. Ice propagation in dehardened alpine plant species studied by infrared differential thermal analysis (IDTA). Arc. Antarc. Alp. Res. 40 (4), 660-670 (2008).
  30. Hacker, J., Spindelböck, J., Neuner, G. Mesophyll freezing and effects of freeze dehydration visualized by simultaneous measurement of IDTA and differential imaging chlorophyll fluorescence. Plant Cell Environ. 31, 1725-1733 (2008).
  31. Neuner, G., XU, B., Hacker, J. Velocity and pattern of ice propagation and deep supercooling in woody stems of Castanea sativa., Morus nigra. and Quercus robur. measured by IDTA. Tree Physiol. 30, 1037-1045 (2010).
  32. Hacker, J., Ladinig, U., Wagner, J., Neuner, G. Inflorescences of alpine cushion plants freeze autonomously and may survive subzero temperatures by supercooling. Plant Sci. 180, 149-156 (2011).
  33. Kuprian, E., Briceno, V., Wagner, J., Neuner, G. Ice barriers promote supercooling and prevent frost injury in reproductive buds, flowers and fruits of alpine dwarf shrubs throughout the summer. Env. Exp. Bot. 106, 4-12 (2014).
  34. Wisniewski, M., Glenn, D. M., Fuller, M. Use of a hydrophobic particle film as a barrier to extrinsic ice nucleation in tomato plants. HortScience. 127, 358-364 (2002).
  35. Aryal, B., &Neuner, G. Leaf wettability decreases along an extreme altitudinal gradient. Oecologia. 162, 1-9 (2010).
  36. Wisniewski, M., Fuller, M. P. Ice nucleation and deep supercooling in plants: new insights using infrared thermography. In: Cold adapted organisms. Ecology, physiology, enzymologyandmolecularbiology. Margesin, R., Schinner, F. , Springer. 105-118 (1999).
  37. Franks, F. Biophysics and biochemistry at low temperatures. , Cambridge University Press. (1985).
  38. Neuner, G., Kuprian, E. Infrared thermal analysis of plant freezing processes. Methods in Molecular Biology: Plant Cold Acclimation. Hincha, D., Zuther, E. , Springer. 91-98 (2014).

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El uso de alta resolución Termografía Infrarroja (HRIT) para el Estudio de Hielo La nucleación y Hielo Propagación de Plantas
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Wisniewski, M., Neuner, G., Gusta, L. V. The Use of High-resolution Infrared Thermography (HRIT) for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants. J. Vis. Exp. (99), e52703, doi:10.3791/52703 (2015).

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