Introduction
Modelos de ratinhos transgénicos têm sido fundamentais para avaliar a patofisiologia da doença de Alzheimer (AD), assim como o potencial de intervenções terapêuticas. Tarefas cognitivas, tais como o labirinto de água de Morris (MWM), são comumente usados com estes modelos para identificar as correlações moleculares de défices de memória e para avaliar a eficácia de drogas pré-clínicos. É essencial, no entanto, que o intervalo dinâmico da tarefa cognitiva ser grande o suficiente para detectar os efeitos do tratamento subtis. Com modelos do rato do AD, déficits cognitivos são tipicamente dependente da idade, e camundongos exibir declínios progressivos no desempenho (por exemplo, 1). Uso de uma tarefa cognitiva sensível pode permitir a detecção de diferenças subtis no início da vida do animal, reduzindo assim os custos associados com os animais de envelhecimento. Por exemplo, a redução do número de ensaios de formação nos Barnes dependente do hipocampo labirinto 15-5 aumentado a dificuldade da tarefa, resultando na detection de déficits no modelo 3xTg em uma idade mais cedo do que anteriormente relatados 2. A detecção precoce de défices não só oferece um tempo considerável e economia de custos, mas também aumenta a probabilidade de que as alterações moleculares subjacentes défices cognitivos podem ser identificados.
Um fator que influencia a sensibilidade de tarefas cognitivas é o fundo genético estirpe do modelo do rato. Por exemplo, ratinhos BALB / c, exibem um desempenho superior em tarefas de aprendizagem e memória em comparação com outras estirpes, tais como o C57BL / 6 3. A F1 FVB / N x 129S6 fundo é utilizado para dois dos modelos mais utilizados de AD, o Tg2576 e RTG (TauP301L) 4.510 modelos. Esta estirpe exibe superiores capacidade de aprendizagem na MWM em relação a outras estirpes, incluindo B6 / SJL 4. Devido a esta capacidade de aprendizagem superior, o uso de uma única sonda após o treinamento extensivo pode mascarar diferenças entre os grupos resultantes de excesso de treinamento. Além disso, o sensitivity de ensaios de sondagem pode ser dependente da idade. Nós já haviam demonstrado que os ensaios anteriores da sonda, após o treinamento plataforma escondida limitado, são mais sensíveis às diferenças nas jovem Tg2576 em comparação com controles jovens da mesma ninhada de transgenes-negativos do que são ensaios sonda inserida após mais extensa formação 5. Em contraste, os ensaios seguintes sonda extensa formação são mais sensíveis em mais velho (20-25 meses) ratinhos Tg2576 em comparação com ninhada são maiores de ensaios de sondas anteriores 5. Por intercalando ensaios de sonda ao longo de formação, a probabilidade de que um ensaio sensível será identificado é aumentada, em particular se o teste é realizado longitudinal e a sensibilidade de um ensaio de sonda particular é dependente da idade. A Figura 1 mostra o desempenho superior de F1 FVB / N x camundongos 129S6 sob o protocolo otimizado para esta estirpe em comparação com os ratos do fundo B6 / SJL treinados sob um protocolo com a mais extensa formação.
A MWM égeralmente pensado para fornecer medidas confiáveis que são reproduzíveis através do tempo e laboratórios 6. Por exemplo, o protocolo primário usado originalmente por nosso laboratório 1,7 Minnesota foi implementado com sucesso com pequenas modificações na West Virginia University 8. Da mesma forma, níveis equivalentes de insuficiência foram observados em RTG (TauP301L) 4510 ratinhos relativamente ao controlo da mesma ninhada se alojados sob condições isentas de agentes patogénicos ou convencionais 9. No entanto, o ambiente de teste pode influenciar a sensibilidade da tarefa MWM. Fatores como a iluminação da sala, saídas de ar, gradientes de temperatura e ruídos, tudo contribui para estímulos ambientais 4 que em última instância pode influenciar o desempenho. Quando nosso laboratório Minnesota e biotério foram transferidos para um novo prédio, uma redução de até 38% no desempenho do tipo selvagem foi observado, reduzindo substancialmente o alcance dinâmico da tarefa ea capacidade de detectar déficits relacionados ao transgene. Esta mudança no performance ocorreu apesar projetar a sala de ensaios para ser do tamanho e configuração equivalente, e usando as mesmas indicações visuais aplicados. Um "re-optimização" do protocolo original foi necessária para aumentar a gama dinâmica da tarefa MWM no novo ambiente de teste.
Aqui o protocolo original adaptado para uso com o F1 FVB / N x 129S6 fundo 5 está descrito. Uma vez que alguns estudos sugerem que o stress está associada com o mau desempenho MWM 10 e de pré-tratamento pode aliviar este défice induzido pelo stress no desempenho 11, um protocolo pré-tratamento foi concebido para aclimatar os ratos para a introdução e a remoção da piscina antes do teste MWM . Na sequência de pré-tratamento, os ratos submetidos a treinamento plataforma visível, em que uma plataforma elevada é marcado com uma bandeira. Formação plataforma visível é usado para identificar os ratos com problemas de desempenho relacionadas a anormalidades sensório-motoras. Usando critérios de exclusão descritos no protseção OCOL, os ratos-desempenho incompetente são removidos exames subseqüentes de ensaios de formação de plataforma e de sondas escondidas. Deficiências em ensaios de formação de plataforma e de sondas escondidas são interpretados como déficits cognitivos porque o desempenho sensório-motor é fatorado fora dos dados. Após a conclusão da formação plataforma visível, os ratinhos começam treino na plataforma escondida onde a plataforma está submersa em água e mantém-se na mesma posição em relação aos estímulos externos. Ensaios em que a plataforma é removida (ensaios de sonda) são intercaladas ao longo treino na plataforma escondida para avaliar a influência do treinamento adicional. Porque os ensaios de sonda ocorrer no início de cada dia, antes do treino adicional plataforma escondida, os ensaios de sonda medir a capacidade do animal para se lembrar a localização da plataforma depois de uma demora de 20 horas, considerado como uma medida da memória de referência 12. Finalmente, maneiras em que este protocolo original foi re-otimizado quando mudanças no ambiente de testedesempenho do controle interrompido são descritos.
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Protocol
Todos os procedimentos experimentais foram conduzidos de acordo com as normas de cuidado e uso Comitê Institucional Animal (IACUC) e aprovado pelo IACUC do West Virginia University.
1. Pré-tratamento
- Set Up the Pool
- Prop a piscina de pré-tratamento de modo que é elevada a uma altura confortável.
- Coloque 2 L de água (21 ° C) na piscina pré-manipulação para um nível de cerca de 1 cm.
Nota: Não adicionar corante.
- Procedimento
- Traga os ratos provenientes do biotério para a sala de ensaios.
- Verifique se a identificação do sujeito (número de registro assunto, rabo tatuagem, clipe de orelha, etc.).
- Mark cauda do rato com um marcador permanente para distinguir os ratos dentro da gaiola que passaram por testes daqueles que ainda precisam ser testados pré-assistência. Marcar todos os ratos em cada gaiola com a mesma cor.
- Coloque um rato no copo de transferência para approximately 5 sec. Em seguida, despeje cuidadosamente o mouse para fora do copo na piscina pré-tratamento.
- Usando um temporizador, permitir que o rato permanecer na piscina durante 20 seg.
- Após 20 segundos, coloque delicadamente a colher (sem dobrando-lo) na frente do mouse. Resumidamente permitir que o mouse para explorar a colher, e se necessário, incentivar o mouse para pegar a colher, deslizando suavemente a colher sob o mouse, enquanto lentamente levantar. Tome cuidado para não assustar os ratos com a colher.
- Uma vez que o mouse está na colher, transportá-lo de volta para a jaula exploração.
- Repita estes procedimentos para cada rato na gaiola, uma vez por dia durante 10 dias. Em intervalos regulares (por exemplo, após cada animal), pegar fecal boli e roupa de cama da piscina usando uma rede.
- Lavar o copo de transferência com água em intervalos regulares (por exemplo, após a conclusão de uma gaiola de ratos).
- Quando essas etapas forem concluídas, lavar o copo de transferência com água várias vezes, despejar a água dea piscina, e lavar a piscina aproximadamente duas vezes com água.
2. Formação Plataforma Visible
- Configuração do mouse Rastreamento Desempenho Software por exemplo Viewer (Veja a Tabela de Materiais).
- Calibrar o vídeo para corresponder às dimensões do labirinto sob a "Configuração" - "Filtros e Objectos" guia.
- Definir filtros para que o software pode diferenciar um rato do fundo.
- Ajuste a "sensibilidade" abaixo da área "filtro de fundo" para que o software de rastreamento identifica o animal.
- Clique na opção "aceitar" uma vez que o software de rastreamento identifica o animal. Escolha a opção "Editar" para apagão áreas fora da área do labirinto.
- Selecione a opção "Filtro animal" adequado e "min. tamanho do animal ".
- Criando as Folhas de executar <ol>
- Criar uma folha corrida listando cada rato, cada local potencial, e um espaço para anotações contendo informações sobre o comportamento aberrante.
- Predetermine locais para o teste plataforma visível, que são as mesmas para cada grupo de ratinhos. Assim, para o primeiro ensaio, pré-determinar que a plataforma vai ser colocado no lado oposto ao onde o rato é colocado no labirinto, no lado direito perto da parede. Para o segundo ensaio, pré-determinar que a plataforma vai ser colocado num local diferente ao longo da parede de trás para cada rato e que este irá continuar para cada uma das seis ensaios.
- Pendure cortinas ao redor da sala para que quaisquer pistas espaciais são obscurecidos.
- Coloque a banheira para que coincida com a configuração no software de monitoramento, assegurando o labirinto combina com a instalação de configuração em "Configuração" - aba "Zona Definition". Nota: hELPS para garantir a banheira é no local apropriado antes de preenchê-lo com água como a banheira não é facilmente realocados após o preenchimento.
- Encha a banheira com água da torneira, e usando um termômetro, garantir a temperatura da água é de aproximadamente 21 ° C. Certifique-se de que a água permanece dentro de um grau da temperatura ao longo do teste, como a água mais fria pode afetar o desempenho, especialmente quando utilizando camundongos com idade de 8.
Nota: Não adicionar corante. - Usando os locais predeterminados, colocar a plataforma, que tem uma bandeira montada que atinge uma altura de 13 cm e é de 4,5 cm por 4,5 cm de altura com uma negrito "S" em forma de caracteres em relevo sobre ela, no primeiro local da banheira, para que ele é de aproximadamente 1 polegada acima da superfície da água.
- Dê o primeiro mouse a partir da gaiola, verificar a identificação dos sujeitos, marcar a cauda usando um marcador permanente da cor correta, e coloque no copo.
- Delicadamente, coloque o mouse na banheira, iniciar o temporizador, e garantir que o software de monitoramento é o acompanhamento do animal. Permitir que o mouse até 2 min para localizar a plataforma. Uma vez que o rato localiza a plataforma, permitir que o rato 20 segundos sobre a plataforma.
- Se o animal encontra a plataforma e começa a saltar ou cair, colher o mouse e coloque o mouse sobre a plataforma. Se o mouse continua a saltar ou cair da plataforma, mantenha o mouse sobre a plataforma, de modo que o rato aprende que permanecendo na plataforma leva a fugir da banheira.
Nota: O rato deve permanecer na plataforma durante um tempo combinado de 20 seg; assim, se o mouse salta fora após 5 segundos, a quantidade de tempo que resta na plataforma é de 15 segundos e não repõe a 20 seg. - Se o animal não consegue encontrar a plataforma no período de 2 min, colher o rato e colocá-lo na plataforma por 20 s.
- Na sequência de 20 segundos na plataforma, retire o mouse a partir da plataforma como feito no treinamento pré-manipulação e coloque o mouse em the gaiola aquecida alinhado com toalhas de papel e aquecida até ~ 31 ° C através de uma almofada de aquecimento e lâmpada de calor durante 30 segundos. Efectuar a avaliação periódica da temperatura do corpo com um termómetro rectal para assegurar que certas estirpes de ratos ou ratinhos de uma certa idade não são diferencialmente suscetíveis à hipotermia induzida por exposição à água.
- Depois de 2 minutos para a jaula exploração com a lâmpada de aquecimento, transferir o mouse para a gaiola de exploração com apenas uma almofada de aquecimento, mas nenhum lâmpada de calor, para se recuperar entre ensaios. Eventualmente, coloque todos os ratos de uma gaiola única casa na mesma gaiola de retenção durante o ensaio.
- Limpe o labirinto de escombros com uma rede depois de cada rato foi concluído um estudo, para interromper pistas olfactivas.
Nota: A plataforma permanecerá na mesma localização para cada ratinho durante um único ensaio e serámudou-se para os outros locais pré-determinados para os ensaios seguintes. Isto é feito para assegurar que os ratos 1) aprender existe uma plataforma para escapar, 2) nadar directamente para a plataforma visível, demonstrando assim competência visuais intacta, e 3) não têm défices motores.
Nota: O uso de um temporizador de mão também pode ser benéfico para assegurar a precisão do software de rastreamento.
3. Formação Morris plataforma escondida Water Maze
- Set Up quarto
- Pendurar cortinas na sala para obscurecer pistas espaciais no laboratório.
- Coloque sinais estrategicamente nas cortinas. Certifique-se de que as pistas são grandes e contêm cores contrastantes (ex .: preto e branco) para melhor visibilidade. Pendure sinais à distância e altura onde eles são visíveis para os ratos de dentro da banheira. Nota: As pistas são estáticas e não se movem durante o decurso do teste.
- Configuração do Software mouse Rastreamento Desempenho
- Calibrar o vídeo para corresponder às dimensões do labirinto sob a "Configuração" - "Filtros e Objectos" guia.
- Definir os filtros de modo a que o software pode diferenciar a partir de ratinhos do fundo.
- Use os mesmos processos como descrito no teste de plataforma visível (passos 2.1.2.1-2.1.2.3) para definir-se os filtros para labirinto aquático de Morris treino na plataforma escondida.
- Criar quatro quadrantes iguais dentro do labirinto
- Cliquea opção "Ellipse" sob a guia "Zona Definition" em primeiro lugar, e criar um círculo que corresponda ao labirinto na tela. Nota: Nesta guia, o labirinto real configurado é exibido, por isso permite que a opção para corresponder à configuração do computador com a configuração actual labirinto.
- Clique na opção "Retângulo" e criar quatro quadrados iguais. Coloque esses quadrados na tela para criar quatro quadrantes iguais dentro do círculo recém-criado.
- Criar as plataformas no labirinto.
- Escolher a opção "elipse", e criar um círculo o tamanho da plataforma que irá ser utilizado. Nota: Colocar a plataforma no labirinto de antemão pode ser benéfica para criar uma elipse do tamanho exacto da plataforma.
- Coloque a localização da plataforma recentemente criada no centro do quadrante alvo. (Recomenda-se a nomear esta "alvo" objeto de distinguir as plataformas corretas do resto). Passo crítico: Na caixa de apenas below "Grid", selecione a opção "stop" em "gatilho" para a plataforma de destino. Isso fará com que o programa para parar uma vez que o mouse chega à plataforma.
- Crie outros três zonas de plataformas idênticas, e colocá-los nos locais exatos em outros quadrantes. Não selecione "parar" na opção "gatilho".
- Criando as Folhas Run
- Criar uma folha corrida listando cada rato, cada ensaio, um espaço para anotar o tempo para alcançar a plataforma, e um espaço para observar o comportamento aberrante (Tabela 1).
- Pré-determinar o ponto de lançamento de cada rato de uma forma pseudo-aleatório. Use selecção pseudo-aleatórios de modo a que a distância até à plataforma é igual cada dia, cada um dos quatro locais é utilizado igualmente e o ângulo desde o início para a plataforma (isto é., A partir da esquerda ou para a direita) é equilibrada dentro e entre os dias.
Nota: a localização da plataforma na corridafolha para assegurar a localização da plataforma não se move a partir da posição original. Certifique-se de que a plataforma está no centro de um dos quatro zonas que foram criados no software de rastreio.
Nota: Se o teste longitudinal está sendo realizado em várias idades, mover a plataforma para um novo local para cada idade.
- Configurar o labirinto
- Ajuste ou o labirinto de água ou a câmera de forma que existe uma correspondência entre o labirinto e da definição da configuração em "Configuração" - aba "Zona Definition".
- Rotular os quatro quadrantes invisíveis do labirinto (N, S, E, W). Verifique se estes dados coincidirem com a configuração do software de monitoramento para garantir ratos estão sendo liberados a partir dos pontos de partida corretos.
Passo Crítico: Coloque estas etiquetas fora do labirinto e fora da vista de um animal de natação dado que as pistas dentro do labirinto constitui um não-hipocampal tarefa não espacial, dependentes. - Encha o labirinto com torneira wateR (aproximadamente 21 ° C), de modo que a plataforma é de aproximadamente 5 mm abaixo da superfície da água.
- Coloque a plataforma na localização predeterminada.
Nota: A localização da plataforma continuará a ser o mesmo para todos os ratos que estão sendo testados em todos os dias e provações. - Use non-toxic tinta têmpera branca para fazer a água opaca. Faça isso para garantir que a parte superior da plataforma é invisível a partir do nível dos olhos dos animais enquanto nadava.
- Procedimento
- Leve o mouse da gaiola, marcar a cauda usando um marcador permanente da cor correta, e coloque no copo.
- Suavemente para o rato dentro do labirinto, de modo a entrar de frente para a parede. Nota: Cada ratinho irá ser colocado no mesmo local de partida para um ensaio único.
- Na versão inicial do mouse, iniciar o temporizador e ficar em uma área onde o testador não é facilmente visível pelos ratos. Certifique-se de que o software de rastreamento de animais está seguindo corretamente o animal. Uma vez que o animal chega à plataforma, para permitir que ele permanecer na plataforma durante 15 seg.
Nota: Isso permite que o animal para orientar a sua localização espacial dentro da sala. - Depois de 15 segundos sobre a plataforma, remover o animal a partir do labirinto e retornar o rato para o compartimento aquecido.
- Se o rato encontra a plataforma e prossegue para saltar ou cair antes de 15 seg, colher o rato e colocá-lo de volta na plataforma para o restante do 15 seg para que o rato aprende a associar a plataforma com fuga.
- Se o mouse não localizar a plataforma dentro de 60 segundos, retire delicadamente o rato e colocá-lo na plataforma. Deixe-a permanecer na plataforma durante 15 segundos, em seguida, remover o animal com a colher e trazê-lo de volta para a jaula aquecida.
- Limpe o labirinto de escombros com uma rede de interromper pistas olfactivas.
- Repita estes procedimentos para os restantes ratinhos do grupo. Assim, para os dias de ensaio de 4 a 9, realizar quatro ensaios de trem plataforma escondidaing por dia, com cerca de 20 min entre cada tentativa.
- Alterar a localização pseduorandomly de partida para cada tentativa. Assim, durante o julgamento 1, solte todos os ratos do mesmo local de partida, em seguida, repita o procedimento a partir de uma posição de partida diferente para os ensaios seguintes. Todos os dias, variam os pontos de liberação para garantir animais não desenvolvem um não-hipocampal estratégia motora não-espacial, dependentes. Por exemplo, se os ratos são libertados a partir de N, S, E, W e pontos no dia um, não libertá-los na mesma ordem que no dia seguinte.
- Durante o treinamento plataforma escondida, use o software de monitoramento animal para medir a latência para alcançar a plataforma, a extensão de caminho do animal, bem como a percentagem de tempo ou distância do animal gasta em cada quadrante labirinto. Obter estas medições a partir da guia "labirinto de água" em "Lista de experiências" e podem ser exportados diretamente para uma planilha Excel.
Nota: O uso de um temporizador lado garante a precisão do seguimentoProgramas.
4. Ensaios de sonda
- Configuração do Software mouse Rastreamento Desempenho
- Use os mesmos processos como no procedimento plataforma escondida do labirinto de água de Morris (passos 3.2.1-3.2.4.3) com uma excepção. Passo crítico: Para os ensaios de sondagem, assegurando que a opção "stop" para "gatilho" é desligada durante os ensaios de sondagem. Isso vai evitar que o programa parando quando um rato cruza a área da plataforma.
- Criando as Folhas Run
- Criar uma folha corrida listando cada rato, cada ensaio, e um espaço para observar o comportamento aberrante. Pré-determinar o ponto de lançamento durante os ensaios de sonda de tal forma que eles se alternam entre os dois lados opostos da plataforma. Deste modo, pré-determinar os pontos de liberação de tal modo que os ratos não são libertados a partir dos dois lados, que são adjacentes à plataforma.
- Procedimento
- Realização de ensaios de sondas semelhantes a formação plataforma escondida, com a excepção que nenhuma plataforma está no labirinto.
- Solte um rato a partir de um ponto de libertação predeterminado. Durante o julgamento de sonda, retire a plataforma eo rato tem 60 segundos para nadar no labirinto.
- Durante o teste, realizar quatro ensaios de sondagem. Alterar o ponto de lançamento dos ratos entre as tentativas de sonda. Assim, alterar o ponto de liberação do julgamento sonda de corrente de que o julgamento de sonda anterior.
- Durante os ensaios com sonda, utilizar o software de rastreio de animal para controlar o comprimento da trajectória do animal, a percentagem de tempo que o animal passa em cada quadrante do labirinto, e o número de vezes que um animal nada sobre a área previamente platformed. Obter estas medições a partir do separador "A análise dos dados" ea guia "labirinto de água" em "lista Experimental", e exportar diretamente para uma planilha Excel.
Nota: O uso de um temporizador de mão também pode ser benéfico para assegurar a precisão do software de rastreamento. - Realizar um ensaio sonda antes deformação plataforma escondida nos dias 6, 7, 8 e 10. (Figura 2). Depois destes ensaios de sondagem, realizar quatro ensaios de plataforma escondida treinando todos os dias. Assim, realizar uma primeira sonda, imediatamente seguido por formação plataforma escondida para todos os ratos utilizando os mesmos procedimentos como descrito no capítulo 3. Em contraste, não realizar um treinamento adicional plataforma escondida após o julgamento da sonda no dia 10.
5. As análises
- Formação Plataforma visível
- Realizar medições repetidas ANOVAs separado por (a) comprimento da trajectória, (b), a latência para encontrar a plataforma, e (c) nadar velocidade, com transgene (ou outra variável, tal como o tratamento) como o entre-variável e sujeita dias ou como blocos de treino a variável intra-sujeito. Nota: Para projetos mais complexos, uma consulta com um estatístico pode ser útil. Ver 8,13 para obter informações sobre tamanhos de grupo suficiente para alimentar adequadamente esta tarefa com os modelos comumente utilizados de Alzheimer7; s doença.
- Incompetência desempenho
- Identificar os ratos-de desempenho incompetente, incluindo ratos que demonstram incompetência visual ou motora, ou animais que não adquirem os componentes processuais do teste, e remover esses ratos de análises estatísticas subsequentes de plataforma escondida e desempenho da sonda.
- Calcule a média da latência e nadar velocidade para o último dia de treinamento plataforma visível para cada rato. Remover camundongos com meios 2 desvios-padrão acima da média do grupo, pois isso pode ser um indicativo de motor ou deficiência visual.
- Identificar e remover os ratos falha para orientar ou siga a colher de fuga, ou ratos que apresentam um comportamento aberrante, como natação saca-rolhas ou flutuante.
- Identificar os ratos-de desempenho incompetente, incluindo ratos que demonstram incompetência visual ou motora, ou animais que não adquirem os componentes processuais do teste, e remover esses ratos de análises estatísticas subsequentes de plataforma escondida e desempenho da sonda.
- Formação Morris Water Maze plataforma escondida
- Conduta de medidas repetidas ANOVA em (a) comprimento da trajectória, (b), a latência para encontrar a plataforma escondida, (c) velocidade de natação, e (d) o tempo por cento ou a percentagemdistância em quadrante com transgene como a variável e ensaios entre sujeitos como a variável intra-sujeito.
- Ensaios de sonda
- Velocidade de natação
- Realizar ANOVAs de medidas repetidas em velocidade de natação em todos os ensaios de sondagem com transgene como a variável e ensaios entre sujeitos como a variável intra-sujeito.
- Índice de travessia Plataforma
- Usando a configuração do julgamento sonda para cada rato, índice cruzamento plataforma (PCI) é calculado usando a seguinte fórmula: = PCI número de vezes que o rato cruza o local de destino - travessias médios da localização equivalente nos outros três quadrantes.
Nota: Este é conduzida para determinar se o mouse está usando uma estratégia de pesquisa espacial, como indicado por mais cruzamentos sobre a localização plataforma treinado, ou uma estratégia não-espacial de thigmotaxic natação, como indicado por cruzamentos aproximadamente iguais ao longo de todos os quatro locais. - Conduta repetidoMedidas ANOVAs no PCI com transgene como a variável e ensaios entre sujeitos como a variável intra-sujeito.
- Usando a configuração do julgamento sonda para cada rato, índice cruzamento plataforma (PCI) é calculado usando a seguinte fórmula: = PCI número de vezes que o rato cruza o local de destino - travessias médios da localização equivalente nos outros três quadrantes.
- Tempo por cento ou a percentagem distância no quadrante
- Calcula-se a percentagem de tempo ou a distância de cada rato passa nos quatro quadrantes do labirinto. Realizar medidas repetidas ANOVAS na porcentagem de tempo ou distância, com transgene como a variável e ensaios entre sujeitos como a variável intra-sujeito. Utilizar a percentagem de tempo para determinar se uma estratégia de pesquisa espacial está a ser utilizado; achados de tempo de aproximadamente 25% no quadrante alvo indicam os ratos estão realizando a nível acaso e não usando uma estratégia de pesquisa espacial.
- O / N esquecendo
- Compare a latência de travessia área de plataforma em julgamento a sonda para a latência para localizar a plataforma sobre o julgamento final do dia anterior. Nota: Se a latência da travessia da plataforma de ensaio a sonda é significativamente mais longo do que o tempo de latência para encontrar a Platform durante o último teste de plataforma escondida no dia anterior, em seguida, O / N esquecimento da localização da plataforma está a ocorrer.
- Velocidade de natação
- Análise post hoc
- Siga RMANOVAs significativas com comparações post hoc de transgene em cada tentativa.
6. Exemplo de Re-otimização para um novo ambiente de Teste
- Pré-manuseio. Realizar pré-tratamento na sala de habitação. Coloque as gaiolas sem tampas em um carrinho de transporte durante toda a sessão.
Nota: Objetivos para modificação do processo de pré-tratamento devem apresentar de forma mais gradual manipulações manipulador e exposição para os dispositivos de transporte (copo e colher) e aumentar os ratos de tempo estão na gaiola sem tampas microisolator e fora de sua gaiola em uma campo aberto e mais brilhantes condições de luz.- Dias 1 e 2
- Permitir que os ratos se adapte à mãos sendo na gaiola, seguido de tocar suave, Seguido por que está sendo levantada para inspeção tatuagem e marcação da cauda. Começando no dia 2 de pré-tratamento, coloque o material do assentamento suplementar na gaiola para fornecer material adicional para a construção do ninho e abrigo, enquanto as tampas foram removidas 9.
- Dias 3 e 4
- Colocar o copo de transporte, colher, e bandeira da plataforma visível na caixa de pré-tratamento e permitir que os ratos para explorar dois ensaios a 2 min por julgamento.
- Não use água neste protocolo durante o pré-tratamento. Em vez disso, certifique-se a caixa contém roupa de cama limpa o suficiente para cobrir o chão e é perfumado com uma pequena quantidade de palha suja feminino e masculino se ambos os sexos estão sendo testados. Mude a cama todos os dias.
- Dia 5
- Camundongos lugar na caixa de pré-tratamento contendo maca pouco suja ea bandeira plataforma visível para 3 ensaios, durante 20 segundos cada. Utilizar a proveta e a colher para transportar os ratos para e a partir da caixa.
- Formação Plataforma visível
- Definir a temperatura da água a 27 ° C (normalmente utilizado para o ambiente de teste de Minnesota).
- Retornar os ratos para a gaiola ao adquirir a plataforma cued.
- Permitir ratinhos até 60 seg para adquirir a plataforma visível.
- Realizar sessões de treinamento consistindo de três ensaios por dia durante 5 dias.
- Formação plataforma escondida
- Modificar pistas visuais. Exceto por uma grande cortina para ocultar o manipulador, eliminar ou tornar mais estreitos outras cortinas ao redor da piscina de modo a ter um quarto mais aberto. Coloque objetos adicionais sobre o quarto (por exemplo, prateleiras expostos, poster de tecido preto com um símbolo branco, uma bola de praia preto e branco, grandes chaminés negras, cadernos, e um bicho de pelúcia preto), resultando em uma cue- visuais equilibrado, mas mais variada definido do que utilizado anteriormente.
- Comece escondido treinamento plataforma de 72 horas após a conclusão da traini plataforma visívelng, com um intervalo de cerca de 30 min entre os testes.
- Realizar sessões de formação que consistem em 2 ensaios por 8 dias.
- Ensaios de sonda
- Realizar ensaios de sonda 72 horas após julgamentos de formação escondidos 8, 12, e 16.Include um intervalo de 3 dias entre ensaios 8-9 e 12-13 de treinamento.
- Defina o tempo de duração da sonda durante 30 segundos.
- Dias 1 e 2
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Representative Results
Nós temos utilizado o labirinto de água de Morris para estudar os efeitos de beta-amilóide (Tg2576 ratinhos) e P301L mutante tau (RTG (TauP301L) 4510 ratinhos) na memória de referência espacial (por exemplo, 1,5,7,8). A Figura 3 é o resultado representativo consta em nosso estudo examinando o efeito do adulto-início expressão P301L tau no aprendizado e memória 8, utilizando testes de Meio Ambiente A. Para avaliar as capacidades motoras e visuais, os ratos foram comparados entre blocos de formação de plataforma visível, onde cada bloco de treinamento consistiu de 3 ensaios. Pathlength no treinamento plataforma visível não diferiu entre controles e ratos TauP301L (Figura 3A), sugerindo transgene positivos e negativos ratos exibem natação comparáveis e os dois grupos pode ver a pista visual (bandeira) marcando a plataforma. Sem ratinhos foram identificados como desempenho-incompetentes com base nos critérios de exclusão. Em seguida, o desempenho no bloco de treino na plataforma escondida foi comparada, em que cadabloco consiste de um dia (4 ensaios) do treinamento. Como os ratos aprenderam a localização da plataforma, o comprimento da trajectória e tempo para encontrar a plataforma diminuiu. No entanto, pathlength foi significativamente maior nos ratos TauP301L comparados aos controles em cada bloco de treinamento (Figura 3B), sugerindo aprendizagem espacial foi prejudicada em camundongos TauP301L. Quatro ensaios com sonda, em que a plataforma foi removida, foram intercaladas ao longo de treino na plataforma escondida e teve lugar no início do dia, antes do início de treino na plataforma escondida. Assim, estes ensaios sonda medido memória de referência espacial. Comparando através destes quatro ensaios de sondas, controles melhorou significativamente com o treinamento adicional (Figura 3C), como indicado pelo aumento do tempo no quadrante alvo. Em contraste, os ratos TauP301L não melhorar com treinamento adicional. Assim, as maiores diferenças entre os dois grupos nessa idade ocorreu no julgamento sonda 4. Estes dados indicam que a expressão P301L tauestá associada com a aprendizagem espacial e déficits de memória de referência espacial. Enquanto a tarefa do labirinto de água pode ser relativamente estável para algumas diferenças processuais, o F1 FVB / N x 129S6 estirpe de fundo podem ser particularmente sensíveis a certas alterações ambientais. O primeiro protocolo descrito também foi utilizado com sucesso em Meio Ambiente B (por exemplo., 1,7). No entanto, o desempenho da sonda de tipo selvagem foi significativamente mais baixo quando o primeiro protocolo foi utilizado em um terceiro local, ambiente C. O protocolo optimizado re-melhorou significativamente o desempenho da sonda de tipo selvagem (Figura 4).
Figura 1:. Otimização de protocolo para Strain Fundo de tipo selvagem 7-8 meses ratos velhos foram treinados utilizando os mesmos sinais e testar ambiente. F1 FVB / N x 129S6 (N = 24) e B6 / SJL (N = 16) os ratinhos receberam primeiro 18 e 24 pla visívelensaios de formação TForm respectivamente, foram entregues aos 6 e 8 ensaios por dia, respectivamente. Ambas as estirpes recebeu 4 ensaios escondidos formação plataforma por dia. Para F1 FVB / N x 129S6 ratos, ensaios de sonda foram realizadas 20 horas seguintes 8, 12, 16, e 24 tentativas de treino. Para ratos B6 / SJL, ensaios de sonda foram realizadas 20 horas após 12, 24 e 36 ensaios de formação.
Figura 2:. Linha de tempo ratinhos receberam treino na plataforma visível durante 3 dias, 6 ensaios por dia, seguido de treino na plataforma escondida, durante 6 dias, quatro ensaios por dia. Quatro ensaios de sonda foram realizadas 20 horas após 8, 12, 16 e 24 ensaios de formação ocultos.
Figura 3: Os resultados representativos para os ratos Morris Water Maze TauP301L carregando a P humana.Gene da tau 301L foram examinados em aproximadamente 6,5 meses de idade, depois de três meses de expressão P301L tau (n = 41 e n = tauP301L 46 controles com um número aproximadamente igual de machos e fêmeas em cada grupo). (A) pathlength no treinamento plataforma visível não diferiu entre controles e ratos TauP301L (s p> 0,05). (B) Durante o treino na plataforma escondida, os ratinhos TauP301L demonstrado pathlengths significativamente maiores em todos os blocos de formação (Transgene: F (1, 83) = 41,96, p <0,0001; Transgene × Bloco: F (5, 415) = 0,6141, p = 0,69 ). (C) O controlo melhorado entre os quatro ensaios com sonda, enquanto que os ratinhos não TauP301L (Transgene: F (1, 83) = 29,1, p <0,0001; teste × Transgene: F (3, 270) = 4,91, p = 0,008). Cada bloco de treinamento consistiu de três ensaios para a formação plataforma visível ou 4 ensaios para Hidden formação plataforma. Tukey post hoc análises: * p <0,05; ** p <0,01; *** p <0,001. Porções de Figura 3 reimpressos a partir Hunsberger et al., Tamanho Efeito de déficits de memória em ratos com expressão P301L tau na idade adulta, Behav Brain Res, Vol. 272, pp. 181-95. Direitos de autor 2014, com permissão de Elsevier.
Figura 4: Sonda escores significativamente são afetados por Testing Ambiente e protocolo de formação de três grupos de tau F1 negativa FVB / N x 129S6 ratos treinados utilizando várias combinações de protocolo de treinamento e ambiente de teste gerados significativamente diferentes pontuações de sondas seguinte 8, 12, e 16 de formação. ensaios (Grupo: F (2, 42) = 14,89, p <0,0001; Grupo X de teste: F (4, 84) = 1,10, p = 0,36). Ratos treinados utilizando protocolo 1 eo same conjunto de pistas aplicadas exibidos escores significativamente mais baixos de sonda em Ambiente C em comparação com B Ambiente (Environment: F (1, 25) = 28,58, p <0,0001; Environment x Julgamento: F (2, 50) = 1,93, p = 0,16) . Ratos treinados em Ambiente C exibido escores significativamente mais elevados quando sonda modificada pistas e do Protocolo de re-otimizado 2 foram utilizadas em comparação com ratos treinados, utilizando as pistas originais e Protocolo 1 (Protocolo: F (1, 30) = 15,32, p <0,001; Protocolo x Ensaio: F (2, 60) = 0,91, p = 0,41) ** p <0,001; *** P <0,0001..
| Dia 1 | Morris Water Maze - Coorte: | Encontro: _________ | ||||||
| Plataforma em SE quadrante | Tester: &# 160; Hora de início: hora Acabamento: temperatura da água: | 1m tempo máximo julgamento / 15s em plataforma / * colocado na plataforma | ||||||
| Grupo 1 | ||||||||
| Ensaio 1 | ||||||||
| Animal ID | Marca | Jaula # | Fim Tempo | Lançamento ponto | Plataforma localização | Encontre plataforma? | Tempo | Notas (ou seja, o comportamento ímpar) |
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| 20 minutos ITI | ||||||||
| Ensaio 2 | ||||||||
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| 20 minutos ITI | ||||||||
| Experimento 3 | ||||||||
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| 20 minutos ITI | ||||||||
| O ensaio 4 | ||||||||
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Tabela 1:. Escondida Plataforma Run Sheet Uma folha corrida exemplo em que a plataforma está localizada no sudeste (SE) quadrante é fornecido. O experimentador deve escrever número de identificação do rato, quaisquer marcas de identificação na cauda ou orelhas, eo agrupamento gaiola. O ponto de libertação é indicada na folha e deve ser pseudo-aleatoriamente determinada tal como descrito no passo 3.3.2. Grave se o rato encontra a plataforma e o tempo necessário para encontrar a plataforma. Comportamento estranho, incluindo flutuante ou tigmotatismo, deve notar.
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Discussion
A tarefa MWM é amplamente utilizado para avaliar a aprendizagem espacial ea memória. No entanto, a robustez desta tarefa pode ser influenciada por muitos factores e requer optimização tanto para estirpe fundo e ambiente de teste. Como mostrado na Figura 4, o mesmo protocolo de treino e aplicados sinais visuais usados em dois quartos de teste diferentes (de tamanho e de disposição equivalente) produziram significativamente diferente desempenho da sonda. Uma vez que muitas características da sala de testes pode contribuir para pistas espaciais 4, foi especulado que os dois quartos foram significativamente diferentes de alguma maneira desconhecida que fez o teste mais difícil. Ao modificar as pistas extra-labirinto, optamos por aumentar efetivamente o número de pistas visuais. Além disso, minimizando o uso de cortinas, quaisquer sinais auditivos ou olfactivos que possam existir pode ter sido alterado. O nível de iluminação das duas salas de ensaio eram equivalentes, no entanto, o nível de luz gaiola no novo viveiro foi menor, resultandoem um diferencial de nível de luz superior quando se passa de gaiola para a sala de testes. Tem sido sugerido que os ratos BALB / c são capazes de realizar a tarefa MWM fornecendo os níveis de luz estão suficientemente baixo 14. No entanto, as tentativas para melhorar o desempenho, diminuindo os níveis de luz sala de testes não foram bem sucedidas (observações não publicadas). Até à data, não se sabe o que fator (s) contribuiu para o declínio no desempenho no novo ambiente de teste, mas o pré-tratamento modificado, sugestões, e protocolo de treinamento resultaram em um aumento significativo nos escores de sonda.
Se possível, é aconselhável para testar um grupo de tipo selvagem ou ratos da mesma estirpe de fundo de controle e idade como o experimento planejado para avaliar a taxa de aprendizagem e colocação de sonda ideal para o ambiente de teste particular. Idealmente, a primeira sonda é colocada quando aproximadamente metade dos ratos são visualizadas um viés positivo provável pesquisa (% -time em target≥35) ea última sonda quandoa maioria dos ratos de controle mostram um viés positivo e busca atingiram patamar de desempenho. Esta estratégia tem sido usada para determinar a colocação da sonda para performers superiores (F1 FVB / N x 129S6) e um fundo que aprendi mais lentamente (mixed C57BL / 6 x FVB / N x 129S6), onde cerca de metade dos ratos tinham ocupações quadrante alvo de ≥35 após oito ensaios ou 18 ensaios, respectivamente, com uma média de grupo de cerca de 35% -tempo para a primeira sonda. Sondas subsequentes devem ser mais elevada do que a primeira se definir dessa forma, de preferência com, pelo menos, uma diferença de 15 pontos em relação à linha de base de 25% -tempo. Se comparadas as pontuações de sondas que são moderadamente baixa (~ 35%) -time, garantir que isso representa um viés importante para o alvo e, portanto, uma diferença válida, comparando-se o alvo para não-alvo quadrantes 4,5. Além disso, a média de grupo mínimo não deve ser substancialmente menor do que 25% -time no quadrante alvo, que seria considerado linha de base ou desempenho acaso. Comparando target a ocupação não-alvo pode ajudar a identificar se existem desvios de apartamentos, por exemplo, ratinhos gastam mais tempo no quadrante oposto do que qualquer um dos quadrantes adjacentes seria um padrão de pesquisa inesperado.
Algumas recomendações durante a realização de testes incluem a limitação do número de pessoas testando cada coorte de animais a um indivíduo para reduzir a variabilidade no manuseio e testando estilos entre experimentadores, e realização de testes em torno do mesmo tempo cada dia. Além disso, tem sido sugerido que os ratinhos que receberam 2 ensaios por dia saiba quase tão rapidamente como os que receberam quatro ensaios por dia 15. É essencial que os animais de diferentes estirpes / Fundos / os grupos de tratamento ser representada em cada grupo de teste, se mais do que um grupo tem de ser executado durante um dia. Finalmente, deve-se tomar cuidado para garantir que os ratos não se tornam hipotérmica, como hipotermia pode afetar o desempenho e é o sexo ea formação estirpe dependente 16. Embora the intervalo inter-ensaio usado aqui (20 min) deve ser suficiente para evitar a hipotermia, outros métodos incluem o ajuste da temperatura da água, a colocação de ratos em uma gaiola de exploração aquecida entre ensaios, ou alguma combinação dos dois, conforme necessário. No entanto, deve notar-se que a temperatura da água pode influenciar o desempenho em ambas as direcções. Por exemplo, os ratos em pró-estro melhor sob condições de calor (33 ° C) executar, enquanto os ratos estral melhor sob condições de frio (19 ° C) 17 executar. Assim, cuidados devem ser tomados para controlar a temperatura da água em todo experimentos. Hipotermia deve ser uma preocupação para um animal em particular, o experimentador poderia entregar secar o animal com uma toalha de papel no caso em que eles não conseguem noivo pós-nadar ou dar qualquer indicação de comportamento hipotérmica. A avaliação periódica da temperatura do corpo pode garantir as condições são suficientes para evitar a hipotermia.
Outra consideração processual refere-se a traini plataforma visívelng. Ratos mais jovens ou outra estirpe pode precisar de menos tentativas de treino plataforma visíveis. Uma diretriz sugerida é treinar até que o grupo controle atingiu andar de desempenho durante os ensaios 3-6 finais de treino consecutivas, desde que o grupo experimental apresenta desempenho equivalente. Se o projeto experimental inclui tanto jovens e velhos ratos, definir a duração do treino na plataforma visível para o grupo, que exige o maior número de tentativas de treino para chegar a andar de desempenho 5. Além disso, a plataforma visível pode ser eficaz no sentido de aclimatação ratos para o procedimento de tratamento e de ensaio e pode eliminar a necessidade de pré-manuseamento se a ratos não são muito jovens quando testado pela primeira vez ou manipulação humana não é excessivamente aversiva para a estirpe em teste.
Benefícios amplos do labirinto aquático de Morris incluem a sua insensibilidade em relação aos fatores motivacionais, em comparação com tarefas baseadas em alimentos, a sua validade como uma medida de cuspiu-dependente do hipocampoial de navegação e memória de referência, e sua eficácia 15 cross-espécies. Uma limitação potencial da técnica é que, porque este protocolo é adaptado para uma estirpe de fundo específico, pode não ser eficaz com outros animais, ou outras estirpes de ratinhos fundo. Além disso, como parte do protocolo, são feitas tentativas para criar e colocar estrategicamente sinais identificáveis em toda a sala de mazing. No entanto, não está claro o que altura exata é o ideal quando colocar pistas ao redor da sala. Assim, sinais que são grandes e são distinguidos uns dos outros são necessários para a formação eficaz.
Em resumo, optimizando a tarefa MWM para uso com um fundo especial estirpe e testando ambiente pode aumentar significativamente o alcance dinâmico da tarefa, resultando em um tempo considerável e economia de custos.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais (Reed / Engler-Chiurazzi - U54GM104942), do Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame (Ashe - R01NS33249, R01NS63249 e R01NS79374), Cobre (Engler-Chiurazzi - P20GM109098), o Associação de Alzheimer (Reed - NIRG-12-242187), um WVU Faculdade Senado Research Grant (Reed), uma subvenção WVU PSCOR (Reed), e fundos internos da faculdade de WVU do Escritório de Medicina Dean (Engler-Chiurazzi). O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente a posição oficial do NIH ou Associação de Alzheimer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Viewer Tracking software | Biobserve | This particular software is not a requirement - there are other tracking systems available | |
| Pre-handling pool | Dimensions approximately 1 foot wide x 2 feet long x 1.5 feet deep | ||
| Plastic beaker | 1 L | ||
| Scoop | |||
| Small net | |||
| Stopwatch | |||
| Non-toxic white tempera paint | Any color paint can be used; however, most tracking software programs require that the paint contrast with the color of the animal. | ||
| Visible platform | Color should contrast that of maze | ||
| Curtain rod | |||
| Curtains | |||
| Circular tub | Usually white in color; approximately 4 feet in diameter | ||
| Hidden platform | Painted same color as the water |
References
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