Introduction
Трансгенные мышиные модели сыграли важную роль в оценке патофизиологии болезни Альцгеймера (AD), а также потенциал терапевтических вмешательств. Когнитивные задачи, такие как водном лабиринте Морриса (MWM), которые обычно используются с этими моделями, чтобы определить молекулярные корреляты дефицита памяти и оценить эффективность доклинических лекарств. Очень важно, однако, что динамический диапазон когнитивной задачи быть достаточно широким, чтобы обнаружить тонкие эффекты лечения. С мышиных моделях AD, когнитивные нарушения, как правило, зависит от возраста, и мыши имеют прогрессивные снижение производительности (например, 1). Использование чувствительной познавательной задачи может позволить обнаружение тонких различий ранее в жизни животного, тем самым снижая затраты, связанные со старением животных. Например, сокращение количества учебных испытаний в гиппокампа-зависимой Barnes лабиринт от 15 до 5 увеличили сложность задачи, в результате чего гetection дефицита в модели 3xTg в более раннем возрасте, чем сообщалось ранее 2. Раннее выявление дефицита не только обеспечивает значительную экономию времени и средств, это также увеличивает вероятность того, что молекулярные изменения, лежащие в основе когнитивных нарушений может быть идентифицирован.
Одним из факторов, влияющих на чувствительность познавательных задач генетический фон штамма модели мыши. Например, линии BALB / C мышей демонстрируют превосходную производительность в обучения и памяти задач по сравнению с другими штаммами, таких как C57BL / 6 3. F1 FVB / N х 129S6 фон для двух наиболее широко используемых моделей AD, в Tg2576 и РТГ (TauP301L) 4510 моделей. Этот штамм обладает превосходной способностью обучения в MWM по отношению к другим штаммов, в том числе B6 / SJL мышей 4. Из-за этой превосходной способности к обучению, использование одного зонда после длительной подготовки, может замаскировать группы различия, вытекающие из перетренированности. Кроме того, sensitivitу зондовых испытаниях может быть зависит от возраста. Ранее мы уже показали, что более ранние исследования зонд, после ограниченного обучения скрытой платформы, более чувствительны к различиям в молодой Tg2576 по сравнению с молодыми трансгенных отрицательным управления однопометными, чем зонд испытания, вставленные после более длительного обучения 5. В отличие от этого, зонд испытания следующие обширную подготовку более чувствительны в старшей (20-25 месяца) Tg2576 мышей по сравнению с более старыми, чем помета более ранние исследования зонд 5. По перемежая зонда испытания на протяжении обучения, вероятность того, что процесс чувствителен будут определены увеличивается, особенно если продольные тестирование проводится и чувствительность конкретного судебного разбирательства пробного зависит от возраста. Рисунок 1 показывает превосходные характеристики F1 FVB / N х 129S6 мышей согласно протоколу, оптимизированной для этого штамма, по сравнению с мышами В6 фоне / SJL обученного в рамках протокола с более длительной подготовки.
МВМ являетсяпо общему мнению, обеспечить надежные меры, которые воспроизводимы по времени, так и в лабораториях 6. Например, основной протокол первоначально использовался нашей лаборатории Миннесоты 1,7 был успешно реализован с незначительными изменениями в Университет Западной Вирджинии 8. Точно так же, эквивалентные уровни обесценения наблюдались в РТГ (TauP301L) 4510 мышей по сравнению с контрольными однопометными если расположен под патогена или обычных условиях 9. Тем не менее, среда тестирования может влиять на чувствительность задачи MWM. Такие факторы, как комнатного освещения, вентиляционные отверстия, температурных градиентов и шумов способствуют сигналы окружающей среды 4, что в конечном итоге может повлиять на производительность. Когда наша лаборатория Миннесота и террариумов были перемещены в новое здание, до снижения производительности дикого типа на 38% наблюдалось, значительно снижая динамический диапазон задания и способность обнаруживать дефицит трансгенов, связанных с. Это изменение в реrformance произошло, несмотря на проектировании комнату тестирования, чтобы быть эквивалентной размеру и конфигурации, и с использованием тех же прикладных визуальные подсказки. "Re-оптимизации" оригинального протокола требуется увеличить динамический диапазон задачи MWM в новой среде тестирования.
Вот оригинальный протокол специально для использования с F1 FvB / N х 129S6 фон 5 описывается. Поскольку некоторые исследования предполагают, стресс связан с низкой производительностью MWM 10 и предварительной обработки может облегчить эту вызванную стрессом дефицит в исполнении 11, протокол предварительно обработки был разработан, чтобы акклиматизироваться мышей к введения и удаления пула перед испытанием MWM , После предварительной обработки-мышей пройти обучение видимый платформы, в которой поднял платформа отмеченные флагом. Видимый тренировочная площадка используется для идентификации мышей с проблемами производительности, связанных с сенсомоторной аномалий. Использование критериев исключения, описанные в протраздел ocol, производительность некомпетентных мышей удаляются из последующих экзаменов скрытых учебных платформ и датчиков испытаний. Нарушения в скрытых учебных платформ и датчиков испытаний интерпретируются как когнитивного дефицита, поскольку производительность сенсорно раскладывается из данных. После завершения видимого обучения платформы, мыши начинают скрытый обучение платформы, где платформа погружен в воду и остается в том же положении по отношению к внешним сигналам. Испытания, в которых платформа удаляется (зонд испытания) перемежаются всей скрытой подготовки платформы для оценки влияния дополнительного обучения. Потому что зонд испытания происходят в начале каждого дня, перед дополнительной скрытой подготовки платформы, зонд испытания измерения способности животного, чтобы помнить расположение платформы следующем задержки 20 ч, считается мерой отсчета памяти 12. Наконец, способы, в которых этот оригинальный протокол повторно оптимизированы, когда изменения в тестовой среденарушается характеристики управления описаны.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все экспериментальные процедуры были проведены в соответствии со стандартами по уходу и использованию комитета Институциональные животных (IACUC) и утверждаются IACUC Западной Вирджинии университета.
1. Предварительная обработка-
- Настройка пул
- Поддерживают предварительно обработки бассейн поэтому он поднял на удобной высоте.
- Поместите 2 л воды (21 ° C) в предварительно обработки бассейна до уровня примерно 1 см.
Примечание: Не добавляйте окраску.
- Процедура
- Принесите мышей из вивария в комнату тестирования.
- Проверьте идентификацию объекте (номер, хвост тату, ухо клип и т.д.)..
- Хвост Марка мыши с постоянным маркером, чтобы отличить мышей в клетке, прошедших предварительно обработки тестирование от тех, которые остаются для тестирования. Отметить все мышей в одной клетке с тем же цветом.
- Поместите мышь на трансферном стакан для приближенииДЕТАЛЬ 5 сек. Затем, осторожно влить мышь из стакана в предварительно обработки бассейна.
- Использование таймера, позволяет мыши, чтобы оставаться в бассейне в течение 20 сек.
- Через 20 сек, осторожно положите ложку (без рыбалки это) перед мыши. Кратко позволяют мышь, чтобы исследовать совок, и, при необходимости, поощрять мышь, чтобы попасть на совок, осторожно перемещая совок под мышки, медленно поднимая. Позаботьтесь, чтобы не пугать мышей с шариком.
- После того, как мышь в совке, транспортировать его обратно к удерживающей клетке.
- Повторите эти процедуры для каждой мыши в клетке один раз в день в течение 10 дней. Через равные промежутки времени (например, после каждого животного), подобрать фекальные Боли и постельные принадлежности из бассейна с помощью сети.
- Промойте передачи стакан с водой на регулярной основе (например, после завершения клетке мышей).
- После того, как эти шаги будут завершены, промыть стакан с передачи водой несколько раз, самосвалы воду избассейн, и промойте бассейн примерно два раза водой.
2. Видимый Обучение Платформа
- Настройка мыши Производительность отслеживания программного обеспечения, например, просмотра (см таблицу материалов).
- Калибровка видео, чтобы соответствовать размеры лабиринта под "Конфигурация" - вкладка "Фильтры и объекты".
- Установите фильтры, так что программное обеспечение может отличить мышь от фона.
- Отрегулируйте «чувствительность» под «фона фильтра" области, так что программа слежения идентифицирует животное.
- Нажмите кнопку "принять" один раз отслеживания программного обеспечения идентифицирует животное. Выберите опцию "Редактировать" для затемнения областей за пределами области лабиринта.
- Выберите подходящий "животное фильтр" и "мин. Размер животного ".
- Создание Run листы <ол>
- Создать перспективе лист с перечнем каждой мыши, каждый потенциальный месте, и пространство для заметок, содержащих информацию о девиантным поведением.
- Ограничение областей для теста видимого платформы, которые являются одинаковыми для каждой группы мышей. Таким образом, для первого процесса, предварительно определить, что платформа будет размещена на стороне, противоположной, где мышь помещают в лабиринт, на правой стороне ближе к стене. Для второго процесса, предварительно определить, что платформа будет размещена в другом месте вдоль задней стенки для каждой мыши, и что это будет продолжаться в течение каждого из 6 испытаний.
- Повесьте шторы по комнате так, что любые пространственные сигналы затемнены.
- Поместите ванна, чтобы она соответствовала конфигурации в программном обеспечении отслеживания путем обеспечения лабиринт совпадает с настройки конфигурации на "Конфигурация" - вкладка "Зона Определение". Примечание: чELPS для обеспечения ванна находится в правильном месте перед заполнением его водой, как ванна не легко перемещены после заполнения.
- Заполните ванну с водопроводной водой, и с помощью термометра, обеспечить температура воды примерно 21 ° С. Убедитесь, что вода остается в пределах одной степенью этой температуре в течение тестирования, а холодная вода может повлиять на производительность, особенно при использовании старых мышей 8.
Примечание: Не добавляйте окраску. - Используя заранее места, поместите платформу, которая имеет установленный флаг, который достигает в высоту 13 см и 4,5 см х 4,5 см с жирным "S" в форме символов тиснением на нем, в первой ячейке ванной так, чтобы он составляет примерно 1 дюйм выше поверхности воды.
- Возьмите первую мышь из клетки, проверить идентификацию предмета, отмечают хвост, используя постоянный маркер нужного цвета, и место в стакан.
- Аккуратно МОВе в ванной, запустить таймер, и убедиться, что программное обеспечение отслеживания отслеживания животных. Разрешить мыши до 2 мин, чтобы найти платформу. Как только мышь находит платформу, позволяют мыши 20 сек на платформе.
- Если животное находит платформу и приступает к прыгать или падать, совок мыши и поместите курсор на платформе. Если мышь продолжает прыгать или падать платформу, держать мышь на платформе, так мышь узнает, что оставаясь на платформе приводит к бегству из ванной.
Примечание: мышь должна оставаться на платформе для комбинированной время 20 сек; Таким образом, если мышь соскакивает по истечении 5 секунд, количество времени, оставшегося на платформе 15 сек и не сбрасываются на 20 сек. - Если животное не может найти платформу в течение 2 мин, совок мыши и поместите его на платформу в течение 20 сек.
- После 20 сек на платформе, удалить мышь от платформы, как это сделано в предварительной обработки подготовки и поместите курсор в гое подогревом клетка выстроились с бумажными полотенцами и нагревают до ~ 31 ° C в грелку и тепловой лампой в течение 30 сек. Выполните периодическую оценку температуры тела с ректального термометра, чтобы гарантировать, что определенные штаммы мышей и мышей в определенном возрасте не дифференциально восприимчивы к гипотермии, вызванной воздействием воды.
- Через 2 мин к проведению клетке с нагревательным лампы, передавать мышь в клетке холдинга только грелку, но нет тепла лампы, чтобы восстановить между испытаниями. В конце концов, поставить все мышей из одного дома в клетке же холдинговой клетке во время тестирования.
- Очистите лабиринт мусора с сетью после каждой мыши завершил судебное разбирательство, чтобы сорвать обонятельные сигналы.
Примечание: платформа останется в том же месте на каждой мыши в течение одного судебного разбирательства и будетпереехал в других определенных местах для последующих испытаний. Это делается для того, что у мышей, 1) узнать есть платформа вырваться из 2) плавать непосредственно видимой платформы, демонстрируя тем самым нетронутым визуальный компетентность и 3) не имеют дефицита двигателя.
Примечание: Использование ручного таймера также может быть полезным, чтобы обеспечить достоверность программного обеспечения слежения.
Обучение 3. Моррис воды Лабиринт Скрытые Платформа
- Sи др комнату
- Повесьте шторы в комнате, чтобы скрыть пространственные сигналы в лаборатории.
- Поместите реплики стратегически на шторах. Убедитесь, что сигналы являются большими и содержать контрастные цвета (напр .: черный и белый) для лучшей видимости. Повесьте киев на расстоянии и высоте, где они видны мышей из внутри бака. Примечание: сигналы являются статическими и не перемещаются в ходе испытаний.
- Настройка программного обеспечения для мыши Производительность слежения
- Калибровка видео, чтобы соответствовать размеры лабиринта под "Конфигурация" - вкладка "Фильтры и объекты".
- Установите фильтры таким образом, чтобы программное обеспечение может отличить мышей от фона.
- Используйте те же процедуры, как описано в видимой тестирования платформы (шаги 2.1.2.1-2.1.2.3), чтобы настроить фильтры для воды Моррис лабиринт подготовки скрытой платформы.
- Создайте четыре равные квадранта внутри лабиринта
- НажмитеОпция "Эллипс" на вкладке "Зона" Определение первых, и создать круг, который соответствует лабиринт на экране. Примечание: На этой вкладке, текущая лабиринт создан отображается, так как позволяет возможность, чтобы соответствовать настройки компьютера с его настройкой лабиринт.
- Нажмите кнопку "Прямоугольник" и создать четыре равные квадраты. Поместите эти квадраты на экране, чтобы создать четыре равные квадранта в недавно созданной окружности.
- Создание платформы в лабиринте.
- Выберите опцию "Эллипс", и создайте круг размером платформы, которая будет использоваться. Примечание: Размещение платформу в лабиринте заранее может быть полезным для создания эллипса точный размер платформы.
- Поместите вновь созданный расположение платформы в центре целевой квадранте. (Рекомендуется назвать этот объект "цель", чтобы отличить правильные платформы от отдыха). Критический шаг: В поле просто BELвл "Сетка", выберите опцию "Stop" в разделе "триггер" для целевой платформы. Это вызовет программа остановиться, как только мышь достигает платформы.
- Создайте три других идентичных платформенных областей, и поместить их в точных местах в других секторах. Не выбирайте "остановить" в опции "триггер".
- Создание Run листы
- Создать перспективе лист с перечнем каждой мыши, каждый судебный процесс, пространство, чтобы записать время, чтобы добраться до платформы, и пространство, чтобы отметить аномальное поведение (таблица 1).
- Предварительно определить точку выхода из каждой мыши в псевдослучайной образом. Использование псевдослучайного выбора таким образом, чтобы расстояние до платформы равен каждый день, каждый из 4 мест в равной степени использован, а угол от начала до платформы (т.е.., От левого или правого) уравновешивается внутри и между дней.
Примечание: расположение платформы на ходуЛист, чтобы обеспечить расположение платформы не перемещается из исходного положения. Убедитесь, что платформа находится в центре одного из четырех зон, которые были созданы на отслеживания программного обеспечения.
Примечание: Если продольная тестирование проводится на разных возрастов, переместите платформу на новое место в каждой возрастной.
- Настройка Лабиринт
- Отрегулируйте либо лабиринт воды или камеры, такие, что существует соответствие между лабиринта и настройки конфигурации на "Конфигурация" - "Определение зоны" на вкладке.
- Этикетка четыре квадранта невидимые лабиринта (N, S, E, W). Убедитесь, что это матч с конфигурацией в отслеживания программного обеспечения для обеспечения мышей в настоящее время освобождены от правильных исходных точек.
Важнейший шаг: Установите эти этикетки вне лабиринта и вне поля зрения плавательный животного, учитывая, что сигналы в лабиринте составляют непространственной, без гиппокампа зависимой задачи. - Заполните лабиринт с водопроводной водоснаг (примерно 21 ° С), чтобы платформа примерно 5 мм ниже поверхности воды.
- Поместите платформу в заданном месте.
Примечание: расположение платформы будет оставаться одинаковым для всех мышей проходит испытания по всем дням и испытаний. - Используйте нетоксичный белый темпера краски, чтобы сделать воду непрозрачной. Сделайте это, чтобы убедиться, что верхняя часть платформы является невидимым от уровня глаз животных во время купания.
- Процедура
- Возьмите мышь из клетки, отметьте хвост, используя постоянный маркер правильного цвета, и поместите в стакан.
- Аккуратно влить мышь в лабиринте, так что он входит лицом к стене. Примечание: Каждая мышь будет помещен в ту же стартовую место для уникального судебного разбирательства.
- В первом выпуске мыши, начать таймер и стоять в таком месте, где прибор не легко видимым мышей. Убедитесь, что программное обеспечение отслеживания животных правильно отслеживания животных. После того, как животное достигает платформы, позволяют ему оставаться на платформе в течение 15 сек.
Примечание: Это позволяет животному ориентироваться на его пространственного расположения в комнате. - Через 15 сек на платформе, удалить животное из лабиринта и вернуть мышь в клетке с подогревом.
- Если мышь находит платформу и приступает к прыгать или падать до 15 сек, совок мыши и поместить его обратно на платформу для оставшейся части 15 сек, так мыши учится связывать платформу с побега.
- Если мышь не найти платформу в течение 60 сек, мягко совок мыши и поместите его на платформу. Позвольте ему остаться на платформе в течение 15 сек, затем снять животное с шариком и вернуть его к нагретой клетке.
- Очистите лабиринт мусора с сетью сорвать обонятельные сигналы.
- Повторите эти процедуры для остальных мышей в группе. Таким образом, для тестирования дней с 4 по 9, провести четыре испытания скрытой платформы поездаING в день с приблизительно 20 мин между каждым испытанием.
- Изменение начальной точки pseduorandomly для каждого испытания. Таким образом, в ходе судебного разбирательства 1, освободить всех мышей из того же исходного расположения, а затем повторите процедуру с другой стартовой позиции для последующих испытаний. Каждый день, меняются точки релиз, чтобы обеспечить животных не развивается непространственной, без гиппокампа в зависимости моторную стратегии. Например, если мышей освобождаются от N, S, E, W и точек в один день, не выпустить их в том же порядке на следующий день.
- Во время скрытого обучения платформы, использовать программное обеспечение отслеживания животных для измерения задержки на платформу, на длине пути животного, и процент времени и расстояния животное проводит в каждом квадранте лабиринт. Получить эти измерения на вкладке "Водный лабиринт" под "список эксперимент" и могут быть экспортированы непосредственно в таблицу Excel.
Примечание: Использование ручного таймера обеспечивает точность слеженияпрограммного обеспечения.
4. Зонд испытания
- Настройка программного обеспечения для мыши Производительность слежения
- Используйте те же процедуры, как в скрытом порядке платформы Моррис водном лабиринте (шаги 3.2.1-3.2.4.3) с одним исключением. Критический шаг: Для датчиков испытаний, обеспечить возможность "остановить" для "запуска" выключен во время пробных испытаний. Это позволит предотвратить программу из останавливаясь, когда мышь пересекает площадь платформы.
- Создание Run листы
- Создать перспективе лист с перечнем каждой мыши, каждый судебный процесс, и пространство, чтобы отметить аномальное поведение. Предварительно определить точку выхода во зонда испытаний, таких, что они чередуются между двумя сторонами противоположных платформе. Таким образом, предварительно определить точки выпуска таким образом, что у мышей не выйдут из двух сторон, которые примыкают к платформе.
- Процедура
- Провести испытания зонда, подобные скрытой подготовки платформы, с excepние, что ни платформа не находится в лабиринте.
- Выпуск мышь от заданной точки выхода. В ходе судебного разбирательства зонда, удалить платформы и мыши имеет 60 секунд, чтобы плавать в лабиринте.
- Во время тестирования, проводить 4 зонда испытания. Измените точку выхода из мышей между зондом испытаний. Таким образом, изменение точки выхода текущей проб зонда от предыдущего суда зонда.
- В зонд испытаний, использование программного обеспечения отслеживания животных, чтобы отслеживать длине пути животного, процент времени животное проводит в каждом квадранте лабиринта, и количество раз, животное плавает над ранее platformed области. Получить эти измерения на вкладке "Анализ данных" и на вкладке "Водный лабиринт" под "экспериментальной список", и экспортировать непосредственно в электронную таблицу Excel.
Примечание: Использование ручного таймера также может быть полезным, чтобы обеспечить достоверность программного обеспечения слежения. - Провести испытание датчика доскрытый тренировочная площадка в дни 6, 7, 8 и 10. (рисунок 2). После этих испытаний датчиков, проводить испытания 4 скрытой платформе учебные каждый день. Таким образом, выполнить зонд-первых, сразу же следуют скрытой подготовки платформы для всех мышей, используя те же процедуры, как описано в разделе 3. В отличие от этого, не выполнять дополнительную скрытую подготовку платформы после суда зонда на 10 день.
5. Анализы
- Видимый Обучение Платформа
- Проведение повторных измерений ANOVA, отдельно для (в) длины оптического пути, (б) задержка, чтобы найти платформу, и (с) скорость плавания, с трансгена (или другой переменной, например, лечение), как между предметной переменной-и дней или учебных блоков, как в-субъект переменной. Примечание: Для более сложных конструкций, консультации с статистик может быть полезным. См 8,13 информацию о группе размеров достаточно, чтобы должным образом привести эту задачу с часто используемыми моделями болезни Альцгеймера7; болезнь.
- Производительность Некомпетентность
- Определить мышей производительности некомпетентных, в том числе мышей, которые демонстрируют визуальный или двигателя некомпетентность, или животных, которые не приобретают процессуальные компоненты теста, и удалить эти мышей от последующих статистических анализов скрытой платформе и производительности зонда.
- Рассчитайте среднее время ожидания и скорость плавания в последний день видимой подготовки платформы для каждой мыши. Удалить мышей с помощью 2 стандартных отклонения выше группы означают, как это может быть признаком двигателя или зрением.
- Выявить и устранить мышей провала попытки сориентироваться или следовать побег совок или мыши, обладающие аномальным поведением, такие как штопор купания или плавающей.
- Определить мышей производительности некомпетентных, в том числе мышей, которые демонстрируют визуальный или двигателя некомпетентность, или животных, которые не приобретают процессуальные компоненты теста, и удалить эти мышей от последующих статистических анализов скрытой платформе и производительности зонда.
- Обучение Моррис воды Лабиринт Скрытые Платформа
- Провести повторные меры ANOVA, на (в) длины оптического пути, (б) задержка найти скрытые платформы, (с) скорость плавания, и (г) время процентов или процентовРасстояние в квадранте с трансгена в качестве переменной между предметом и-испытаний в качестве переменной в-тема.
- Зонд испытания
- Плавать скорость
- Провести повторные меры ANOVA, на скорости переплыть зонда испытаний с трансгена в качестве переменной между предметом и-испытаний в качестве переменной в-тема.
- Платформа индекс пересечения
- Использование конфигурации датчика для каждого пробного мыши, индекс пересечения платформа (PCI), вычисляется по следующей формуле: PCI = число раз пересекает мыши целевое местоположение - в среднем пересечения эквивалентной месте в 3 других секторах.
Примечание: Это мероприятие проводится, чтобы определить, мыши, используется ли пространственное стратегию поиска, как указано более переправ через обученных расположения платформы, или не-пространственной стратегии thigmotaxic плавания, как указано приблизительно равных переправ через все четыре места. - Проведение повторяетсямеры по ANOVAs PCI с трансгена в качестве переменной между-объекта и испытаний в качестве переменной в условии.-
- Использование конфигурации датчика для каждого пробного мыши, индекс пересечения платформа (PCI), вычисляется по следующей формуле: PCI = число раз пересекает мыши целевое местоположение - в среднем пересечения эквивалентной месте в 3 других секторах.
- Процент времени или процент расстояние в квадранте
- Вычислить время процентов или расстояние каждая мышь проводит в четырех квадрантах лабиринта. Провести повторное меры ANOVAs от процента времени, расстояния или с трансгена в качестве переменной между предметом и-испытаний в качестве переменной в-тема. Используйте время процентов, чтобы определить, используется пространственное стратегия поиска; Результаты времени, приблизительно, 25% в целевой квадранте указывают мышей выступления на шанс уровне, а не с использованием пространственной стратегии поиска.
- O / N забывая
- Сравните задержку платформа область пересечения на суде зонда к латентности, чтобы найти платформу, на заключительном испытании в предыдущий день. Примечание: Если задержка платформы пересечения на суде зонда значительно больше, чем ожидания, чтобы найти platforм в течение последнего суда скрытой платформы в предыдущий день, то О / Н забывание расположения платформы происходит.
- Плавать скорость
- Анализ постфактум
- Следуйте значительные RMANOVAs с постфактум сравнений трансгена в каждом испытании.
6. Пример Re-оптимизации для тестирования новой окружающей среде
- Предварительно обращение. Провести предварительную обработку в жилищном помещении. Поместите клетки без крышек на транспортной тележкой для всей сессии.
Примечание: Цели модификации процедуры предварительного обращения являются более постепенно вводить обработчик манипуляции и воздействия транспортных устройств (стакан и совок) и увеличить время мыши в клетку без microisolator крышками и за пределами их клетке в открытое поле и яркие условия освещения.- Дни 1 и 2
- Разрешить мыши, чтобы акклиматизироваться в руки, находящихся в клетке, а затем аккуратным прикладыванием, А затем, будучи сняты для осмотра и татуировки маркировки хвоста. Начиная с 2-й день предварительной обработки, поместите дополнительный материал вложенности в клетке, чтобы обеспечить дополнительный материал для строительства гнезда и укрытия, а крышки были удалены 9.
- Дни 3 и 4
- Поместите стакан транспорта, совок, и флаг видимого платформы в поле предварительного обращения и позволяют мышам, чтобы исследовать в течение 2 испытаний на 2 мин на суде.
- Не используйте воду в этом протоколе во время предварительной обработки. Скорее всего, обеспечить окно содержит достаточно чистое постельное, чтобы покрыть пол и душистый с небольшим количеством женского и мужского загрязненной подстилки, если оба пола проходят испытания. Изменение постельные принадлежности каждый день.
- День 5
- Место мышей в поле предварительного обращения, содержащие слегка загрязненную подстилку и видимый флаг платформы для 3 испытаний, в течение 20 сек каждый. Используйте стакан и совок для транспортировки мышей и из коробки.
- Видимый Обучение Платформа
- Заданная температура воды при 27 ° С (обычно используется для тестирования среды Миннесота).
- Вернуться мышей в клетку после приобретения промотана платформу.
- Разрешить мышей до 60 сек приобрести видимую платформу.
- Провести тренинги, состоящие из 3 испытаний в день в течение 5 дней.
- Скрытая Обучение Платформа
- Изменить визуальные подсказки. За исключением одной большой занавес, чтобы скрыть обработчик, либо устранить или сделать узкие другие шторы, окружающие бассейн, чтобы иметь более открытую комнату. Поместите дополнительные объекты по комнате (например, подвергается стеллажи, черной ткани плакат с белым символом, черный и белый пляжный мяч, большими черными воронками, ноутбуков и черным чучела животных), в результате чего в сбалансированном, но более разнообразный визуального cue- установить, чем ранее использовали.
- Начните скрытый учебный платформа 72 ч после завершения видимого платформы Trainiнг, с интервалом примерно в 30 минут между испытаниями.
- Провести тренинги, состоящие из 2 испытаний в течение 8 дней.
- Зонд испытания
- Выполните зонд испытаний 72 ч следующую скрытых испытаний учебных 8, 12, и 16.Include 3-дневный интервал между испытаниями 8-9, и 12-13 подготовки.
- Установите время продолжительности зонд в течение 30 сек.
- Дни 1 и 2
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы использовали водного лабиринта Морриса, чтобы изучить эффекты бета-амилоида (Tg2576 мышей) и мутантного P301L тау (RTG (TauP301L) 4510 мышей) на пространственной системы памяти (например, 1,5,7,8). Рисунок 3 Представитель сообщил, результат в нашем исследовании изучения влияния взрослом возрасте выражения P301L тау на обучение и память 8, используя среду тестирования А. оценить двигательные и зрительные возможности мышей сравнивались по видимым платформы учебных блоков, где каждый блок обучения состоял из 3 испытания. Длина пути в видимом обучения платформы не отличаются между элементами управления и мышей TauP301L (рис 3а), предполагая, трансген положительные и отрицательные мыши обнаруживают, сравнимую плавание и обе группы можно увидеть наглядное (флаг) маркировку платформу. Нет мышей не были определены в качестве спектакля-некомпетентных на основе критериев исключения. Далее, производительность в скрытом учебном платформа блока сравнивали, где каждыйБлок состоит из 1 дня (4 испытания) обучения. Как мышей узнал расположение платформы, длина пути и время, чтобы найти платформу уменьшилось. Тем не менее, длина пути была значительно больше у мышей TauP301L по сравнению с контрольной на каждом учебном блоке (рис 3B), предполагая, пространственное обучение была нарушена у мышей TauP301L. Четыре зонда испытания, в которых платформа была удалена, были вкраплены в скрытой обучения платформы и прошла в начале дня, перед началом скрытого обучения платформы. Таким образом, эти испытания зонда измеряется пространственное ссылка на память. Сравнение по этим четырем зонда испытаний, контролирует значительно улучшилось с дополнительной подготовки (рис 3C), как указано возрастании времени в целевой квадранте. Напротив, мыши, TauP301L не улучшилось с дополнительной подготовки. Таким образом, наибольшие различия между двумя группами в этом возрасте происходит в суде зонда 4. Эти данные показывают, что выражение P301L таусвязано как с пространственного обучения и дефицита пространственной привязки памяти. В то время как задача Водный лабиринт может быть относительно устойчивым к некоторым процедурным различий, F1 FVB / N х 129S6 фон штамм может быть особенно чувствительны к определенным изменениям окружающей среды. Первый протокол изложил также успешно используется в окружающей среде B (например., 1,7). Однако производительность зонда дикого типа была значительно ниже, когда первый протокол был использован в третьем месте, среда С. Протокол повторно оптимизированы значительно улучшена производительность зонда дикого типа (фигура 4).
Рисунок 1:. Оптимизация протокола для фоновой штамма дикого типа 7-8 месячных мышей были обучены, используя те же реплики и тестирования среды. F1 FVB / N х 129S6 (N = 24) и В6 / SJL (N = 16) мыши впервые получил 18 и 24 видимого плаTForm учебные испытания соответственно, доставлен в 6 и 8 испытаний в день, соответственно. Оба штамма получили 4 скрытых учебных платформа испытания в день. Для F1 FVB / N х 129S6 мышей, зонд испытания проводили 20 ч следующую 8, 12, 16, 24 и учебные процессы. Для B6 / SJL мышей, зонд испытания проводили 20 ч следующие 12, 24 и 36 учебных испытания.
Рисунок 2:. График Мыши получали видимое обучение платформы в течение 3 дней, 6 исследований в день, с последующим скрытой платформы обучения в течение 6 дней, 4 исследований в день. Четыре зонда испытания проводили 20 ч после 8, 12, 16, 24 и скрытых испытаний подготовки.
Рисунок 3: Представитель Результаты для мышей Моррис воды Лабиринт TauP301L несущих человеческий P.Ген тау 301L были рассмотрены на примерно 6,5 месяцев после трех месяцев P301L тау выражения (N = 41 tauP301L и п = 46 управления с примерно равным количеством мужчин и женщин в каждой группе). () Длина пути в видимом обучения платформы не отличаются между элементами управления и мышей TauP301L (P S> 0,05). (Б) в течение скрытого обучения платформы, мыши TauP301L продемонстрировал значительно дольше pathlengths всех учебных блоков (трансген: F (1, 83) = 41,96, р <0,0001; трансгенной × блок: F (5, 415) = 0,6141, р = 0,69 ). (C) Управление улучшилось по четырем зонда испытаний, в то время как мыши TauP301L сделал не (трансген: F (1, 83) = 29,1, р <0,0001; Трансгенные × Trial: F (3, 270) = 4,91, р = 0,008). Каждый учебный блок состоял из 3 испытаний для видимого обучения платформы или 4 испытаний для HIDDан подготовки платформы. Таки ретроспективном анализе: * р <0,05; ** р <0,01; *** р <0,001. Части рисунке 3 перепечатанные из Hunsberger др. Влияние размера дефицита памяти у мышей с выражением P301L тау взрослом возрасте, Behav Brain Res, т. 272, стр. 181-95. Copyright 2014, с разрешения Elsevier от.
Рисунок 4: Probe результаты существенно повлиять испытание окружающей среды и подготовки протокола три группы тау отрицательный F1 FvB / N х 129S6 мышей подготовку, используя различные комбинации протокола обучение и тестирование среды, созданной значительно отличаются оценки зонд следующие 8, 12, и 16 обучение. испытания (группа: F (2, 42) = 14,89, р <0,0001; группы х Судебная: F (4, 84) = 1.10, р = 0,36). Мыши обученных использованию протокола 1 и Сэме множество прикладных киев отображаемых значительно более низкие показатели датчиков в окружающей среде по сравнению с C окружающей среды (среды B: F (1, 25) = 28,58, р <0,0001; Окружающая среда х Судебная: F (2, 50) = 1,93, р = 0,16) , Мыши обучение по окружающей среде C отображается значительно более высокие баллы зонда при модификации реплики и повторно оптимизирован протокол 2 были использованы по сравнению с мышами обученных используя оригинальные реплики и протокол 1 (протокол: F (1, 30) = 15.32, p <0,001; протокол х Судебная: F (2, 60) = 0,91, р = 0,41) ** р <0,001; *** р <0,0001..
| День 1 | Водный лабиринт Морриса - Когорта: | Дата: _________ | ||||||
| Платформа в SE квадранте | Тестер: &# 160; Время начала: время окончания: температура воды: | 1м макс время судебного разбирательства / 15s на платформе / * размещены на платформе | ||||||
| Группа 1 | ||||||||
| Судебная 1 | ||||||||
| Животное ID | Маркировка | Кейдж # | Конец время | Выпуск точка | Платформа расположение | Найти платформу? | Время | Примечания (т.е. странное поведение) |
| Вт | SE | |||||||
| Вт | SE | |||||||
| Вт | SE | |||||||
| Вт | SE | |||||||
| Вт | SE | |||||||
| Вт | SE | |||||||
| Вт | SE | |||||||
| Вт | SE | |||||||
| Вт | SE | |||||||
| Вт | SE | |||||||
| 20 минут ITI | ||||||||
| Судебная 2 | ||||||||
| Е | SE | |||||||
| Е | SE | |||||||
| Е | SE | |||||||
| Е | SE | |||||||
| Е | SE | |||||||
| Е | SE | |||||||
| Е | SE | |||||||
| Е | SE | |||||||
| Е | SE | |||||||
| Е | SE | |||||||
| 20 минут ITI | ||||||||
| Судебная 3 | ||||||||
| N | SE | |||||||
| N | SE | |||||||
| N | SE | |||||||
| N | SE | |||||||
| N | SE | |||||||
| N | SE | |||||||
| N | SE | |||||||
| N | SE | |||||||
| N | SE | |||||||
| N | SE | |||||||
| 20 минут ITI | ||||||||
| Судебная 4 | ||||||||
| S | SE | |||||||
| S | SE | |||||||
| S | SE | |||||||
| S | SE | |||||||
| S | SE | |||||||
| S | SE | |||||||
| S | SE | |||||||
| </ TD> | S | SE | ||||||
| S | SE | |||||||
| S | SE | |||||||
Таблица 1:. Скрытая платформа Пробег лист пример выполнения листа, в котором платформа находится на юго-востоке (SE) квадрант предусмотрено. Экспериментатор должен написать идентификационный номер мыши, либо опознавательных знаков на хвосте или уши, и клетки группировки. Точка выпуска указана на листе и должны быть псевдо-случайным образом, как описано в шаге 3.3.2. Запишите находит ли мышь платформу и время, чтобы найти платформу. Странное поведение, в том числе с плавающей или thigmotaxis, Необходимо отметить,.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Задача МВМ широко используется для оценки пространственного обучения и памяти. Тем не менее, надежность этой задачи может быть под влиянием многих факторов и требует оптимизации для фоновой деформации и среды тестирования. Как показано на рисунке 4, тот же протокол обучения и применяется визуальные подсказки, используемые в двух разных испытательных лабораторий (эквивалент размера и компоновки) дали значительно разные характеристики датчика. Поскольку многие черты комнату тестирования может способствовать пространственной киев 4, было предположение, что две комнаты были значительно отличается в какой-то неизвестной образом, который сделал тест сложнее. В модификации экстра-лабиринт сигналы, мы решили, чтобы эффективно увеличить количество визуальных подсказок. Кроме того, за счет минимизации использования штор, либо слуховые или обонятельные сигналы, которые могут существовать, возможно, были изменены. Уровень света из двух испытательных лабораторий были эквивалентны, однако домой клетка уровень освещенности в новом виварии была ниже, в результате чегов высшей дифференциала уровня света при переходе из дома клетку, чтобы комнату тестирования. Было высказано предположение, что линии BALB / C мышей способны выполнять задачи MWM, обеспечивающую уровень освещения являются достаточно низкими 14. Тем не менее, попытки повысить производительность за счет снижения уровня освещенности комнату тестирования были неудачные (неопубликованные наблюдения). На сегодняшний день, это не известно, какой фактор (ы) способствовали снижению производительности в новой среде тестирования, но модифицированный предварительно обработки, сигналы, и протокол обучения привели к значительному увеличению в десятки датчиков.
Если это возможно, рекомендуется проверить группу дикого типа или контрольных мышей того же штамма фоне и возрасте, как планируемого эксперимента, чтобы оценить скорость обучения и оптимального размещения зонда для конкретной среды тестирования. В идеале, первый зонд помещается при приблизительно половина мышей отображения вероятное положительное смещение поиска (% -time в target≥35) и зонда, когда последнийБольшинство контрольных мышей показывают положительное смещение поиска и достигли производительности плато. Эта стратегия была использована для определения размещение зонда для высших исполнителей (F1 FVB / N х 129S6) и фона, который узнал медленнее (смешанный C57BL / 6 х FVB / N х 129S6), где примерно половина мышей была целевых квадранте заселенности из ≥35 после 8 РКИ или 18 испытаний соответственно с группой означает примерно 35% -время для первого зонда. Последующие зонды должны быть выше, чем первый, если установлен таким образом, идеально, по крайней мере разности в 15 точке по сравнению с исходным 25% -time. Если сравнение баллы датчиков, которые умеренно низкой (~ 35%) -время, убедитесь, что это представляет собой значительный уклон для цели и, следовательно, действительного различия, сравнивая цель нецелевых квадранты 4,5. Кроме того, минимальное среднее группа не должна быть существенно ниже, чем 25% -time в целевом квадранте, который будет рассмотрен базовый или случайного выполнения задачи. Сравнивая ТаргET для нецелевых размещение может помочь определить, если есть номер предубеждения, например, мыши, проводя больше времени в противоположный квадрант, чем любой из смежных секторов будет неожиданным шаблон поиска.
Некоторые рекомендации при проведении тестирования включают ограничение числа людей, тестирования каждый когорту животных 1 человека, чтобы уменьшить изменчивость в обращении и тестирование стили между экспериментаторами, и проведение тестирования примерно в то же время каждый день. Кроме того, было высказано предположение, что у мышей, получавших 2 испытаний в день узнать почти так же быстро, как те, которые получают 4 испытания на 15-й день. Важно, что у животных из разных штаммов / фоны / группах лечения быть представлена в каждой группе испытаний, если более чем один контингент должен быть запущен в течение дня. Наконец, необходимо позаботиться, чтобы гарантировать, что мыши не стать гипотермия, а гипотермия может повлиять на производительность и секс, и фон штамм зависит 16. Хотя гое испытание между интервал, используемый здесь (20 мин) должна быть достаточной, чтобы предотвратить переохлаждение, другие методы включают регулирование температуры воды, помещая мышей в нагретом удерживающей клетке между испытаниями, или некоторую комбинацию этих двух мере необходимости. Тем не менее, следует отметить, что температура воды может влиять производительность в обоих направлениях. Например, proestrous крыс работают лучше при теплых условиях (33 ° C), в то время как крысы эстральных работать лучше в холодных условиях (19 ° C) 17. Таким образом, необходимо позаботиться, чтобы контролировать температуру воды для всей экспериментов. Если переохлаждение быть проблемой для конкретного животного, экспериментатор может передать сухой, что животное с бумажным полотенцем в случае, если они не в состоянии ухаживать за пост-поплавать или давать какие-либо указания гипотермической поведения. Периодическая оценка температуры тела может обеспечить условия достаточно, чтобы предотвратить переохлаждение.
Еще процессуальное рассмотрение относится к видимой платформы Trainiнг. Молодые мыши или другого штамма, возможно, потребуется меньше видимых испытания учебные платформы. Предлагаемый принцип таков, чтобы обучать, пока контрольная группа не достигла пол производительности в течение последних 3-6 последовательных испытаний подготовки, обеспечивая экспериментальная группа отображает эквивалентные характеристики. Если экспериментальная конструкция включает как молодых и старых мышей, установить продолжительность обучения платформы открыты для группы, которая требует наибольшее количество учебных испытаний, чтобы достичь этаж производительность 5. Кроме того, видно платформа может быть эффективным по отношению к акклиматизации мышей с процедурой обработки и испытания и может устранить необходимость для предварительной обработки, если мыши не очень молодые, когда впервые опробован или человека регулировать не слишком отвращение к тестируемого штамма.
Широкие преимущества водном лабиринте Морриса включают относительную нечувствительность к мотивационных факторов по сравнению с продуктами питания на основе задач, срок его действия в качестве меры гиппокампа зависит плюнулIAL навигации и обращение к памяти, и его межвидовая эффективность 15. Потенциальным ограничением метода является то, что, поскольку этот протокол специально для конкретного штамма фона, оно не может быть эффективным с другими животными или других фоновых линий мышей. Кроме того, как часть протокола, делаются попытки создать и стратегически место идентифицируемые сигналы в течение Mazing комнате. Тем не менее, неясно, что точная высота является оптимальной при размещении реплики по комнате. Таким образом, сигналы, которые являются большими и различаются друг от друга необходимы для эффективного обучения.
Таким образом, задача оптимизации MWM для использования с конкретной фоне штамма и тестирование среда может значительно увеличить динамический диапазон задачи, в результате чего в значительной экономии времени и средств.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальным институтом Общих медицинских наук (Рид / Энглер-Chiurazzi - U54GM104942), Национальный институт неврологических расстройств и инсульта (Эш - R01NS33249, R01NS63249 и R01NS79374), Кобре (Энглер-Chiurazzi - P20GM109098), Ассоциация Альцгеймера (Рид - NIRG-12-242187), WVU факультет Исследования Сенат Грант (Рид), грант WVU PSCOR (Рид), и внутренние средства от WVU Колледж Управления Медицина Дина (Энглер-Chiurazzi). Содержание исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения NIH или ассоциации Альцгеймера.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Viewer Tracking software | Biobserve | This particular software is not a requirement - there are other tracking systems available | |
| Pre-handling pool | Dimensions approximately 1 foot wide x 2 feet long x 1.5 feet deep | ||
| Plastic beaker | 1 L | ||
| Scoop | |||
| Small net | |||
| Stopwatch | |||
| Non-toxic white tempera paint | Any color paint can be used; however, most tracking software programs require that the paint contrast with the color of the animal. | ||
| Visible platform | Color should contrast that of maze | ||
| Curtain rod | |||
| Curtains | |||
| Circular tub | Usually white in color; approximately 4 feet in diameter | ||
| Hidden platform | Painted same color as the water |
References
- Ramsden, M., et al. Age-dependent neurofibrillary tangle formation, neuron loss, and memory impairment in a mouse model of human tauopathy (P301L). The Journal of Neuroscience. 25, 10637-10647 (2005).
- Attar, A., et al. A shortened barnes maze protocol reveals memory deficits at 4-months of age in the triple-transgenic mouse model of Alzheimer's disease. PLoS One. 8, e80355 (2013).
- Johnson, J. M., Bailey, J. M., Johnson, J. E., Newland, M. C. Performance of BALB/c and C57BL/6 mice under an incremental repeated acquisition of behavioral chains procedure. Behavioural Processes. 84, 705-714 (2010).
- Crawley, J. N. What's wrong with my Mouse Behavioral phenotyping of transgenic and knockout mice. , 1st edition, Wiley-Liss. 94-95 (2000).
- Westerman, M. A., et al. The relationship between abeta and memory in the Tg2576 mouse model of Alzheimer's disease. The Journal of Neuroscience. 22, 1858-1867 (2002).
- D'Hooge, R., De Deyn, P. P. Applications of the morris water maze in the study of learning and memory. Brain Research Reviews. 36, 60-90 (2001).
- Santa Cruz, K., et al. Tau suppression in a neurodegenerative mouse model improves memory function. Science. 309, 476-481 (2005).
- Hunsberger, H. C., et al. Effect size of memory deficits in mice with adult-onset P301L tau expression. Behavioural Brain Research. 272, 181-195 (2014).
- Yue, M., Hanna, A., Wilson, J., Roder, H., Janus, C. Sex difference in pathology and memory decline in rTg4510 mouse model of tauopathy. Neurobiology of Aging. 32, 590-603 (2011).
- Sandi, C. The role and mechanisms of action of glucocorticoid involvement in memory storage. Neural plasticity. 6, 41-52 (1998).
- Hölscher, C. C. impairs performance in spatial water maze learning tasks. Behavioural Brain Research. 100, 225-235 (1999).
- Morris, R. Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat. Journal of Neuroscience Methods. 11, 47-60 (1984).
- Reed, M. N., Liu, P., Kotilinek, L. A., Ashe, K. H. Effect size of reference memory deficits in the morris water maze in Tg2576 mice. Behavioural Brain Research. 212, 115-120 (2010).
- Huang, Y., Zhou, W., Zhang, Y. Bright lighting conditions during testing increase thigmotaxis and impair water maze performance in BALB/c mice. Behavioral Brain Research. 226, 26-31 (2012).
- Baker, R. Water maze. , Available from: http://www.watermaze.org (2013).
- Ivonen, H., Nurminen, L., Harri, M., Tanila, H., Puolivali, J. Hypothermia in mice tested in Morris water maze. Behavioural Brain Research. 141, 207-213 (2003).
- Rubinow, M. J., Arseneau, L. M., Beverly, J. L., Juraska, J. M. Effect of estrous cycle on water maze acquisition depends on the temperature of the water. Behavioral Neuroscience. 118 (4), 863-868 (2004).
