Summary
Vi beskriver her, hvordan du forbereder knogle-medium (BCM) og teste dens aktivitet in vitro.
Abstract
Autologe knogletransplantater er meget udbredt i oral og maxillofacial kirurgi, ortopædi og traumatologi. Autologe knogletransplantater ikke kun erstatte manglende ben, de støtter også den komplekse proces af knogle regeneration. Denne gunstige adfærd autotransplantater tilskrives de tre karakteristika: osteokonduktivitet, osteogenicity og osteoinductivity. Men der er et andet aspekt: knogletransplantater frigive et utal af molekyler, herunder vækstfaktorer, som kan målrette mesenkymale celler involveret i knogleregenerering. De parakrine egenskaber knogletransplantater kan studeres in vitro ved anvendelse af knogle-konditioneret medium (BCM). Her præsenterer vi en protokol om, hvordan man forbereder knogle-medium fra indfødte gris knoglecortex, og knogle, der undergik termisk behandling eller demineralisering. Celler kan udsættes direkte for BCM eller podet på biomaterialer, såsom kollagenmembraner, der tidligere gennemvædet med BCM. Vi giver eksempler på in vitro bioassays med mesenkymale celler på ekspression af TGF-β regulerede gener. De præsenterede protokoller bør tilskynde til yderligere afsløre parakrine virkninger af knogletransplantater under knogle regeneration og åbne en vej for translationel forskning i bred inden for rekonstruktionskirurgi.
Introduction
Autolog knogle er almindeligt anvendt til at bygge bro fejl, der opstod som følge af misdannelser, resective kirurgi, rekonstruktionskirurgi traume kirurgi, og før implantatet placering 1,2. Forståelse af de biologiske principper hvordan knogletransplantater støtte processen med graft konsolidering ikke kun nøglen til at forstå, hvorfor autografter anses for at være den gyldne standard i rekonstruktionskirurgi, er det også bionic den forbedrede udformning af knogle- substitutter 3. Stadig, graft konsolidering er hurtigere med autolog knogle sammenlignet med knogle erstatter 4,5. Således er det absolut nødvendigt at afsløre de molekylære og cellulære mekanismer, der gør autolog knogle så effektiv til at understøtte knogle regeneration.
Der er tre lærebog karakteristika autotransplantater, der anses for at støtte konsolideringen 6,7. Først, autolog knogle er osteokonduktivt, giver vejledning til den nydannede knogle til at voksei defekten. For det andet, autolog knogle er osteogene, hvilket betyder, at det indeholder mesenkymale celler, som kan differentiere til osteoblaster 8. Tredje, autolog knogle er osteoinduktive vækstfaktorer som knoglemorfogenetiske proteiner begravet i matrixen kan initiere processen med endochondral eller endda intramembranous knogledannelse 9. Der er et andet aspekt: frisklavede knogle chips holde en parakrin funktion baseret på in vitro-observationer med "ben-medium" 10-15. Også virkningen af myelopoiesis bør nævnes 16. En lignende udtrykket "demineraliseret knoglematrix-medium" var allerede opfundet i 1996 og støtter det overordnede begreb en parakrin funktion af knogler, selv når behandlet af demineralisering 17. Til vores formål, kan BCM fremstilles fra frisk gris mandibles 10,11. Proteomikanalyser af BCM afslørede komplekse sammensætning, herunder vækst omstændighedors og bestanddele af den ekstracellulære matrix 10, også udvidelse af eksisterende viden om proteasomet af hele ben 18,19. Således bør BCM afspejle den frigjorte aktivitet af forskellige modifikationer af knogletransplantater in vitro.
Hvad sker der, når mesenchymceller, for eksempel dem isoleret fra knogle chips eller fra oral blødt væv, er udsat til BCM? In vitro, BCM reducerer osteogenisk og adipogenisk differentiering, og fremkalder en kraftig stigning i IL11 udtryk 11. Genom microarray afslørede flere gener, der skal udtrykkes forskelligt i mesenkymale celler som reaktion på BCM. Blandt disse gener er adrenomedullin (ADM), IL11, IL33, NADPH oxidase 4 (NOX4), proteoglycan 4 (PRG4 eller lubricin) og pentraxin 3 (PTX3) 15. BCM fås fra autoklaveres knogle chips undladt at ændre ekspressionen af de respektive gener 14. BCM fra knogle chips, der undergik pasteurisering og frysning var i stand tilændre genekspression 14. Også konditionerede medium af demineraliseret knoglematrix (DBM-CM) ændrer ekspressionen af TGF-β-regulerede gener 20. Interessant collagen barrieremembraner anvendes til at afskærme knoglefliserne fra det omgivende bløde væv 21,22, adsorberet de dele af BCM, der er ansvarlig for de ændringer i genekspression 23. BCM forskning kan udvides til andre celletyper, der er involveret i knogleregenerering såsom knogleresorberende osteoclaster og endotelceller, for at nævne nogle få. Samlet set akkumulerende in vitro-data giver det videnskabelige grundlag for udformningen af en præklinisk undersøgelse.
Den nuværende protokol er dobbelt: For det første viser, hvordan man forbereder BCM. For det andet viser, hvordan at teste dets biologiske aktivitet baseret på mesenchymal-celler in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. BCM Forberedelse
- Opnå svin Kindbakkerne fra den lokale slagter så frisk som muligt. Placer Kindbakkerne på et fast underlag, og frigive en fuld tykkelse flap særlig opmærksomhed på ikke at efterlade nogen blødt væv eller periosteum fastgjort til knoglen. Arbejde i et rent miljø uden at det er nødvendigt at arbejde under flow hætte.
- Når en fuld tykkelse flap frigives, skal du bruge en knogle skraber til at høste knogle chips fra bukkale side. Bemærk, at knoglen skraberen skal være skarpe. Håndtag fast knoglen skraber og med lange bevægelser indsamle knoglen. Kassér knogleflager mindre at 1mm.
- At opretholde native knogle chips, placere direkte knoglefliserne i plastskåle af 10cm diameter med Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) suppleret med 1% antibiotika og antimykotika ikke lade dem tørre ud.
- At evaluere effekten af termisk behandling, at der er omfattet knogle chips pasteurisering i 30 minutter ved 80 ° C ellerautoklav i 20 minutter ved 121 ° C.
- At evaluere virkningen af demineralisering, ryst knogle chips i 1 M HCL for 4-6 timer ved 4 ° C og vask gentagne gange med dyrkningsmedium, indtil pH er neutral.
- Placer i alt 5 g af knogle- chips per 10 ml frisk DMEM suppleret med 1% antibiotika og antimykotika i en ny plastskål.
- Placer plastskåle i en fugtig atmosfære ved 37 ° C i 24 timer. Derefter høst BCM. Centrifuger BCM ved 200 xg i 10 minutter for at fjerne snavs, filtrere det sterile (0,2 nm), og holde alikvoter nedfrosset ved -80 ° C.
- Optø BCM lager umiddelbart før brug og undgå gentagne cykler af nedfrysning og optøning.
- For angivne eksperimenter, sættetid collagenmembraner med BCM eller serumfrit medium i 1 time ved stuetemperatur. Vask energisk membranerne med PBS og placere dem i 96 brønds plader. Våde membraner podes med celler.
- BCM fremstillingsprocessen er opsummeret i figur 1.
2. Bioassays Baseret på mesenchvmal-celler
- Seed humane mesenchymal-celler (for eksempel knogleceller, gingival og parodontale ligament fibroblaster) i en 12-brønds plade med en koncentration på 30.000 celler / cm2. Til frø cellerne bruger vækstmedium bestående af DMEM, 10% føtalt kalveserum og antibiotika. Lad cellerne tillægger pladen O / N.
- Kassér dyrkningsmediet og vask af cellerne med forvarmet PBS ved 37 ° C. Stimulere cellerne ved tilsætning af forvarmet serumfrit dyrkningsmedium med og uden 20% BCM. Placere cellerne i en fugtig atmosfære ved 37 ° C i 24 timer.
- Kassér dyrkningsmediet, skylles cellerne med forvarmet PBS og udtrække RNA i henhold til dine foretrukne protokol.
- Indstille koncentrationen af RNA for at få den samme mængde af RNA i hver prøve. Forberede cDNA'er og udføre en QRT-PCR for at analysere de udvalgte gener ved anvendelse af primerne vist i tabel 1.
BEMÆRK: Det er de fortyndinger af hver enkelt komponent: 2x SYBR Green, 20x primer fremad, 20x primer omvendt, 5x sterilt DD vand, 5x cDNA. Den QRT-PCR udføres i 40 cyklusser af 95 ° C 15 sek og 60 ° C 1 min. - Beregn relative ekspressionsniveauer ved at normalisere til husholdning gen GAPDH hjælp af Δ (ACt) metode, hvor ACt er CT target - CT GAPDH og Δ (ACt) er ACt stimuleret - ACt kontrol.
- Efter denne kvalitetskontrol, tilføje BCM til dyrkningsmediet for at stimulere alle typer af celler, herunder mesenchymale celler, hæmatopoietiske celler eller endotelceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Knogle konditionerede medium fremstilles ud fra friske porcine knoglespåner. Generel oversigt over fremgangsmåden til fremstilling BCM og at anvende biomaterialer i kombination med BCM er vist i figur 1 og figur 2 hhv. Under forberedelsen BCM, er det vigtigt at opnå store knogle chips med lange bevægelser som korte bevægelser eller meget små knoglespåner kan påvirke kvaliteten af det endelige BCM. Kvaliteten af BCM kan styres ved at analysere genekspression af BCM målgener: ADM, PTX3, IL11, IL33, NOX4 og PRG4 (figur 3). ADM og PTX3 er nedreguleres ned til 0,4 gange og IL11, IL33, NOX4 og PRG4 kan opreguleres til 200 gange. Hvis orale fibroblaster ikke udtrykker BCM målgener på det niveau, viste, kontrollere sundheden af cellerne eller forberede ny BCM fra nye kæber. Figur 4 viser typiske resultater fra ekspression af BCM målgener i orale fibroblaster podes på et kollagen barrieremembran. Orale fibroblaster stimuleret med 20% af konditioneret medium fra pasteuriseret knoglespåner og konditioneret medium fra demineraliserede knogle chips, viste lignende genekspression til celler stimuleret med BCM (tabel 2 og tabel 3). Imidlertid genekspression af orale fibroblaster udsat for konditioneret medium fra steriliseret (121 ° C) knoglechips, var sammenlignelig med un-stimulerede kontroller.
Figur 1. Oversigt over den proces, der anvendes til fremstilling knogle-medium fra friske svin Kindbakkerne. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Opsummeringaf bioassays baseret på mesenkymale celler med BCM. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. genekspression af knogle-medium målgener i orale fibroblaster. Typiske resultater af seks gener, der anvendes til at kontrollere kvaliteten af BCM. Gener ADM og PTX3 er nedreguleres (A) og IL11, IL33, NOX4, PRG4 opreguleres (B). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Gen-ekspression af knogle-conditioned medium målgener i orale fibroblaster podes på en collagen barrieremembran. Typiske resultater af seks gener, der anvendes til at kontrollere kvaliteten af BCM. Gener ADM og PTX3 er nedreguleret (A) og IL11, NOX4, PRG4 opreguleres (B). Afhængigt af biomaterialet anvendes, kan absorptionen af vækstfaktorer er forskellige. Kollagenmembraner undladt at absorbere faktorer, der styrer IL33 udtryk derfor IL33 udtryk er ikke reguleret i denne indstilling. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Forkortelse | Primer fremad | Primer omvendt |
| GAPDH | AGCCACATCGCTCAGACAC | GCCCAATACGACCAAATCC |
| ADM | GGACATGAAGGGTGCCTCTC | TGTTCATGCTCTGGCGGTAG |
| IL11 | TGCACCTGACACTTGACTGG | AGTCTTCAGCAGCAGCAGTC |
| IL33 | TCAGGTGACGGTGTTGATGG | GGAGCTCCACAGAGTGTTCC |
| NOX4 | TCTTGGCTTACCTCCGAGGA | CTCCTGGTTCTCCTGCTTGG |
| PRG4 | CGACGCCCAATGTAAGAAGT | GGTGATGTGGGATTATGCACT |
| PTX3 | TGTATGTGAATTTGGACAACGAA | CATTCCGAGTGCTCCTGAC |
Tabel 1: Primer sekvens af de 6 anvendte gener.
| Gener | 80 ° C gennemsnit ± SD | 121 ° C gennemsnit ± SD |
| ADM | 0,2 ± 0,1 | 1,1 ± 0,2 |
| PTX3 | 0,1 ± 0,1 | 0,9 ± 0,2 |
| IL11 | 20 ± 10 | 1,5 ± 1 |
| IL33 | 15 ± 5 | 1,2 ± 4 |
| NOX4 | 35 ± 15 | 2 ± 1 |
| PRG4 | 40 ± 10 | 1,8 ± 1 |
Tabel 2: Typisk genekspression af ADM, PTX3, IL11, IL33, NOX4 og PRG4 i orale fibroblaster stimuleret med 20% af konditioneret medium fra varmebehandlede knogle chips.
| Gener | Middelværdi ± standardafvigelse |
| ADM | 0,1 ± 0,1 |
| PTX3 | |
| IL11 | 15 ± 5 |
| IL33 | 20 ± 10 |
| NOX4 | 60 ± 15 |
| PRG4 | 50 ± 20 |
Tabel 3: Typisk genekspression af ADM, PTX3, IL11, IL33, NOX4 og PRG4 i orale fibroblaster stimuleret med 20% af konditioneret medium fra demineraliseret knogle chips.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Knogle-konditioneret medium afspejler den frigivne aktivitet af knogletransplantater under de tidlige stadier af knogleregenerering. Den her beskrevne protokol kan tilpasses til at studere responset af forskellige typer af celler involveret i knogleregenerering. Endvidere kan protokollen anvendes til fremstilling af konditioneret medium fra forarbejdede knogle- eller knogle fyldstoffer. Metoderne er let at udføre og stole på et simpelt koncept: de faktorer, der frigives fra diverse indfødte og bearbejdet knogle. Forstå, hvordan BCM påvirker mesenkymale celler kan være med til at lære mere om graft konsolidering og egenskaber knogle autotransplantater. Baseret på dette koncept, vi har akkumuleret viden om virkningen af BCM fås fra indfødte 11,15 og behandles knogle 14,20 om genekspression af mesenkymale celler, men også på proliferation, migration og differentiering til de tre vigtigste slægter; osteoblaster, adipocytter og chondrocytter 11. BCM blev også undersøgt for sin evne til at tarFå hæmatopoietiske celler, fx med hensyn til modulering af osteoklastogenese 13. Mange potentielle målceller venter på at reagere på BCM in vitro, kan protokollerne præsenteres her, tjene som en primer for denne forskning.
De præsenterede protokoller bør også animere til yderligere afsløre de molekylære mekanismer i hvordan BCM aktiverer særligt TGF-β-regulerede gener i mesenchymale celler. For eksempel TGF-β-receptor I antagonist SB431542 blokeret effekten af BCM på ekspressionen af genet panel ADM, IL-11, NOX4, PRG4, og PTX3 11,15. Interessant, blev alkalisk fosfatase og IL33 ikke vendes ved SB431542 11,15 tyder på, at andre endnu ukendte veje er reguleret af BCM. Et andet åbent spørgsmål er, hvad er molekylerne i BCM er ansvarlig for det cellulære respons? BCM indeholder TGF-β, men er ikke forklare de komplekse cellulære reaktioner 10,11. Udover den ivitro cellulære aspekter, det overordnede spørgsmål er stadig: som strækker gør frigivet aktivitet knogletransplantater som afspejles af BCM, har en indvirkning på in vivo processen med knogle regeneration? De protokoller og data fra bioassays bør indføre forskning i denne retning.
Denne protokol har begrænsninger. BCM kan ikke fuldt standardiseret på grund af variationer mellem donorer og høst teknikker. Desuden hvordan enzymer til stede in vivo kan påvirke sammensætningen eller aktiviteten af BCM fortsat ukendt. Fremtidige undersøgelser bør for eksempel fokusere på, hvordan høst teknikker påvirker "biologisk aktivitet" af BCM. Rolle osteocytter om sammensætningen af BCM bør også undersøges nærmere. BCM indeholder sclerostin, et molekyle udgivet næsten udelukkende af osteocyter 12. Begrænsninger imidlertid give inspiration til de næste skridt i forskningen. Selvom den kliniske relevans af forskningen med BCM forbliver hypothetical, vores protokoller understøtter mangeårige koncept, knogletransplantater enten native eller efter forarbejdning, frigive en "biologisk aktivitet". Forstå, hvordan BCM påvirke celler in vitro kan formentlig hjælpe til at forstå, hvordan knoglen autotransplantater vil fungere in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre. Jordi Caballé-Serrano modtog et stipendium fra Fonden for Dental Research og Uddannelse, Basel, Schweiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pig Mandibles | Local bucher | ||
| Bone Scraper | Hu-Friedy | PPBUSE2/36 | |
| Antibiotics & Antimicotics | All life Technologies | 15240-062 | |
| Collagen Membranes (Bio-Gide) | Geistlich | ||
| Fetal Calf Serum | Invitrogen Corporation | 16030074 | |
| DMEM | Invitrogen Corporation | 21885-025 | |
High Pure RNA Isolation Kit |
Roche | 11828665001 | |
| Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit | Roche | 4379012001 | |
| Primers | Microsynth | ||
| SYBR Green (for Q-RT-PCR) | Roche | 4673484001 | |
| PBS | Roche | 11666789001 |
References
- Buser, D. Long-term Stability of Early Implant Placement with Contour Augmentation. Journal of dental research. , (2013).
- Chiapasco, M., Casentini, P., Bone Zaniboni, M. augmentation procedures in implant dentistry. The International journal of oral & maxillofacial implants. 24 Suppl. , 237-259 (2009).
- Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Bone Tsiridis, E. substitutes: an update. Injury. 36, Suppl 3. S20-S27. , (2005).
- Jensen, S. S., Broggini, N., Hjorting-Hansen, E., Schenk, R., Bone Buser, D. healing and graft resorption of autograft, anorganic bovine bone and beta-tricalcium phosphate. A histologic and histomorphometric study in the mandibles of minipigs. Clinical oral implants research. 17, 237-243 (2006).
- Jensen, S. S. Evaluation of a novel biphasic calcium phosphate in standardized bone defects: a histologic and histomorphometric study in the mandibles of minipigs. Clinical oral implants research. 18, 752-760 (2007).
- Grabowski, G., Bone Cornett, C. A. graft and bone graft substitutes in spine surgery: current concepts and controversies. The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 21, 51-60 (2013).
- Khan, S. N. The biology of bone grafting. The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 13, 77-86 (2005).
- Bohr, H., Ravn, H. O., Werner, H. The osteogenic effect of bone transplants in rabbits. The Journal of bone and joint surgery. British. 50, 866-873 (1968).
- Bone Urist, M. R. formation by autoinduction. Science. 150, 893-899 (1965).
- Caballé-Serrano, J. D., Buser, D., Gruber, R. Proteomic analysis of porcine bone conditioned medium. The International journal of oral & maxillofacial implants. , (2014).
- Peng, J. Bone-Conditioned Medium Inhibits Osteogenic and Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Cells In Vitro. Clinical implant dentistry and related research. , (2014).
- Brolese, E., Buser, D., Kuchler, U., Schaller, B., Gruber, R. Human bone chips release of sclerostin and FGF-23 into the culture medium: an in vitro pilot study. Clinical oral implants research. , (2014).
- Caballé-Serrano, J., Bosshardt, D. D., Gargallo-Albiol, J., Buser, D., Bone Gruber, R. conditioned medium enhances osteoclastogenesis in murine bone marrow cultures. Clin Oral Impl Res; in. Int J Oral Maxillofac Surg. , (2015).
- Zimmermann, M. Bone-conditioned medium changes gene expression in bone-derived fibroblasts). IJOMI accepted. , (2014).
- Fulzele, K. Myelopoiesis is regulated by osteocytes through Gsalpha-dependent signaling. Blood. 121, 930-939 (2013).
- Becerra, J., Andrades, J. A., Ertl, D. C., Sorgente, N., Nimni, M. E. Demineralized bone matrix mediates differentiation of bone marrow stromal cells in vitro: effect of age of cell donor. Journal of. 11, 1703-1714 (1996).
- Kupcova Skalnikova,, H, Proteomic techniques for characterisation of mesenchymal stem cell secretome. Biochimie. , (2013).
- Romanello, M. Osteoblastic cell secretome: A novel role for progranulin during risedronate treatment. , Bone. (2013).
- Schuldt Filho,, G, Conditioned medium of demineralized bone matrix activates TGF-β signaling pathways in mesenchymal cells in vitro. J Cranio Maxill Surg. , (2015).
- Buser, D., Chen, S. T., Weber, H. P., Belser, U. C. Early implant placement following single-tooth extraction in the esthetic zone: biologic rationale and surgical procedures). The International journal of periodontics & restorative dentistry. 28, 441-451 (2008).
- Stoecklin-Wasmer, C. Absorbable collagen membranes for periodontal regeneration: a systematic review. Journal of dental research. 92, progress. 773-781 (2013).
