Summary
We beschrijven hier hoe-bone geconditioneerd medium (BCM) voor te bereiden en te testen zijn activiteit in vitro.
Abstract
Autologe bottransplantaten worden op grote schaal gebruikt in de kaakchirurgie, orthopedie en traumatologie. Autologe bottransplantaten vervangen niet alleen ontbreekt het bot, maar ook ondersteuning van het complexe proces van botregeneratie. Deze gunstige gedrag autografts wordt toegeschreven aan drie kenmerken: osteoconductiviteit, osteogenicity en osteo-inductiviteit. Er is echter een ander aspect: Bone ent laat een groot aantal moleculen, zoals groeifactoren, die mesenchymale cellen die betrokken zijn bij botherstel kunnen richten. De paracriene eigenschappen van bottransplantaten worden bestudeerd in vitro door het gebruik van bot-geconditioneerde medium (BCM). Hier presenteren we een protocol over hoe bot geconditioneerd medium te bereiden van inheemse varken corticale bot en bot dat de thermische verwerking of demineralisatie onderging. Cellen kunnen direct worden blootgesteld aan BCM en gezaaid op biomaterialen, zoals collageen membranen, vooraf gedrenkt BCM. We geven voorbeelden van in vitro bioassays met mesenchymale cellen op de expressie van TGF-β gereguleerde genen. De gepresenteerde protocollen moeten aanmoedigen om de paracriene effecten van bottransplantaten verdere onthullen tijdens de regeneratie van bot en een pad voor translationeel onderzoek te openen op het brede terrein van de reconstructieve chirurgie.
Introduction
Autoloog bot wordt veel gebruikt om defecten die ontstaan als gevolg van misvorming, chirurgische resectie, reconstructieve chirurgie trauma, en voorafgaand aan implantatie 1,2 overbruggen. Het begrijpen van de biologische principes hoe bottransplantaten ondersteunen van het proces van transplantaat consolidatie niet alleen belangrijk om te begrijpen waarom autografts worden beschouwd als de gouden standaard in reconstructieve chirurgie, is het ook bionische de verbeterde constructie van botsubstituten 3. Toch graft consolidatie is sneller met autoloog bot ten opzichte van het bot vervangt 4,5. Derhalve is het noodzakelijk om de moleculaire en cellulaire mechanismen die autoloog bot zo effectief botregeneratie te ondersteunen onthullen.
Er zijn drie leerboek kenmerken autografts die geacht worden de consolidatieproces 6,7 ondersteunen. Ten eerste, autoloog bot is osteoconductief, het verstrekken van begeleiding van de nieuw gevormde bot te groeienin het defect. Ten tweede, autoloog bot is osteogene, wat betekent dat het bevat mesenchymale cellen die kunnen differentiëren tot osteoblasten 8. Ten derde, autoloog bot is osteoinductieve als groeifactoren, zoals bot morfogenetische eiwitten begraven in de matrix het proces van endochondrale of zelfs intramembraneuze botvorming 9 kan initiëren. Er is een ander aspect: vers bereide botsplinters bezit van een paracrine functie op basis van de in vitro waarnemingen met "-bone geconditioneerd medium" 10-15. Ook zou de invloed van myelopoiese worden vermeld 16. Een soortgelijke term "gedemineraliseerd bot-matrix geconditioneerd medium" was al bedacht in 1996 en steunt het algemene concept van een paracriene functie van het bot, zelfs wanneer verwerkt door demineralisatie 17. Voor onze doeleinden, kunnen BCM worden bereid uit verse varken kaken 10,11. Proteomics analyses van BCM bleek de complexe samenstelling, met inbegrip van de groei feitors en bestanddelen van de extracellulaire matrix 10, ook de uitbreiding van bestaande kennis op het proteasoom van hele bot 18,19. Daarom moet de BCM vrijgegeven activiteit van verscheidene modificaties van bottransplantaten in vitro geven.
Wat gebeurt er als mesenchymale cellen, bijvoorbeeld die geïsoleerd uit botsplinters of orale zachte weefsel, blootgesteld aan BCM? In vitro, BCM vermindert osteogene en adipogene differentiatie, en veroorzaakt een sterke toename van IL11-expressie 11. Chromosomale microarray geopenbaard meer genen differentieel tot expressie worden gebracht in mesenchymale cellen in respons op BCM. Onder deze genen adrenomedullin (ADM), IL11, IL33, NADPH oxidase 4 (NOX4), proteoglycan 4 (PRG4 of lubricin) en pentraxine 3 (PTX3) 15. BCM verkregen uit autoclaaf botsplinters niet de expressie van de respectieve genen 14 veranderen. BCM uit het bot chips die pasteurisatie ondergaan en bevriezing was in staat omveranderen genexpressie 14. Ook geconditioneerd medium gedemineraliseerd botmatrix (DBM-CM) verandert de expressie van TGF-β-gereguleerde genen 20. Interessant collageen barrièremembranen gebruikt om het bot chips te beschermen tegen de omringende zachte weefsels 21,22, geadsorbeerd die delen van BCM die verantwoordelijk zijn voor de veranderingen in genexpressie 23 zijn. BCM onderzoek kan worden uitgebreid tot andere celtypen betrokken bij botherstel zoals botresorberende osteoclasten en endotheliale cellen, een paar te noemen. Kortom, het accumuleren in vitro data over wetenschappelijke basis voor het ontwerp van een preklinisch onderzoek.
Het huidige protocol is tweeledig: ten eerste, het laat zien hoe de BCM te bereiden. Ten tweede laat zien hoe de biologische activiteit ervan te testen op basis van mesenchymale cellen in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. BCM Voorbereiding
- Verkrijgen varken onderkaken van de plaatselijke slager zo vers mogelijk. Plaats de kaken op een stevige ondergrond en laat een volledige dikte flap bijzondere aandacht geen zacht weefsel niet te verlaten of periosteum gehecht aan het bot. Werk in een schone omgeving zonder dat hij onder stroomkap.
- Zodra een volledige dikte flap wordt losgelaten, gebruikt een bot schraper om de botsplinters oogsten uit de buccale zijde. Houdt u er rekening mee dat het bot schraper heeft scherpe zijn. Handvat stevig op het bot schraper met lange bewegingen te verzamelen op het bot. Gooi het bot chips kleiner dan 1mm.
- Om inheemse bot chips te houden, plaatst u direct de botsplinters in plastic schaaltjes van 10 cm diameter met Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 1% antibiotica en antimycotica niet laten uitdrogen.
- Om het effect van warmtebehandeling evalueren onderworpen botchips pasteurisatie gedurende 30 min bij 80 ° C ofautoclaaf gedurende 20 minuten bij 121 ° C.
- Om het effect van demineralisatie evalueren schud botsplinters in 1 M HCl gedurende 4-6 uur bij 4 ° C en herhaaldelijk wassen met kweekmedium tot de pH neutraal.
- Plaats een totaal van 5 g botchips per 10 ml vers DMEM aangevuld met 1% antibiotica en antimycotica in een nieuwe plastic schaaltje.
- Plaats de plastic schaaltjes in een bevochtigde atmosfeer bij 37 ° C gedurende 24 uur. Vervolgens oogst BCM. Centrifugeer de BCM bij 200 xg gedurende 10 min om vuil te verwijderen, filteren steriel (0,2 nm) en houd aliquots bij -80 ° C ingevroren.
- Ontdooi de BCM voorraad direct voor gebruik en te voorkomen dat herhaalde cycli van invriezen en ontdooien.
- Voor aangegeven experimenten, genieten collageenmembranen met BCM of serumvrij medium gedurende 1 uur bij KT. Was krachtig de membranen met PBS en plaats ze in 96 putjesplaten. Natte membranen worden bezaaid met cellen.
- BCM bereidingsproces wordt samengevat in figuur 1.
2. bioassays basis van mesenchymcellen
- Seed humane mesenchymale cellen (bijvoorbeeld botcellen, gingivale en periodontale ligament fibroblasten) in een 12-wells plaat met een concentratie van 30.000 cellen / cm2. Aan zaad van de cellen gebruiken groeimedium, bestaande uit DMEM, 10% foetaal kalfsserum en antibiotica. Laat de cellen hechten aan de plaat O / N.
- Gooi het kweekmedium en was de cellen met voorverwarmde PBS bij 37 ° C. Stimuleren van de cellen door toevoeging van voorverwarmd serumvrij kweekmedium met en zonder 20% BCM. Plaats de cellen in een vochtige atmosfeer bij 37 ° C gedurende 24 uur.
- Gooi het kweekmedium, spoel de cellen met voorverwarmd PBS en pak het RNA volgens uw voorkeur protocol.
- Dient de concentratie van RNA om dezelfde hoeveelheid RNA van elk monster. Bereid cDNAs en voer een qRT-PCR om geselecteerde genen waarvan een voorbeeld in tabel 1 primers geanalyseerd.
OPMERKING: Dit zijn de verdunningen van elk onderdeel: 2x SYBR Green, 20x primer vooruit, 20x primer reverse, 5x steriel DD water, 5x cDNA. De qRT-PCR uitgevoerd in 40 cycli van 95 ° C 15 sec en 60 ° C 1 min. - Bereken het relatieve expressie niveaus door het normaliseren van de huishouding gen GAPDH met behulp van de methode Δ (ACt) waarbij OCT is CT doelgroep - CT GAPDH en Δ (OCT) is OCT-gestimuleerde - AC T controle.
- Hierna kwaliteitscontrole, voeg BCM kweekmedium voor alle soorten cellen waaronder mesenchymale cellen, hematopoietische cellen en endotheliale cellen te stimuleren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bone geconditioneerd medium wordt bereid uit verse varkens botsplinters. Algemeen overzicht van het proces BCM voorbereiden en biomaterialen in combinatie met BCM gebruikt wordt getoond in figuur 1 respectievelijk figuur 2. Tijdens het BCM preparaat is het belangrijk om grote botsplinters met lange bewegingen korte delen of zeer kleine botsplinters verkrijgen kan de kwaliteit van de uiteindelijke BCM beïnvloeden. Kwaliteit van BCM kan worden gecontroleerd door analyse van de genexpressie van BCM doelgenen: ADM, PTX3, IL11, IL33, NOX4 en PRG4 (figuur 3). ADM en PTX3 worden down-gereguleerd tot 0,4-voudige en IL11, IL33, NOX4 en PRG4 kunnen up-gereguleerd tot 200-voudig. Indien oraal fibroblasten niet BCM doelgenen expressie op het aangegeven niveau, controleer de gezondheid van de cellen of bereiden nieuwe BCM uit nieuwe onderkaak. Figuur 4 toont typische resultaten van de expressie van doelwitgenen in BCM orale fibroblasten gezaaid een collageen barrièremembraan. Orale fibroblasten gestimuleerd met 20% geconditioneerd medium uit gepasteuriseerde botsplinters en geconditioneerd medium van gedemineraliseerd bot chips, toonde vergelijkbare genexpressie cellen gestimuleerd met BCM (Tabel 2 en Tabel 3). Echter, genexpressie van orale fibroblasten blootgesteld aan geconditioneerd medium uit gesteriliseerd (121 ° C) botsplinters, was vergelijkbaar met niet-gestimuleerde controles.
Figuur 1. Samenvatting van het proces gebruikt om bot-geconditioneerd medium van vers varkensvlees kaken te bereiden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Samenvattingvan de bioassays op basis van mesenchymale cellen met BCM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Genexpressie van bot geconditioneerde medium doelgenen in orale fibroblasten. Typische resultaten van zes genen gebruikt om de kwaliteit van BCM. Genen ADM en PTX3 controle worden downregulated (A) en IL11, IL33, NOX4, PRG4 worden opgereguleerd (B). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. genexpressie van bot-conditioned medium doelgenen in orale fibroblasten gezaaid een collageen barrièremembraan. Kenmerkende resultaten van zes genen gebruikt om de kwaliteit van BCM regelen. Genen ADM en PTX3 zijn gedownreguleerd (A) en IL11, NOX4, PRG4 worden opgereguleerd (B). Afhankelijk van de gebruikte biomateriaal, kan de absorptie van groeifactoren verschillen. Collageen membranen niet aan factoren die IL33 meningsuiting derhalve IL33 expressie is niet in deze instelling geregeld controle te nemen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Afkorting | Primer forward | Primer achteruit |
| GAPDH | AGCCACATCGCTCAGACAC | GCCCAATACGACCAAATCC |
| ADM | GGACATGAAGGGTGCCTCTC | TGTTCATGCTCTGGCGGTAG |
| IL11 | TGCACCTGACACTTGACTGG | AGTCTTCAGCAGCAGCAGTC |
| IL33 | TCAGGTGACGGTGTTGATGG | GGAGCTCCACAGAGTGTTCC |
| NOX4 | TCTTGGCTTACCTCCGAGGA | CTCCTGGTTCTCCTGCTTGG |
| PRG4 | CGACGCCCAATGTAAGAAGT | GGTGATGTGGGATTATGCACT |
| PTX3 | TGTATGTGAATTTGGACAACGAA | CATTCCGAGTGCTCCTGAC |
Tabel 1: Primer sequentie van het 6-genen gebruikt.
| Genen | 80 ° C Gemiddelde ± SD | 121 ° C gemiddelde ± SD |
| ADM | 0,2 ± 0,1 | 1.1 ± 0.2 |
| PTX3 | 0,1 ± 0,1 | 0,9 ± 0,2 |
| IL11 | 20 ± 10 | 1,5 ± 1 |
| IL33 | 15 ± 5 | 1.2 ± 4 |
| NOX4 | 35 ± 15 | 2 ± 1 |
| PRG4 | 40 ± 10 | 1,8 ± 1 |
Tabel 2: Typische genexpressie van ADM, PTX3, IL11, IL33, NOX4 en PRG4 in orale fibroblasten gestimuleerd met 20% van geconditioneerd medium met warmtebehandelde botsplinters.
| Genen | Gemiddelde ± SD |
| ADM | 0,1 ± 0,1 |
| PTX3 | |
| IL11 | 15 ± 5 |
| IL33 | 20 ± 10 |
| NOX4 | 60 ± 15 |
| PRG4 | 50 ± 20 |
Tabel 3: Typische genexpressie van ADM, PTX3, IL11, IL33, NOX4 en PRG4 in orale fibroblasten gestimuleerd met 20% van geconditioneerd medium van gedemineraliseerd bot chips.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bone-geconditioneerd medium weerspiegelt de activiteit bezit van bottransplantaten in de eerste fasen van botregeneratie. De hier beschreven protocol kan worden aangepast aan de respons van verschillende soorten cellen die betrokken zijn bij botherstel te bestuderen. Bovendien kan het protocol worden gebruikt om geconditioneerd medium verwerkte bot of vulstoffen te bereiden. De werkwijzen zijn eenvoudig uit te voeren en vertrouwen op een eenvoudig concept: de factoren vrijgemaakt uit diverse natieve en verwerkt bot. Begrijpen hoe BCM beïnvloedt mesenchymale cellen kunnen helpen om meer over de graft consolidatie en eigenschappen van het bot autografts leren. Op basis van dit concept hebben we verzamelde kennis over de invloed van BCM verkregen uit natieve 11,15 en verwerkt bone 14,20 op genexpressie van mesenchymale cellen, maar ook van de proliferatie, migratie en differentiatie in de drie lijnen; osteoblasten, adipocyten en chondrocyten 11. BCM werd voor zijn capaciteit om ta onderzochtrGebruik hematopoïetische cellen, bijvoorbeeld met betrekking tot de modulatie van osteoclastogenese 13. Veel potentieel doelwit cellen wachten om te reageren op BCM in vitro, kan de protocollen hier gepresenteerde, dienen als een primer voor dit onderzoek.
Het gepresenteerde protocol zou ook animeren verder onthullen de moleculaire mechanismen hoe BCM activeert het bijzonder TGF-β-gereguleerde genen in mesenchymale cellen. Bijvoorbeeld, de TGF-β receptor I antagonist geblokkeerd SB431542 het effect van BCM op de expressie van het gen panel ADM, IL-11, NOX4, PRG4 en PTX3 11,15. Interessant, werden alkalische fosfatase en IL33 niet omgekeerd door SB431542 11,15 suggereren dat andere nog onbekende paden worden gereguleerd door BCM. Een andere open vraag wat zijn de moleculen in BCM verantwoordelijk is voor de cellulaire response? BCM bevat TGF-β, maar is niet de complexe cellulaire reacties 10,11 verklaren. Naast de invitro cellulaire aspecten, de totale vraag blijft: in welke mate doet de vrijgekomen activiteit van bottransplantaten zoals weerspiegeld door BCM, een impact hebben op de in vivo proces van botregeneratie? De protocollen en gegevens uit bioassays moeten onderzoek te introduceren in deze richting.
Dit protocol heeft beperkingen. BCM kan niet volledig worden gestandaardiseerd door variaties tussen donoren en oogsttechnieken. Bovendien, hoe enzymen aanwezig in vivo de samenstelling of activiteit van BCM kan beïnvloeden is onbekend. Toekomstige studies moeten bijvoorbeeld richten op hoe oogsttechnieken van invloed op de "biologische activiteit" van BCM. De rol van osteocyten over de samenstelling van BCM ook in detail bestudeerd. BCM bevat sclerostin, een molecuul bijna uitsluitend vrijgegeven door osteocyten 12. Beperkingen evenwel bepalen de inspiratie voor de volgende stappen in het onderzoek. Hoewel de klinische relevantie van onderzoek met BCM blijft hypothetical, onze protocollen ondersteunen het aloude concept dat bottransplantaten, ofwel inheemse of na verwerking, laat een "biologische activiteit". Inzicht in hoe bcm invloed cellen in vitro kan vermoedelijk helpen om te begrijpen hoe het bot autografts zal werken in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen. Jordi Caballé-Serrano ontving een beurs van de Stichting van de Dental Onderzoek en Onderwijs, Basel, Zwitserland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pig Mandibles | Local bucher | ||
| Bone Scraper | Hu-Friedy | PPBUSE2/36 | |
| Antibiotics & Antimicotics | All life Technologies | 15240-062 | |
| Collagen Membranes (Bio-Gide) | Geistlich | ||
| Fetal Calf Serum | Invitrogen Corporation | 16030074 | |
| DMEM | Invitrogen Corporation | 21885-025 | |
High Pure RNA Isolation Kit |
Roche | 11828665001 | |
| Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit | Roche | 4379012001 | |
| Primers | Microsynth | ||
| SYBR Green (for Q-RT-PCR) | Roche | 4673484001 | |
| PBS | Roche | 11666789001 |
References
- Buser, D. Long-term Stability of Early Implant Placement with Contour Augmentation. Journal of dental research. , (2013).
- Chiapasco, M., Casentini, P., Bone Zaniboni, M. augmentation procedures in implant dentistry. The International journal of oral & maxillofacial implants. 24 Suppl. , 237-259 (2009).
- Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Bone Tsiridis, E. substitutes: an update. Injury. 36, Suppl 3. S20-S27. , (2005).
- Jensen, S. S., Broggini, N., Hjorting-Hansen, E., Schenk, R., Bone Buser, D. healing and graft resorption of autograft, anorganic bovine bone and beta-tricalcium phosphate. A histologic and histomorphometric study in the mandibles of minipigs. Clinical oral implants research. 17, 237-243 (2006).
- Jensen, S. S. Evaluation of a novel biphasic calcium phosphate in standardized bone defects: a histologic and histomorphometric study in the mandibles of minipigs. Clinical oral implants research. 18, 752-760 (2007).
- Grabowski, G., Bone Cornett, C. A. graft and bone graft substitutes in spine surgery: current concepts and controversies. The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 21, 51-60 (2013).
- Khan, S. N. The biology of bone grafting. The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 13, 77-86 (2005).
- Bohr, H., Ravn, H. O., Werner, H. The osteogenic effect of bone transplants in rabbits. The Journal of bone and joint surgery. British. 50, 866-873 (1968).
- Bone Urist, M. R. formation by autoinduction. Science. 150, 893-899 (1965).
- Caballé-Serrano, J. D., Buser, D., Gruber, R. Proteomic analysis of porcine bone conditioned medium. The International journal of oral & maxillofacial implants. , (2014).
- Peng, J. Bone-Conditioned Medium Inhibits Osteogenic and Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Cells In Vitro. Clinical implant dentistry and related research. , (2014).
- Brolese, E., Buser, D., Kuchler, U., Schaller, B., Gruber, R. Human bone chips release of sclerostin and FGF-23 into the culture medium: an in vitro pilot study. Clinical oral implants research. , (2014).
- Caballé-Serrano, J., Bosshardt, D. D., Gargallo-Albiol, J., Buser, D., Bone Gruber, R. conditioned medium enhances osteoclastogenesis in murine bone marrow cultures. Clin Oral Impl Res; in. Int J Oral Maxillofac Surg. , (2015).
- Zimmermann, M. Bone-conditioned medium changes gene expression in bone-derived fibroblasts). IJOMI accepted. , (2014).
- Fulzele, K. Myelopoiesis is regulated by osteocytes through Gsalpha-dependent signaling. Blood. 121, 930-939 (2013).
- Becerra, J., Andrades, J. A., Ertl, D. C., Sorgente, N., Nimni, M. E. Demineralized bone matrix mediates differentiation of bone marrow stromal cells in vitro: effect of age of cell donor. Journal of. 11, 1703-1714 (1996).
- Kupcova Skalnikova,, H, Proteomic techniques for characterisation of mesenchymal stem cell secretome. Biochimie. , (2013).
- Romanello, M. Osteoblastic cell secretome: A novel role for progranulin during risedronate treatment. , Bone. (2013).
- Schuldt Filho,, G, Conditioned medium of demineralized bone matrix activates TGF-β signaling pathways in mesenchymal cells in vitro. J Cranio Maxill Surg. , (2015).
- Buser, D., Chen, S. T., Weber, H. P., Belser, U. C. Early implant placement following single-tooth extraction in the esthetic zone: biologic rationale and surgical procedures). The International journal of periodontics & restorative dentistry. 28, 441-451 (2008).
- Stoecklin-Wasmer, C. Absorbable collagen membranes for periodontal regeneration: a systematic review. Journal of dental research. 92, progress. 773-781 (2013).
