Summary
אנו מתארים כאן כיצד להכין מדיום מיזוג עצם (BCM) ולבדוק את פעילותו במבחנה.
Abstract
שתלי עצם אוטולוגית נמצאים בשימוש נרחב בניתוח, אורתופדיה, וtraumatology פה והלסתות. שתלי עצם אוטולוגית לא רק להחליף עצם חסר, הם גם תומכים בתהליך המורכב של התחדשות עצם. התנהגות חיובית זו של autografts מיוחסת לשלושה מאפיינים: osteoconductivity, osteogenicity, וosteoinductivity. עם זאת, יש היבט נוסף: העצם שתל לשחרר מספר עצום של מולקולות, כולל גורמי גדילה, אשר יכול למקד תאי mesenchymal המעורבים בהתחדשות עצם. המאפיינים אוטוקריני של שתלי עצם ניתן ללמוד במבחנה על ידי השימוש במדיום מיזוג עצם (BCM). כאן אנו מציגים פרוטוקול על איך להכין מדיום מיזוג עצם מעצם קליפת המוח חזיר ילידים, ועצם שעבר תהליך עיבוד או איבוד מינרלים תרמיים. תאים יכולים להיות חשופים ישירות לBCM או זורעים על ביו-חומרים, כגון ממברנות קולגן, ספוג בעבר עם BCM. אנחנו נותנים דוגמאות במבחנת bioassaי"ש עם תאי mesenchymal בביטוי של גנים מוסדרים TGF-β. הפרוטוקולים שהוצגו לעודד לחשוף עוד יותר את ההשפעות אוטוקריני של שתלי עצם במהלך התחדשות עצם ולפתוח נתיב למחקר translational בתחום הרחב של ניתוח שחזור.
Introduction
עצם אוטולוגית נעשה שימוש נרחב לגשר פגמים שנפלו כתוצאה ממום, ניתוח resective, ניתוח שחזור טראומה, ולפני מיקום שתל 1,2. הבנת העקרונות הביולוגיים של כמה תלי עצם לתמוך בתהליך של איחוד שתל היא לא מפתח היחיד להבין מדוע autografts נחשב סטנדרטי בניתוח שחזור הזהב, הוא גם יונית לעיצוב המשופר של תחליפי עצם 3. ובכל זאת, איחוד שתל הוא מהיר יותר עם עצם אוטולוגית לעומת עצם תחליפי 4,5. לפיכך, הוא הכרחי כדי לחשוף את המנגנונים המולקולריים ותאיים שגורמים עצם אוטולוגית כל כך יעיל לתמיכה בהתחדשות עצם.
ישנם שלושה מאפייני ספר לימוד של autografts שנחשבים לתמיכה בתהליך האיחוד 6,7. העצם ראשון, אוטולוגית הוא osteoconductive, מתן הדרכה לעצם החדש שנוצר לגדוללפגם. שנית, עצם אוטולוגית הוא osteogenic, כלומר הוא מכיל תאי mesenchymal שיכול להתמיין לosteoblasts 8. עצם שלישי, אוטולוגית הוא osteoinductive כגורמי גדילה כמו חלבוני המוךפו"גנטי העצם קבורים במטריצה יכולים להתחיל בתהליך של endochondral או אפילו יצירת עצם intramembranous 9. יש היבט נוסף: שבבי עצם מוכנים טרי להחזיק פונקציה אוטוקריני מבוססת על התצפיות במבחנה עם "בינוני מותנה עצם" 10-15. גם את ההשפעה של myelopoiesis יצוין 16. טווח דומה "בינוני עצם demineralized מיזוג מטריצה" כבר נטבע בשנת 1996 ותומך ברעיון הכללי של פונקציה אוטוקריני של עצם, גם כאשר מעובד על ידי איבוד מינרלים 17. למטרות שלנו, BCM יכול להיות מוכן מחזיר טרי לסתות 10,11. ניתוחי proteomic של BCM חשפו את ההרכב המורכב, הכוללים למעשה צמיחהORS ומרכיבים של מטריקס 10, גם הרחבת ידע הקיים בפרוטאזום של כל עצם 18,19. לפיכך, BCM צריך לשקף את הפעילות המסחרית של שינויים שונים של שתלי עצם במבחנה.
מה קורה כאשר תאי mesenchymal, למשל אלה מבודדים משבבי עצם או מרקמות רכות בעל פה, נחשפים לBCM? במבחנה, BCM מפחית osteogenic ובידול adipogenic, ומעורר עלייה חזקה של ביטוי IL11 11. הגנום microarray הרחב גילה גנים רבים יותר לבוא לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי בתאי mesenchymal בתגובה לBCM. בין הגנים הללו adrenomedullin (ADM) הם, IL11, IL33, מונואמין NADPH 4 (NOX4), פרוטאו 4 (PRG4, או lubricin) וpentraxin 3 (PTX3) 15. BCM מתקבל משבבי עצם autoclaved לא הצליח לשנות את הביטוי של גנים בהתאמה 14. BCM משבבי עצם שעברו פסטור והקפאה היה מסוגללשנות ביטוי גני 14. בינוני גם מותנה של מטריצת demineralized עצם (DBM-CM) משנה את הביטוי של TGF-β-מוסדרת גנים 20. מעניין לציין, קרומי מחסום קולגן משמשים להגן על שבבי עצם מהרקמות הרכות סביב 21,22, נספחים אותם חלקים של BCM שאחראים לשינויים בביטוי הגנים 23. מחקר BCM יכול להתארך עד סוגי תאים אחרים מעורבים בהתחדשות עצם כגון osteoclasts resorbing-עצם ותאי האנדותל, עד כמה שם. בסך הכל, במבחנה נתוני צבירה לספק את הבסיס המדעי לעיצובו של מחקר פרה-קליני.
הפרוטוקול הנוכחי הוא כפול: ראשית, הוא מראה כיצד להכין BCM. שנית, הוא מראה איך לבדוק הפעילות הביולוגית שלה מבוסס על תאי mesenchymal במבחנה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת BCM
- להשיג לסתות חזיר מהקצב המקומי הטרי ככל האפשר. מניחים את הלסתות על משטח יציב ולשחרר דש בעובי מלא תשומת לב מיוחדת שלא להשאיר את כל רקמה רכה או periosteum מצורף לעצם. לעבוד בסביבה נקייה ללא הצורך לעבוד תחת מכסה המנוע הזרימה.
- ברגע שדש בעובי מלא הוא שוחרר, להשתמש מגרד עצם לקצור את שבבי עצם מהצד הלחי. שים לב שמגרד העצם צריך להיות חד. ידית בחוזקה מגרד העצם ועם תנועות ארוכות לאסוף את העצם. בטל שבבי עצם קטנים יותר 1 מ"מ ש.
- כדי לשמור על שבבי עצם ילידים, למקם ישירות שבבי העצם בצלחות פלסטיק של 10 ס"מ קוטר עם המדיום של הנשר השתנה Dulbecco (DMEM) בתוספת אנטיביוטיקה 1% וantimycotics לא לתת להם להתייבש.
- כדי להעריך את ההשפעה של עיבוד תרמי, שבבי עצם כפופים לפסטור למשך 30 דקות ב 80 מעלות צלזיוס אוהחיטוי במשך 20 דקות ב 121 מעלות צלזיוס.
- כדי להעריך את ההשפעה של איבוד מינרלים, לנער שבבי עצם ב 1 M HCL במשך 4-6 שעות על 4 מעלות צלזיוס ולשטוף שוב ושוב עם מדיום התרבות עד pH ניטראלי.
- הנח כולל של 5 גרם של שבבי עצם לDMEM הטרי 10 מיליליטר בתוספת אנטיביוטיקה 1% וantimycotics לתוך צלחת פלסטיק חדשה.
- מניחים את צלחות פלסטיק באווירת humidified על 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. לאחר מכן, BCM קציר. צנטריפוגה BCM ב XG 200 במשך 10 דקות כדי להסיר שאריות, לסנן אותה (ננומטר 0.2) סטרילי, ולשמור aliquots הקפוא ב -80 ° C.
- להפשיר את מניית BCM מייד לפני השימוש ולהימנע ממחזורים חוזרים ונשנים של הקפאה והפשרה.
- בניסויים שצוינו, לספוג קרומי קולגן עם מדיום BCM או סרום ללא עבור שעה 1 ב RT. לשטוף במרץ הקרומים עם PBS ולהכניס אותם לתוך 96 צלחות גם. קרומים רטובים הם זורעים עם תאים.
- תהליך הכנת BCM מסוכם באיור 1.
2. bioassays המבוסס על תאי mesenchymal
- תאי זרע אנושיים mesenchymal (לדוגמא תאי עצם, חניכיים ופיברובלסטים רצועת חניכיים) לתוך צלחת 12 גם עם ריכוז של 30,000 תאים / 2 סנטימטר. זרע התאים להשתמש מדיום גידול בהיקף של DMEM, 10% בסרום עגל עוברי ואנטיביוטיקה. בואו התאים לצרף N / O הצלחת.
- מחק את מדיום התרבות לשטוף את התאים עם PBS מראש חימם על 37 מעלות צלזיוס. לעורר את התאים על ידי הוספת תרבות בינוני סרום ללא מחוממת מראש עם ובלי BCM 20%. מניחים את התאים באווירת humidified על 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות.
- מחק את מדיום התרבות, לשטוף את התאים עם PBS מראש חימם ולחלץ את RNA על פי הפרוטוקול המועדף עליך.
- התאם את הריכוז של רנ"א כדי שתהיה לה הכמות של RNA בכל דגימה. הכן cDNAs ולבצע qRT-PCR לנתח את הגנים שנבחרו באמצעות פריימרים מוצגים בטבלה 1.
הערה: אלה הם דילולים של כל רכיב: 2x SYBR הירוק, 20x פריימר קדימה, 20x הפוך פריימר, מים DD סטרילי 5x, 5x cDNA. QRT-PCR מתבצע ב40 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס 15 שניות ו -60 מעלות צלזיוס 1 דק '. - לחשב את רמות הביטוי היחסית על ידי נרמול לGAPDH גן המשק בשיטת Δ (ΔCt) בי ΔCT היא יעד CT - CT GAPDH וΔ (ΔCT) הוא ΔCT המגורה - ΔCT שליטה.
- לאחר בקרת איכות זו, להוסיף BCM למדיום תרבות כדי לעורר את כל סוגי תאים, כולל תאי mesenchymal, תאי hematopoietic או תאי האנדותל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בינוני אוויר עצם מוכן משבבי עצם חזירי טריים. סקירה כללית של התהליך להכנת BCM ולהשתמש בביו-חומרים בשילוב עם BCM מוצגת באיור 1 ואיור 2 בהתאמה. במהלך הכנת BCM, חשוב להשיג שבבי עצם גדולים עם תנועות ארוכות כתנועות קצרות או שבבי עצם קטנים מאוד יכול להשפיע על האיכות של BCM הסופי. איכות של BCM יכולה להיות נשלטה על ידי ניתוח ביטוי גנים של גני מטרת BCM: ADM, PTX3, IL11, IL33, NOX4 וPRG4 (איור 3). ADM וPTX3 מוסדרים מטה-מטה ל -0.4 פי וIL11, IL33, NOX4 וPRG4 יכולים להיות מוסדר עד-200-פי. אם fibroblasts האוראלי אינו מבטא גני מטרת BCM ברמה לראות, לבדוק את בריאותם של התאים או להכין BCM החדש מלסתות חדשות. איור 4 מציגה תוצאות טיפוסיות מהביטוי של גני מטרת BCM בfibroblasts האוראלי זורעים על קרום מחסום קולגן. fibroblasts האוראלי מגורה עם 20% של מדיום מותנה משבבי עצם מפוסטרים ובינוני מותנים משבבי עצם demineralized, הראה ביטוי גנים דומה לתאי מגורה עם BCM (לוח 2 ולוח 3). עם זאת, ביטוי גנים של fibroblasts האוראלי נחשף למדיום מותנה משבבי עצם (121 מעלות צלזיוס) מעוקרים, היה דומה לבקרות מגורה האו"ם.
איור 1. סיכום של התהליך המשמש להכנה בינונית מותנה עצם מלסתות חזיר טריים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
סיכום 2. איורשל bioassays המבוסס על תאי mesenchymal עם BCM. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. התבטאות גנים של גני מטרה בינונית מותנה עצם בfibroblasts האוראלי. תוצאות אופייניות של שישה גנים משמשים לשליטה על האיכות של BCM. ADM גנים וPTX3 הם downregulated () וIL11, IL33, NOX4, PRG4 הוגברו (B). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. ביטוי גנים של עצם על מצבוגני ד בינוניים יעד בfibroblasts האוראלי זורעים על קרום מחסום קולגן. תוצאות אופייניות של שישה גנים משמשים לשליטה על האיכות של BCM. ADM גנים וPTX3 הם downregulated () וIL11, NOX4, PRG4 הוגברו (B). בהתאם לחומר ביולוגי משמש, הקליטה של גורמי גדילה יכולה להיות שונה. קרומי קולגן לא לספוג גורמים השולטים ביטוי IL33, לכן ביטוי IL33 אינו מוסדר בהגדרה זו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| קיצור | קדימה פריימר | הפוך פריימר |
| GAPDH | AGCCACATCGCTCAGACAC | GCCCAATACGACCAAATCC |
| ADM | GGACATGAAGGGTGCCTCTC | TGTTCATGCTCTGGCGGTAG |
| IL11 | TGCACCTGACACTTGACTGG | AGTCTTCAGCAGCAGCAGTC |
| IL33 | TCAGGTGACGGTGTTGATGG | GGAGCTCCACAGAGTGTTCC |
| NOX4 | TCTTGGCTTACCTCCGAGGA | CTCCTGGTTCTCCTGCTTGG |
| PRG4 | CGACGCCCAATGTAAGAAGT | GGTGATGTGGGATTATGCACT |
| PTX3 | TGTATGTGAATTTGGACAACGAA | CATTCCGAGTGCTCCTGAC |
טבלה 1: רצף פריימר של הגנים 6 בשימוש.
| גנים | 80 מעלות צלזיוס ממוצע ± SD | 121 מעלות צלזיוס ממוצע ± SD |
| ADM | 0.2 ± 0.1 | 1.1 ± 0.2 |
| PTX3 | 0.1 ± 0.1 | 0.9 ± 0.2 |
| IL11 | 20 ± 10 | 1.5 ± 1 |
| IL33 | 15 ± 5 | 1.2 ± 4 |
| NOX4 | 35 ± 15 | 2 ± 1 |
| PRG4 | 40 ± 10 | 1.8 ± 1 |
טבלה 2: ביטוי גנים אופייני של ADM, PTX3, IL11, IL33, NOX4 וPRG4 בfibroblasts הפה מגורה עם 20% של מדיום מותנה משבבי עצם שטופל בחום.
| גנים | ממוצע ± SD |
| ADM | 0.1 ± 0.1 |
| PTX3 | |
| IL11 | 15 ± 5 |
| IL33 | 20 ± 10 |
| NOX4 | 60 ± 15 |
| PRG4 | 50 ± 20 |
טבלה 3: ביטוי גנים אופייני של ADM, PTX3, IL11, IL33, NOX4 וPRG4 בfibroblasts הפה מגורה עם 20% של מדיום מותנה משבבי עצם demineralized.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בינוני-מותנה עצם משקף את הפעילות המסחרית של שתלי עצם בשלבים המוקדמים של התחדשות עצם השלבים. הפרוטוקול המתואר כאן ניתן להתאים ללמוד את תגובת סוגים שונים של תאים מעורבים בהתחדשות עצם של. יתר על כן, הפרוטוקול יכול לשמש כדי להכין מדיום מותנה ממילוי עצם או עצם מעובד. השיטות קלים לביצוע ומסתמך על רעיון פשוט: הגורמים שוחררו מעצם ילידי מעובד ושונים. ההבנה כיצד BCM משפיעה על תאי mesenchymal יכולים לעזור כדי ללמוד עוד על איחוד שתל ומאפיינים של autografts עצם. בהתבסס על תפיסה זו שצברנו ידע על ההשפעה של BCM מתקבלת מעצם ילידי 11,15 ומעובד 14,20 על ביטוי גנים של תאי mesenchymal, אלא גם על התפשטות, הגירה, והבחנה לשלוש השושלות עיקריות; osteoblasts, adipocytes וכונדרוציטים 11. BCM נבחן גם ליכולתה ת"אr קבל תאי דם, למשל ביחס לאפנון של osteoclastogenesis 13. תאי יעד פוטנציאליים רבים מחכים להגיב לBCM במבחנה, הפרוטוקולים שהוצגו כאן, יכולים לשמש כצבע יסוד למחקר זה.
הפרוטוקולים שהוצגו צריכים גם את הנפש כדי לחשוף עוד יותר את המנגנונים המולקולריים של איך BCM מפעיל גנים במיוחד TGF-β-מוסדרת בתאי mesenchymal. לדוגמא, קולט TGF-β אני אנטגוניסט SB431542 חסם את ההשפעה של BCM על הביטוי של ADM פנל הגן, IL-11, NOX4, PRG4, וPTX3 11,15. מעניין לציין, phosphatase אלקליין וIL33 לא התהפכו על ידי SB431542 11,15 טוענים כי מסלולים עדיין לא ידועים אחרים מוסדרים על ידי BCM. שאלה פתוחה נוספת היא מה המולקולות בBCM להיות אחראית לתגובה התאית? BCM מכיל TGF-β אבל הוא אינו מסביר את התגובות התאיות המורכבות 10,11. חוץ מזה במבחנה היבטים סלולריים, השאלה הכללית נותרת: שלהאריך עושה הפעילות המסחרית של שתלי עצם כפי שמשתקף בBCM, יש השפעה על תהליך vivo של התחדשות עצם? הפרוטוקולים ונתונים מbioassays צריכים להציג את המחקר בכיוון זה.
יש פרוטוקול זה מגבלות. BCM לא ניתן טופל באופן מלא בגלל וריאציות בין תורמים וטכניקות קצירה. יתר על כן, איך אנזימים הנוכחיים in vivo יכולים להשפיע על הרכב או פעילות של BCM נותר עלום. מחקרים עתידיים צריכים, למשל, מתמקדים בכמה טכניקות קצירה להשפיע "הפעילות ביולוגית" של BCM. גם התפקיד של osteocytes על הרכב BCM יש ללמוד בפירוט. BCM מכיל sclerostin, מולקולה שפורסמה כמעט באופן בלעדי על ידי osteocytes 12. מגבלות, עם זאת, לספק ההשראה לצעדים הבאים במחקר. למרות הרלוונטיות הקלינית של מחקר עם BCM נשארה הי"דpothetical, הפרוטוקולים שלנו תומכים ברעיון הוותיק שתלי עצם, או האם לאחר עיבוד או, לשחרר "פעילות ביולוגית". הבנה כיצד BCM משפיע על תאים במבחנה יכולה להניח לעזור להבין איך autografts העצם יעבוד in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין לחשוף. ג'ורדי Caballé-סראנו קיבל מלגה מטעם הקרן למחקר לרפואת שיניים וחינוך, באזל, שווייץ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pig Mandibles | Local bucher | ||
| Bone Scraper | Hu-Friedy | PPBUSE2/36 | |
| Antibiotics & Antimicotics | All life Technologies | 15240-062 | |
| Collagen Membranes (Bio-Gide) | Geistlich | ||
| Fetal Calf Serum | Invitrogen Corporation | 16030074 | |
| DMEM | Invitrogen Corporation | 21885-025 | |
High Pure RNA Isolation Kit |
Roche | 11828665001 | |
| Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit | Roche | 4379012001 | |
| Primers | Microsynth | ||
| SYBR Green (for Q-RT-PCR) | Roche | 4673484001 | |
| PBS | Roche | 11666789001 |
References
- Buser, D. Long-term Stability of Early Implant Placement with Contour Augmentation. Journal of dental research. , (2013).
- Chiapasco, M., Casentini, P., Bone Zaniboni, M. augmentation procedures in implant dentistry. The International journal of oral & maxillofacial implants. 24 Suppl. , 237-259 (2009).
- Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Bone Tsiridis, E. substitutes: an update. Injury. 36, Suppl 3. S20-S27. , (2005).
- Jensen, S. S., Broggini, N., Hjorting-Hansen, E., Schenk, R., Bone Buser, D. healing and graft resorption of autograft, anorganic bovine bone and beta-tricalcium phosphate. A histologic and histomorphometric study in the mandibles of minipigs. Clinical oral implants research. 17, 237-243 (2006).
- Jensen, S. S. Evaluation of a novel biphasic calcium phosphate in standardized bone defects: a histologic and histomorphometric study in the mandibles of minipigs. Clinical oral implants research. 18, 752-760 (2007).
- Grabowski, G., Bone Cornett, C. A. graft and bone graft substitutes in spine surgery: current concepts and controversies. The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 21, 51-60 (2013).
- Khan, S. N. The biology of bone grafting. The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 13, 77-86 (2005).
- Bohr, H., Ravn, H. O., Werner, H. The osteogenic effect of bone transplants in rabbits. The Journal of bone and joint surgery. British. 50, 866-873 (1968).
- Bone Urist, M. R. formation by autoinduction. Science. 150, 893-899 (1965).
- Caballé-Serrano, J. D., Buser, D., Gruber, R. Proteomic analysis of porcine bone conditioned medium. The International journal of oral & maxillofacial implants. , (2014).
- Peng, J. Bone-Conditioned Medium Inhibits Osteogenic and Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Cells In Vitro. Clinical implant dentistry and related research. , (2014).
- Brolese, E., Buser, D., Kuchler, U., Schaller, B., Gruber, R. Human bone chips release of sclerostin and FGF-23 into the culture medium: an in vitro pilot study. Clinical oral implants research. , (2014).
- Caballé-Serrano, J., Bosshardt, D. D., Gargallo-Albiol, J., Buser, D., Bone Gruber, R. conditioned medium enhances osteoclastogenesis in murine bone marrow cultures. Clin Oral Impl Res; in. Int J Oral Maxillofac Surg. , (2015).
- Zimmermann, M. Bone-conditioned medium changes gene expression in bone-derived fibroblasts). IJOMI accepted. , (2014).
- Fulzele, K. Myelopoiesis is regulated by osteocytes through Gsalpha-dependent signaling. Blood. 121, 930-939 (2013).
- Becerra, J., Andrades, J. A., Ertl, D. C., Sorgente, N., Nimni, M. E. Demineralized bone matrix mediates differentiation of bone marrow stromal cells in vitro: effect of age of cell donor. Journal of. 11, 1703-1714 (1996).
- Kupcova Skalnikova,, H, Proteomic techniques for characterisation of mesenchymal stem cell secretome. Biochimie. , (2013).
- Romanello, M. Osteoblastic cell secretome: A novel role for progranulin during risedronate treatment. , Bone. (2013).
- Schuldt Filho,, G, Conditioned medium of demineralized bone matrix activates TGF-β signaling pathways in mesenchymal cells in vitro. J Cranio Maxill Surg. , (2015).
- Buser, D., Chen, S. T., Weber, H. P., Belser, U. C. Early implant placement following single-tooth extraction in the esthetic zone: biologic rationale and surgical procedures). The International journal of periodontics & restorative dentistry. 28, 441-451 (2008).
- Stoecklin-Wasmer, C. Absorbable collagen membranes for periodontal regeneration: a systematic review. Journal of dental research. 92, progress. 773-781 (2013).
