Summary
우리는 뼈 에어컨 매체 (BCM)을 준비하고 시험 관내에서 활동을 테스트하는 방법을 여기에 대해 설명합니다.
Abstract
자가 뼈 이식 널리 구강 악안면 외과, 정형 외과 및 외상에 사용됩니다. 자가 뼈 이식은 누락 된 뼈를 대체하지, 그들은 또한 골 재생의 복잡한 과정을 지원합니다. 자가 이식이 유리한 동작은 세 가지 특징에 기인한다 : osteoconductivity, osteogenicity 및 osteoinductivity을. 그러나, 다른 측면이있다 : 뼈 골 재생에 관련된 중간 엽 세포를 대상으로 할 수 성장 인자를 포함하여 분자의 무수 해제 접목. 골 이식의 분비 속성은 뼈 에어컨 매체 (BCM)를 사용하여 시험 관내에서 공부하실 수 있습니다. 여기에서 우리는 열 처리 또는 탈회를 시행 기본 돼지 피질 뼈에서 뼈 에어컨 매체를 준비하는 방법에 대한 프로토콜 및 뼈를 제시한다. 세포는 직접 BCM에 노출 또는 콜라겐 멤브레인, 이전 BCM 적신 같은 생체 재료,에 접종 할 수있다. 우리는 체외 bioassa에 대한 예를들TGF-β 조절 유전자의 발현에 중간 엽 세포와 YS. 제시된 프로토콜은 추가 골 재생시 뼈 이식의 분비 효과를 밝혀 및 재건 수술의 폭 넓은 분야의 중개 연구에 대한 경로를 엽니 다 장려해야한다.
Introduction
자가 뼈 널리 기형의 결과, resective 수술, 재건 외상 수술, 이전 임플란트 식립 1, 2에로 발생한 결함을 연결하는 데 사용됩니다. 뼈 이식은 이식 통합의 과정을 지원하는 방법의 생물학적 원리를 이해하는 것은자가 이식이 재건 수술의 황금 표준으로 간주하는 이유를 이해하기 만 키가 아닌, 그것은 또한 뼈 대체 (3)의 개선 된 디자인에 생체 공학입니다. 그러나 이식 통합은 빠른자가 뼈와 뼈가 4,5 대체 비교된다. 따라서, 골 재생을 지원하기 때문에 효과적인 자가골을 분자 세포 메커니즘을 나타 내기 위해 필수적이다.
통합 프로세스의 6,7을 지원하는 것으로 간주되는자가 이식의 세 교과서의 특성이 있습니다. 첫째,자가 뼈가 성장하는 새로 형성된 뼈에 대한 지침을 제공, osteoconductive입니다결함에. 둘째,자가 뼈는 조골 세포 (8)로 분화 할 수 중간 엽 세포를 포함 즉, 골 형성이다. 매트릭스 내에 안치 뼈 형태 형성 단백질 유사 성장 인자 연골 또는 골 형성 intramembranous (9)의 처리를 개시 할 수있다 셋째, 자가골은 골 유도된다. 또 다른 측면이있다 : 갓 준비 뼈 칩은 "뼈 에어컨 매체"10 ~ 15과 체외 관찰을 기반으로 분비 기능을 유지. 또한 myelopoiesis의 영향은 16를 언급한다. "탈회 골 기질 - 조정 배지"A와 유사한 용어는 이미 탈회 (17)에 의해 처리 된 경우에도, 1996 년 낸 뼈의 분비 기능의 전체적인 개념을 지원 하였다. 우리의 목적을 위해, BCM은 10,11 하악골 신선한 돼지로부터 제조 될 수있다. BCM의 프로테옴 분석은 성장의 사실을 포함하여, 복잡한 구성을 밝혀ORS과 세포 외 기질 (10)의 성분은, 또한 전체의 뼈 18,19 테아의 기존 기술을 연장. 따라서, BCM은 시험관 내에서 뼈 이식의 다양한 변형의 공개 활동을 반영해야한다.
중간 엽 세포는, 예를 들어 뼈 칩 또는 구두 부드러운 조직에서 분리 된 사람들을 위해, BCM 수 있나요? 체외 노출되었을 때 어떻게됩니까, BCM은 골 형성과 지방 세포 분화를 감소시키고, IL11 식 (11)의 강한 증가를 불러 일으킨다. 게놈 넓은 마이크로 어레이는 차등 BCM에 대한 응답으로 중간 엽 세포에서 발현되는 많은 유전자를 한 것으로 밝혀졌습니다. 이들 유전자 중 adrenomedullin (ADM)이며, IL11, IL33, NADPH 산화 효소 4 (NOX4), 프로테오글리칸 4 (PRG4, 또는 lubricin) 및 3 (PTX3) 15 pentraxin. 멸균 뼈 칩으로부터 얻어진 BCM은 각각 14 유전자의 발현을 변경하지 못한 경우. 저온 살균을 시행하고 동결 뼈 칩에서 BCM은 할 수 있었다유전자 발현 (14)을 변경합니다. 탈회 골 기질 (DBM-CM)의 또한 에어컨 매체는 TGF-β 조절 유전자 (20)의 표현을 변경합니다. 흥미롭게도, 주위의 부드러운 조직 뼈 (21, 22)로부터 칩을 보호하는 데 콜라겐 배리어 막은, 유전자 발현의 변화 (23)에 대한 책임 BCM의 그 부분을 흡착. BCM 연구는 몇 가지 이름을, 같은 뼈 재 흡수 파골 세포와 내피 세포로 골 재생에 관여하는 다른 세포 유형으로 확장 할 수 있습니다. 전반적으로, 축적 체외 데이터는 임상 연구의 설계를위한 과학적 근거를 제공한다.
본 프로토콜은 두 가지입니다 : 첫째, BCM을 준비하는 방법을 보여줍니다. 둘째, 체외에서 중간 엽 세포를 기반으로 생물학적 활성을 테스트하는 방법을 보여줍니다.
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Protocol
1. BCM 준비
- 가능한 한 신선한 지역 정육점에서 돼지 턱을 얻습니다. 회사 표면에 턱을 놓고 전체 두께 플랩이있는 부드러운 조직을 떠나거나 뼈에 부착 된 골막하지 않도록 특별한주의를 기울이고 놓습니다. 흐름 후드에서 작동 할 필요없이 깨끗한 환경에서 작업.
- 전체 두께 플랩이 해제되면, 협측에서 뼈 칩을 수확 뼈 스크레이퍼를 사용합니다. 뼈 스크레이퍼 날카로운되어 있어야합니다. 단단히 뼈 스크레이퍼를 처리하고 긴 운동은 뼈를 수집로. 작은 그 1mm를 뼈 칩을 폐기하십시오.
- 기본 뼈 칩을 유지하기 위해, 1 %의 항생제와 그들을 밖으로 건조를 허용하지 않습니다 항진균제 보충 둘 베코의 수정 이글의 중간 (DMEM)와 10cm 직경의 플라스틱 접시에 직접 뼈 칩을 놓습니다.
- 열처리의 영향을 평가하기 위해, 대상 뼈 칩은 80 ° C에서 30 분 동안 저온 살균 또는121 ℃에서 20 분 동안 오토 클레이브.
- , 탈회의 영향을 평가 4 ℃에서 4-6 시간 동안 1 M HCL에 뼈 칩을 흔들 pH가 중성이 될 때까지 배양 배지로 반복 세척합니다.
- 새로운 플라스틱 접시에 1 % 항생제와 항진균제로 보충 된 10 ml의 신선한 DMEM 당 뼈 칩 5 g의 총을 놓습니다.
- 24 시간 동안 37 ℃에서 가습 분위기에서 플라스틱 접시를 놓습니다. 그런 다음, 수확 BCM. 원심 분리기, 파편을 제거 멸균 (0.2 nm의) 필터, -80 ℃에서 냉동 분취 량을 유지하기 위해 10 분 동안 200 XG에 BCM.
- 바로 사용하기 전에 BCM 주식을 해동과 동결 융해의 반복주기를 피하십시오.
- 나타낸 실험에서, RT에서 1 시간 동안 BCM 또는 무 혈청 배지로 콜라겐 막을 담가. PBS로 적극적으로 막을 세척하고 96 웰 플레이트에 배치합니다. 젖은 막은 세포와 씨앗을 품고있다.
- BCM의 제조 공정은도 1에 요약 하였다.
간엽 세포 기준 2. 생물학적 정량
- / cm 2 30,000 세포의 농도로 12 웰 플레이트 (예를 들어, 골 세포, 치은 및 치주 인대 섬유 아세포) 종자 인간 간엽 세포. 세포를 DMEM으로 이루어지는 성장 배지, 10 % 소 태아 혈청과 항생제를 사용 시드. 세포는 플레이트의 O / N에 부착하자.
- 문화 매체를 취소하고 37 ° C에서 미리 예열 PBS로 세포를 씻어. 와 20 % BCM없이 예열 무 혈청 배지를 첨가하여 세포를 자극한다. 24 시간 동안 37 ° C에서 가습 된 분위기에서 셀을 놓는다.
- , 문화 매체를 폐기 미리 예열 PBS로 세포를 씻어하고 원하는 프로토콜에 따라 RNA를 추출.
- 각 샘플에서 RNA의 동일한 금액을하기 위해 RNA의 농도를 조정합니다. cDNA를 준비하고, 표 1에 나타낸 프라이머를 사용하여 선택된 유전자를 분석 QRT-PCR을 수행한다.
참고 :이 모든 구성 요소의 희석 수 있습니다 : 배 SYBR 녹색, 20 배 프라이머 앞으로, 20 배 프라이머 역, 5 배 무균 DD 물, 5 배의 cDNA. QRT-PCR은 95 ° C 15 초, 40 사이클 및 60 ° C에서 1 분간 수행된다. - CT GAPDH와 Δ (ΔCT) ΔCT 자극 - - ΔCT 제어 ΔCT는 CT의 대상이되는 Δ (ΔCT) 방법을 사용하여 하우스 키핑 유전자 GAPDH에 정상화가 상대적 발현 수준을 계산합니다.
- 이 품질 관리 후에, 중간 엽 세포, 조혈 세포 또는 내피 세포를 포함하여 모든 유형의 세포를 자극하는 배양액을 추가로 BCM.
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Representative Results
뼈 조정 배지를 신선한 돼지 뼈 칩으로부터 제조된다. 공정의 일반 개요 BCM을 준비하고 BCM 생체 물질과 조합을 사용은도 1 및도 2에 각각 도시되어있다. BCM 준비 동안, 최종 BCM의 품질에 영향을 미칠 수있는 짧은 움직임 또는 매우 작은 뼈 칩만큼 움직임 큰 뼈 칩을 얻는 것이 중요하다. ADM, PTX3, IL11, IL33, NOX4 및 PRG4 (도 3) : BCM의 품질 BCM 타겟 유전자의 유전자 발현을 분석하여 제어 될 수있다. ADM과 PTX3 0.4 배 아래로 아래로 조절하고 200 배에 규제까지-IL11, IL33, NOX4 및 PRG4이 될 수 있습니다. 구강 섬유 아세포 표시된 수준에서 BCM의 표적 유전자를 발현하지 않는 경우, 세포의 상태를 확인하거나 새로운 턱에서 새로운 BCM을 준비합니다. 콜라겐 장벽 막에 시드 구강 섬유 아세포에서 BCM 대상 유전자의 발현에서 4 표시에게 전형적인 결과를 그림. 구강 섬유 아세포 살균 뼈 칩에서 조정 배지 및 탈회 골 칩에서 조정 배지의 20 %를 자극, BCM (표 2 및 표 3)로 자극 세포에 유사한 유전자 발현을 나타냈다. 그러나, 경구 아세포의 유전자 발현이 멸균 (121 ° C)에서 뼈 칩 조정 배지에 노출되지 않은 자극 제어에 필적 하였다.
그림 1. 신선한 돼지 턱에서 뼈 에어컨 매체를 제조하는 데 사용되는 프로세스의 개요. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 요약BCM와 중간 엽 세포를 기반으로 생물 검정의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
경구 섬유 아세포에서 뼈 조정 배지 표적 유전자의 3 유전자 발현을 도표. BCM. 유전자의 ADM과 PTX3의 품질을 제어하는 데 사용 여섯 유전자의 전형적인 결과를 하향 조절된다 (A)와 IL11는, IL33, NOX4, PRG4는 (B)를 상향 조절된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 뼈 conditione의 유전자 발현콜라겐 배리어 막 상에 시드 경구 아세포에서 D 중간 표적 유전자. BCM의 품질을 제어하는 데 사용 여섯 유전자의 전형적인 결과. 유전자의 ADM과 PTX3는 하향 조절된다 (A)와 IL11, NOX4, PRG4는 (B)를 상향 조절된다. 사용 된 생체 재료에 따라, 성장 인자의 흡수는 다를 수있다. 콜라겐 멤브레인 따라서 IL33 발현이 설정에 규정되지 않은 IL33 발현을 제어하는 요인을 흡수하는 데 실패했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 약어 | 프라이머 앞으로 | 프라이머 역 |
| GAPDH | AGCCACATCGCTCAGACAC | GCCCAATACGACCAAATCC |
| ADM | GGACATGAAGGGTGCCTCTC | TGTTCATGCTCTGGCGGTAG |
| IL11 | TGCACCTGACACTTGACTGG | AGTCTTCAGCAGCAGCAGTC |
| IL33 | TCAGGTGACGGTGTTGATGG | GGAGCTCCACAGAGTGTTCC |
| NOX4 | TCTTGGCTTACCTCCGAGGA | CTCCTGGTTCTCCTGCTTGG |
| PRG4 | CGACGCCCAATGTAAGAAGT | GGTGATGTGGGATTATGCACT |
| PTX3 | TGTATGTGAATTTGGACAACGAA | CATTCCGAGTGCTCCTGAC |
표 1 : 사용 (6) 유전자의 프라이머 순서.
| 유전자 | 80 ° C 평균 ± 표준 편차 | 121 ° C 평균 ± 표준 편차 |
| ADM | 0.2 ± 0.1 | 1.1 ± 0.2 |
| PTX3 | 0.1 ± 0.1 | 0.9 ± 0.2 |
| IL11 | 20 ± 10 | 1.5 ± 1 |
| IL33 | 15 ± 5 | 1.2 ± 4 |
| NOX4 | 35 ± 15 | 2 ± 1 |
| PRG4 | 40 ± 10 | 1.8 ± 1 |
표 2 : ADM, PTX3, IL11, IL33, 열처리 뼈 칩에서 조정 배지의 20 %를 자극 경구 섬유 아세포 및 NOX4 PRG4 일반적인 유전자 발현.
| 유전자 | ± 표준 편차 평균 |
| ADM | 0.1 ± 0.1 |
| PTX3 | |
| IL11 | 15 ± 5 |
| IL33 | 20 ± 10 |
| NOX4 | 60 ± 15 |
| PRG4 | 50 ± 20 |
표 3 : ADM, PTX3, IL11, IL33, 탈회 골 칩에서 조정 배지의 20 %로 자극 구강 섬유 아세포에서 NOX4과 PRG4의 전형적인 유전자 발현.
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Discussion
뼈 에어컨 매체는 골 재생의 초기 단계 동안 뼈 이식의 공개 활동을 반영한다. 여기에 설명 된 프로토콜이 골 재생에 관여하는 세포의 다른 유형의 반응을 연구하기 위해 적응 될 수있다. 또한, 프로토콜 처리 된 뼈 또는 뼈 충전제로부터의 조건화 배지를 제조 할 수있다. 다양한 네이티브 및 처리 뼈에서 방출 요인 : 방법을 수행하고 간단한 개념에 의존하기 쉽다. 방법 BCM을 이해하는 것은 중간 엽 세포가 이식 통합 및 골자가 이식의 속성에 대한 자세한 내용을 보려면하는 데 도움이 될 수 있습니다에 영향을줍니다. 우리는 또한 세 가지 주요 계통으로 증식, 이동 및 분화에, 중간 엽 세포의 유전자 발현에 네이티브 11, 15 및 14, 20에서 처리 된 뼈 수득 BCM의 영향에 대한 지식을 축적이 개념에 근거; 조골 세포, 지방 세포와 연골 세포 (11). BCM 또한 TA에 용량을 조사 하였다파골 세포 (13)의 변조에 대해, 예를 들어 조혈 세포를 rget. 많은 잠재적 표적 세포는 체외에서 BCM에 응답을 기다리고 있습니다, 여기에 제시된 프로토콜은이 연구를위한 입문서 역할을 할 수 있습니다.
제시된 프로토콜은 또한 더 BCM은 중간 엽 세포에서 특히 TGF-β 조절 유전자를 활성화하는 분자 메커니즘을 나타 내기 위해 애니메이션을한다. 예를 들어, 내가 SB431542을 길항제 TGF-β 수용체 유전자 패널 ADM의 발현에 BCM의 효과를 차단, IL-11, NOX4, PRG4 및 PTX3 11, 15. 흥미롭게도, 알칼리 포스 파타 아제 및 IL33 다른 아직 알 수없는 경로는 BCM에 의해 규제되는 제안 SB431542 11, 15로 역전되지 않았다. 또 다른 의문은 BCM의 분자가 세포 반응에 대한 책임있는 무엇입니까? BCM은 TGF-β가 포함되어 있지만, 복잡한 세포 반응 (10, 11)을 설명하지 않습니다이다. 에 게다가셀룰러 측면을 시험관, 전체 문제는 남아있다 : 어느로 골 재생의 생체 과정에 영향을 미칠, BCM에 의해 반영 뼈 이식의 공개 활동을 수행 확장? 생물 검정에서 프로토콜과 데이터는이 방향에서 연구를 소개한다.
이 프로토콜은 한계가있다. BCM은 완전히 때문에 기증자 및 수확 기술 사이의 변화의 표준화 할 수 없습니다. 또한, 생체에 존재하는 효소 조성물 또는 BCM의 활동에 영향을 미칠 수있는 방법을 알 수없는 남아있다. 앞으로의 연구는 예를 들면, 수확 기술의 BCM "생물학적 활성"에 미치는 영향에 집중한다. BCM의 조성에 골 세포의 역할은 또한 구체적으로 연구되어야한다. BCM은 sclerostin, 골 세포 (12)에 의해 거의 독점적으로 발표 한 분자가 포함되어 있습니다. 제한하지만, 연구의 다음 단계에 대한 영감을 제공합니다. 심지어 BCM과 연구의 임상 적 관련성은 HY 유지하지만pothetical, 우리의 프로토콜은 뼈 이식은, 네이티브 또는 가공 후 하나가, "생물학적 활성"을 출시하는 오랜 개념을 지원합니다. 체외에서 세포에 영향을 미칠 BCM 방법을 이해하는 것은 아마도 골자가 이식은 생체 내에서 작동하는 방법을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다. 조르디 Caballé - 세라노는 치과 연구 및 교육, 바젤, 스위스의 재단에서 장학금을 받았다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pig Mandibles | Local bucher | ||
| Bone Scraper | Hu-Friedy | PPBUSE2/36 | |
| Antibiotics & Antimicotics | All life Technologies | 15240-062 | |
| Collagen Membranes (Bio-Gide) | Geistlich | ||
| Fetal Calf Serum | Invitrogen Corporation | 16030074 | |
| DMEM | Invitrogen Corporation | 21885-025 | |
High Pure RNA Isolation Kit |
Roche | 11828665001 | |
| Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit | Roche | 4379012001 | |
| Primers | Microsynth | ||
| SYBR Green (for Q-RT-PCR) | Roche | 4673484001 | |
| PBS | Roche | 11666789001 |
References
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