Summary
Vi beskriver her hvordan du kan forberede bein kondisjonerte medium (BCM) og teste sin aktivitet in vitro.
Abstract
Autologe bein grafts er mye brukt i muntlig og maxillofacial kirurgi, ortopedi og traumatologi. Autologe bein grafts ikke bare erstatte manglende bein, de støtter også den komplekse prosessen med bein regenerasjon. Denne gunstige oppførselen autografts er knyttet til de tre kjennetegn: osteoconductivity, osteogenicity, og osteoinductivity. Det er imidlertid et annet aspekt: benimplantater frigi en myriade av molekyler, inkludert vekstfaktorer, som kan målrette mesenchymale celler involvert i benregenerering. De parakrine egenskaper av benimplantater kan studeres in vitro ved anvendelse av ben-kondisjonert medium (BCM). Her presenterer vi en protokoll om hvordan å forberede bein kondisjonerte medium fra mors gris corticalbenet, og bein som gjennomgikk termisk prosessering eller demineralization. Celler kan bli direkte utsatt for BCM eller sådd ut på biomaterialer, såsom kollagen membraner, som tidligere fuktet med BCM. Vi gir eksempler for in vitro bioassays med mesenchymale celler for ekspresjon av TGF-β regulerte gener. De presenterte protokoller bør oppmuntre til videre avsløre parakrine virkningene av bein grafts under benregenerering og åpne en bane for translasjonell forskning i det brede feltet av rekonstruktiv kirurgi.
Introduction
Autologt ben er mye brukt til å bygge bro feil som oppstod som følge av misdannelse, resective kirurgi, rekonstruktiv traume kirurgi, og før implantatet 1,2. Å forstå de biologiske prinsippene for hvordan benimplantater støtte prosessen av graft konsolidering er ikke bare nøkkelen til å forstå hvorfor autografts anses å være gullstandarden i rekonstruktiv kirurgi, er det også bionic den forbedrede utforming av bein substitutter 3. Likevel er pode konsolidering raskere med autolog bein i forhold til bein erstatter 4,5. Således er det viktig å avdekke de molekylære og cellulære mekanismer som gjør autologt ben så effektive for å støtte benregenerering.
Det er tre lærebok kjennetegn ved autografts som anses for å støtte den konsolideringsprosessen 6,7. Først autolog bein er osteoconductive, og gir veiledning for den nydannede benet til å vokseinn i defekten. Dernest er autolog bein osteogent, noe som betyr at den inneholder mesenchymale celler som kan differensiere til osteoblaster 8. Tredje, autolog bein er osteoinduktivt som vekstfaktorer som benmorfogene proteiner entombed i matrisen kan starte prosessen med endochondral eller intramembranøse beindannelse 9. Det er et annet aspekt: nylagde bein chips holde en parakrine funksjon basert på in vitro observasjoner med "bein kondisjonerte medium" 10-15. Også virkningen av myelopoiesis bør nevnes 16. En tilsvarende begrepet "demineralisert benmatrise kondisjonerte medium" var allerede skapt i 1996 og støtter den generelle begrepet en parakrine funksjon av bein, selv når behandles av demineralization 17. For vårt formål, kan BCM fremstilles av fersk gris underkjever 10,11. Proteomic analyser av BCM avslørte den komplekse sammensetning, inkludert vekst faktumORS og bestanddeler av den ekstracellulære matrise 10, også utvide eksisterende kunnskap på proteasome av hele bein 18,19. Således bør BCM reflektere den frigitte aktivitet av forskjellige modifikasjoner av benimplantater in vitro.
Hva skjer når mesenchymalceller, for eksempel de isolert fra bein chips eller fra oral bløtvev, er utsatt til BCM? In vitro, reduserer BCM osteogen og adipogenic differensiering, og provoserer en sterk økning av IL11 uttrykk 11. Genome bred microarray avslørte flere gener som skal uttrykkes differensielt i mesenchymale celler i respons til BCM. Blant disse genene er adrenomedullin (ADM), IL11, IL33, NADPH oksidase 4 (NOX4), proteoglycan 4 (PRG4, eller lubricin) og pentraxin 3 (PTX3) 15. BCM hentet fra autoklaverte bein chips mislyktes i å endre uttrykket av de respektive genene 14. BCM fra bein chips som gjennomgikk pasteurisering og frysing var i stand til åendre genuttrykk 14. Også kondisjonert medium demineralisert benmatriks (DBM-CM) endrer ekspresjonen av TGF-β-regulerte gener 20. Interessant, kollagen sperre som brukes til å skjerme bein chips fra omkringliggende bløtvev 21,22, adsorbert de deler av BCM som er ansvarlig for endringer i genuttrykk 23. BCM forskning kan utvides til andre celletyper som er involvert i benregenerering som ben-resorberende osteoklaster og endotelceller, for å nevne noen. Totalt sett samler in vitro data gir det vitenskapelige grunnlaget for utformingen av en preklinisk studie.
Denne protokoll er todelt: For det første viser det hvordan å forberede BCM. For det andre viser hvordan du kan teste sin biologiske aktivitet basert på mesenchymale celler in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. BCM Forberedelse
- Skaff gris underkjever fra den lokale slakteren så fersk som mulig. Plasser munndelene på et fast underlag og slipper en full tykkelse klaff betaler spesiell oppmerksomhet til ikke å la noen bløtvev eller periosteum festet til beinet. Jobbe i et rent miljø uten å måtte arbeide under flyt panseret.
- Når en full tykkelse klaff er sluppet, bruke et bein skrape til å høste bein chips fra bukkal side. Vær oppmerksom på at beinet skraper må være skarp. Håndtere fast benet skraper og med lange bevegelser samle bein. Kast bein chips mindre at 1mm.
- For å opprettholde naturlig ben chips, plasserer direkte bein chips i plast retter av 10cm diameter med Dulbeccos Modified Eagle medium (DMEM) supplert med en% antibiotika og antimykotika ikke la dem tørke ut.
- For å evaluere virkningen av varmebehandling, for å underlagt bein chips pasteurisering i 30 minutter ved 80 ° C ellerautoklav i 20 minutter ved 121 ° C.
- For å evaluere virkningen av demineralisering og rist bein chips i 1 M HCL i 4-6 timer ved 4 ° C og vaskes gjentatte ganger med kulturmediet inntil pH-verdien er nøytral.
- Plasser en total av 5 g av bein chips per 10 ml frisk DMEM supplementert med 1% antibiotika og antimykotika i en ny plastskål.
- Legg plast retter i en fuktig atmosfære ved 37 ° C i 24 timer. Deretter innhøsting BCM. Sentrifuger BCM ved 200 xg i 10 minutter for å fjerne rester, filtrere det sterilt (0,2 nm), og holder alikvoter frosset ved -80 ° C.
- Tine BCM lager umiddelbart før bruk og unngå gjentatte sykluser av frysing og opptining.
- For angitte eksperimenter, suge kollagen membraner med BCM eller serumfritt medium i 1 time ved RT. Vask kraftig membraner med PBS og plassere dem i 96 brønners plater. Våte membraner er sådd med celler.
- BCM fremstillingsprosessen er oppsummert i figur 1.
2. bioassays Basert på mesenchymalceller
- Seed humane mesenchymale celler (for eksempel benceller, gingivale og periodontale ligament fibroblaster) i en 12-brønns plate med en konsentrasjon på 30.000 celler / cm2. Å frø cellene bruke vekstmedium bestående av DMEM, 10% føtalt kalveserum og antibiotika. La cellene feste til platen O / N.
- Kast kulturmediet og vaske cellene med forvarmet PBS ved 37 ° C. Stimulere cellene ved tilsetning av forvarmet serumfritt kulturmedium, med og uten 20% BCM. Plassere cellene i en fuktig atmosfære ved 37 ° C i 24 timer.
- Kast dyrkingsmedium, skyll cellene med forvarmet PBS og trekke ut RNA i henhold til ønsket protokoll.
- Juster konsentrasjonen av RNA for å ha den samme mengden av RNA i hver prøve. Forbered cDNA og utføre en QRT-PCR for å analysere utvalgte gener ved å bruke primere som er vist i tabell 1.
MERK: Dette er fortynninger av hver komponent: 2x SYBR Green, 20x primer fremover, 20x primer omvendt, 5x sterilt DD vann, 5x cDNA. QRT-PCR blir utført i 40 sykluser på 95 ° C i 15 sekunder og 60 ° C 1 min. - Beregn de relative uttrykk nivåer ved å normal til husholdningsgenet GAPDH bruke Δ (ΔCt) metode der ΔCT er CT mål - CT GAPDH og Δ (ΔCT) er ΔCT stimulert - ΔCT kontroll.
- Etter denne kvalitetskontroll, legge BCM til kulturmediet for å stimulere alle typer celler, inkludert mesenchymale celler, hematopoietiske celler eller endotelceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bone Betinget Medium er tilberedt av ferske svin bein chips. Generell oversikt over prosessen for å forberede BCM og å bruke biomaterialer i kombinasjon med BCM er vist i figur 1 og figur 2 hhv. Under BCM fremstillingen, er det viktig å få store bein chips med lange bevegelser som korte bevegelser eller meget små bein brikker kan påvirke kvaliteten av den endelige BCM. Kvaliteten på BCM kan kontrolleres ved å analysere genuttrykk av BCM mål gener: ADM, PTX3, IL11, IL33, NOX4 og PRG4 (figur 3). ADM og PTX3 er nedregulert ned til 0,4 ganger og IL11, IL33, NOX4 og PRG4 kan være oppregulert til 200 ganger. Hvis muntlig fibroblaster ikke uttrykke BCM målgener på nivået vist, sjekke helsen til cellene eller forberede ny BCM fra nye underkjever. Figur 4 viser typiske resultater fra uttrykket av BCM mål gener i muntlig fibroblaster seeded på en kollagen barriere membran. Orale fibroblaster stimulert med 20% av kondisjonert medium fra pasteurisert bein chips, og kondisjonert medium fra demineralisert ben chips, viste tilsvarende genekspresjon i celler stimulert med BCM (tabell 2 og tabell 3). Men genuttrykk av muntlige fibroblaster utsatt for kondisjonert medium fra steriliserte (121 ° C) bein chips, var sammenlignbar med un-stimulert kontroller.
Figur 1. Oppsummering av prosessen som brukes til å forberede bein kondisjonerte medium ferske grisekjever. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Oversiktav bioanalyser basert på mesenchymale celler med BCM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Gene uttrykk for bein kondisjonerte medium mål gener i muntlig fibroblaster. Typiske resultatene av seks gener som brukes til å kontrollere kvaliteten på BCM. Gener ADM og PTX3 er nedregulert (A) og IL11, IL33, NOX4, PRG4 er oppregulert (B). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Gene expression of bone-conditioned mellom mål gener i muntlige fibroblaster seeded på en kollagen barriere membran. Typiske resultater av seks gener som brukes til å kontrollere kvaliteten på BCM. Gener ADM og PTX3 er nedregulert (A) og IL11, NOX4, PRG4 er oppregulert (B). Avhengig av biomateriale som brukes, kan absorpsjonen av vekstfaktorer forskjellig. Kollagen membraner ikke klarte å absorbere faktorer som styrer IL33 uttrykk, derfor IL33 uttrykk ikke er regulert i denne innstillingen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Forkortelse | Primer frem | Primer revers |
| GAPDH | AGCCACATCGCTCAGACAC | GCCCAATACGACCAAATCC |
| ADM | GGACATGAAGGGTGCCTCTC | TGTTCATGCTCTGGCGGTAG |
| IL11 | TGCACCTGACACTTGACTGG | AGTCTTCAGCAGCAGCAGTC |
| IL33 | TCAGGTGACGGTGTTGATGG | GGAGCTCCACAGAGTGTTCC |
| NOX4 | TCTTGGCTTACCTCCGAGGA | CTCCTGGTTCTCCTGCTTGG |
| PRG4 | CGACGCCCAATGTAAGAAGT | GGTGATGTGGGATTATGCACT |
| PTX3 | TGTATGTGAATTTGGACAACGAA | CATTCCGAGTGCTCCTGAC |
Tabell 1: Primer sekvens av de seks genene brukt.
| Gener | 80 ° C Mean ± SD | 121 ° C Mean ± SD |
| ADM | 0.2 ± 0.1 | 1.1 ± 0.2 |
| PTX3 | 0,1 ± 0,1 | 0.9 ± 0.2 |
| IL11 | 20 ± 10 | 1.5 ± 1 |
| IL33 | 15 ± 5 | 1.2 ± 4 |
| NOX4 | 35 ± 15 | 2 ± 1 |
| PRG4 | 40 ± 10 | 1.8 ± 1 |
Tabell 2: Typisk genuttrykk av ADM, PTX3, IL11, IL33, NOX4 og PRG4 i muntlig fibroblaster stimulert med 20% av kondisjonert medium fra varmebehandlede bein chips.
| Gener | Gjennomsnitt ± SD |
| ADM | 0,1 ± 0,1 |
| PTX3 | |
| IL11 | 15 ± 5 |
| IL33 | 20 ± 10 |
| NOX4 | 60 ± 15 |
| PRG4 | 50 ± 20 |
Tabell 3: Typisk genekspresjon av ADM, PTX3, IL11, IL33, NOX4 og PRG4 i muntlig fibroblaster stimulert med 20% av kondisjonert medium fra demineralisert bein chips.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bone kondisjonerte medium reflekterer utgitt aktivitet av bein grafts i den tidlige fasen av bein regenerasjon. Protokollen er beskrevet her kan tilpasses for å studere responsen av forskjellige typer celler som er involvert i benregenerering. Videre kan protokollen anvendes til fremstilling av kondisjonert medium fra bearbeidet bein eller ben fyllstoffer. Metodene er enkle å utføre og stole på et enkelt konsept: de faktorene som frigjøres fra ulike innfødte og bearbeidet bein. Forstå hvordan BCM påvirker mesenchymalceller kan bidra til å lære mer om pode konsolidering og egenskaper til bein autografts. Basert på dette konseptet vi har akkumulert kunnskap om virkningen av BCM oppnådd fra opprinnelige 11,15 og behandlet ben 14,20 på genekspresjon av mesenchymale celler, men også på proliferasjon, migrering og differensiering i de tre viktigste linjene; osteoblaster, adipocytter og chondrocytter 11. BCM ble også undersøkt for sin evne til å target hematopoetiske celler, for eksempel med hensyn til modulering av osteoclastogenesis 13. Mange potensielle målceller venter på å svare på BCM in vitro, kan protokollene som presenteres her, tjene som en primer for denne forskningen.
De presenterte protokollene bør også animere for ytterligere å vise de molekylære mekanismene for hvordan BCM aktiveres spesielt TGF-β-regulerte gener i mesenchymale celler. For eksempel kan TGF-β reseptor antagonist SB431542 blokkerte virkningen av BCM på ekspresjon av genet panel ADM, IL-11, NOX4, PRG4, og PTX3 11,15. Interessant, alkalisk fosfatase og IL33 ble ikke reversert av SB431542 11,15 som tyder på at andre hittil ukjente veier er regulert av BCM. Et annet åpent spørsmål er hva som er molekylene i BCM å være ansvarlig for den cellulære responsen? BCM inneholder TGF-β, men er ikke forklare komplekse cellulære reaksjoner 10,11. Foruten ivitro cellulære aspekter, forblir den generelle spørsmål: i hvilken grad gjør utgitt aktivitet av bein grafts som reflekteres av BCM, ha en innvirkning på in vivo prosessen med benregenerering? Protokollene og data fra bioanalyser bør innføre forskning i denne retningen.
Denne protokollen har begrensninger. BCM kan ikke fullt ut standardisert på grunn av variasjoner mellom givere og innhøstingsteknikker. Dessuten, hvor enzymer som er tilstede in vivo kan påvirke sammensetningen eller aktivitet av BCM fortsatt ukjent. Fremtidige studier bør for eksempel fokusere på hvordan innhøstingsteknikker påvirker "biologisk aktivitet" av BCM. Rollen osteocytter på sammensetningen av BCM bør også bli studert i detalj. BCM inneholder sclerostin, et molekyl utgitt nesten utelukkende av osteocytter 12. Begrensninger imidlertid gi inspirasjon til de neste trinnene i forskning. Selv om den kliniske relevansen av forskning med BCM fortsatt hypothetical, våre protokoller støtter den langvarige konsept som bein grafts, enten naturlig eller etter behandling, slipper en "biologisk aktivitet". Forstå hvordan bcm påvirke celler in vitro kan formodentlig bidra til å forstå hvordan bein autografts vil fungere in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre. Jordi Caballé-Serrano mottok et stipend fra Foundation of Dental Research and Education, Basel, Sveits.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pig Mandibles | Local bucher | ||
| Bone Scraper | Hu-Friedy | PPBUSE2/36 | |
| Antibiotics & Antimicotics | All life Technologies | 15240-062 | |
| Collagen Membranes (Bio-Gide) | Geistlich | ||
| Fetal Calf Serum | Invitrogen Corporation | 16030074 | |
| DMEM | Invitrogen Corporation | 21885-025 | |
High Pure RNA Isolation Kit |
Roche | 11828665001 | |
| Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit | Roche | 4379012001 | |
| Primers | Microsynth | ||
| SYBR Green (for Q-RT-PCR) | Roche | 4673484001 | |
| PBS | Roche | 11666789001 |
References
- Buser, D. Long-term Stability of Early Implant Placement with Contour Augmentation. Journal of dental research. , (2013).
- Chiapasco, M., Casentini, P., Bone Zaniboni, M. augmentation procedures in implant dentistry. The International journal of oral & maxillofacial implants. 24 Suppl. , 237-259 (2009).
- Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Bone Tsiridis, E. substitutes: an update. Injury. 36, Suppl 3. S20-S27. , (2005).
- Jensen, S. S., Broggini, N., Hjorting-Hansen, E., Schenk, R., Bone Buser, D. healing and graft resorption of autograft, anorganic bovine bone and beta-tricalcium phosphate. A histologic and histomorphometric study in the mandibles of minipigs. Clinical oral implants research. 17, 237-243 (2006).
- Jensen, S. S. Evaluation of a novel biphasic calcium phosphate in standardized bone defects: a histologic and histomorphometric study in the mandibles of minipigs. Clinical oral implants research. 18, 752-760 (2007).
- Grabowski, G., Bone Cornett, C. A. graft and bone graft substitutes in spine surgery: current concepts and controversies. The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 21, 51-60 (2013).
- Khan, S. N. The biology of bone grafting. The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 13, 77-86 (2005).
- Bohr, H., Ravn, H. O., Werner, H. The osteogenic effect of bone transplants in rabbits. The Journal of bone and joint surgery. British. 50, 866-873 (1968).
- Bone Urist, M. R. formation by autoinduction. Science. 150, 893-899 (1965).
- Caballé-Serrano, J. D., Buser, D., Gruber, R. Proteomic analysis of porcine bone conditioned medium. The International journal of oral & maxillofacial implants. , (2014).
- Peng, J. Bone-Conditioned Medium Inhibits Osteogenic and Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Cells In Vitro. Clinical implant dentistry and related research. , (2014).
- Brolese, E., Buser, D., Kuchler, U., Schaller, B., Gruber, R. Human bone chips release of sclerostin and FGF-23 into the culture medium: an in vitro pilot study. Clinical oral implants research. , (2014).
- Caballé-Serrano, J., Bosshardt, D. D., Gargallo-Albiol, J., Buser, D., Bone Gruber, R. conditioned medium enhances osteoclastogenesis in murine bone marrow cultures. Clin Oral Impl Res; in. Int J Oral Maxillofac Surg. , (2015).
- Zimmermann, M. Bone-conditioned medium changes gene expression in bone-derived fibroblasts). IJOMI accepted. , (2014).
- Fulzele, K. Myelopoiesis is regulated by osteocytes through Gsalpha-dependent signaling. Blood. 121, 930-939 (2013).
- Becerra, J., Andrades, J. A., Ertl, D. C., Sorgente, N., Nimni, M. E. Demineralized bone matrix mediates differentiation of bone marrow stromal cells in vitro: effect of age of cell donor. Journal of. 11, 1703-1714 (1996).
- Kupcova Skalnikova,, H, Proteomic techniques for characterisation of mesenchymal stem cell secretome. Biochimie. , (2013).
- Romanello, M. Osteoblastic cell secretome: A novel role for progranulin during risedronate treatment. , Bone. (2013).
- Schuldt Filho,, G, Conditioned medium of demineralized bone matrix activates TGF-β signaling pathways in mesenchymal cells in vitro. J Cranio Maxill Surg. , (2015).
- Buser, D., Chen, S. T., Weber, H. P., Belser, U. C. Early implant placement following single-tooth extraction in the esthetic zone: biologic rationale and surgical procedures). The International journal of periodontics & restorative dentistry. 28, 441-451 (2008).
- Stoecklin-Wasmer, C. Absorbable collagen membranes for periodontal regeneration: a systematic review. Journal of dental research. 92, progress. 773-781 (2013).
