Summary
Мы описываем здесь, как подготовить кости кондиционером среду (BCM) и проверить его деятельность в пробирке.
Abstract
Аутологичные костные трансплантаты широко используется в челюстно-лицевой хирургии, ортопедии, травматологии и. Аутологичные костные трансплантаты не только заменить отсутствующий кости, они также поддерживают сложный процесс регенерации костной ткани. Это благоприятное поведение аутотрансплантатов объясняется тремя характеристиками: Остеокондуктивность, osteogenicity и остеоиндуктивность. Тем не менее, есть еще один аспект: костные трансплантаты выпустить множество молекул, в том числе факторов роста, которые могут предназначенных мезенхимных клеток, участвующих в регенерации кости. Паракринной свойства костных трансплантатов могут быть изучены в пробирке с использованием костно-кондиционированной среды (БМВ). Здесь мы приводим протокол о том, как подготовить среду кости кондиционером из родного свинья кортикальной кости, и кости, что подвергся термической обработке или деминерализации. Клетки могут быть непосредственно подвергаются BCM или высевали биоматериалов, таких как коллаген мембраны, ранее пропитанных BCM. Приведем примеры для в пробирке bioassaYS с мезенхимных клеток на экспрессию TGF-β регулируемых генов. Представленные протоколы должны поощрять дальнейшее выявить паракринные эффекты костные трансплантаты во время регенерации костной и открыть путь для трансляционных исследований в широкой области реконструктивной хирургии.
Introduction
Аутокостью широко используется для преодоления недостатков, которые произошли в результате пороков развития, resective хирургии, реконструктивной хирургии травмы и до имплантации 1,2. Понимание биологических принципов, как кости трансплантаты поддерживает процесс консолидации трансплантата является не только ключом к пониманию, почему аутографты считаются золотым стандартом в реконструктивной хирургии, это также бионической улучшенной конструкции костных заменителей 3. Тем не менее, консолидация трансплантата быстрее аутокостью сравнению с костной заменяет 4,5. Таким образом, крайне важно выявить молекулярные и клеточные механизмы, которые делают аутокостью так эффективной поддержки регенерации костной ткани.
Есть три учебника характеристики аутотрансплантатов, считающихся поддерживает процесс консолидации 6,7. Во-первых, аутологичных кости остеокондуктивным, обеспечивая руководство для вновь образованной кости растив дефект. Во-вторых, аутологичной кости остеогенная, что означает, что она содержит мезенхимальные клетки, которые могут дифференцироваться в остеобласты 8. В-третьих, аутологичных кости остеоиндуктивный, как факторы роста, такие как морфогенетические белки кости погребенных в матрице может инициировать процесс эндохондральных или даже Intramembranous формирования костной 9. Существует еще один аспект: свежеприготовленные чипсы кости провести паракринную функцию, основанную на наблюдениях в пробирке с "средней кости кондиционером" 10-15. Кроме воздействие миелопоэза Следует отметить, 16. Аналогичный термин "матрица с кондиционером среднего деминерализованной кости" уже придуман в 1996 году и поддерживает общую концепцию паракринным функции костей, даже при обработке деминерализации 17. Для наших целей, BCM могут быть получены из свежего свиньи Мандибулы 10,11. Протеомные анализы показали, BCM сложный состав, в том числе то, ростаПРС и компоненты внеклеточного матрикса 10, также расширяет существующие знания на протеасоме всей кости 18,19. Таким образом, BCM должен отражать выпущенный активность различных модификаций костные трансплантаты в пробирке.
Что происходит, когда мезенхимальные клетки, например, выделенные из костной стружки или из мягкой ткани полости рта, подвергаются BCM? В пробирке, BCM уменьшает остеогенной дифференцировки и Adipogenic, и провоцирует сильное увеличение экспрессии IL11 11. Геном шириной микрочипов показали несколько генов, которые будут по-разному выражается в мезенхимальных клеток в ответ на ВСМ. Среди этих генов адреномедуллин (АДМ), IL11, IL33, НАДФН-оксидазы (4 NOX4), протеогликан 4 (PRG4 или лубрицином) и pentraxin 3 (PTX3) 15. BCM получены из автоклавного фишек кости не удалось изменить выражение соответствующих генов 14. BCM от кости чипов, которые прошли пастеризацию и замораживание удалосьизменить экспрессию генов 14. Также кондиционером среднего деминерализованной костной матрицы (ДКМ-CM) изменяет экспрессию TGF-β-регулируемых генов 20. Интересно, что коллаген барьерные Мембраны, используемые для защиты кусочков кости от окружающих мягких тканей 21,22, адсорбированный те части ВСМ, которые отвечают за изменений в экспрессии генов 23. BCM исследования могут быть распространены на другие типы клеток, участвующих в регенерации кости, такие как кости резорбции остеокластов и эндотелиальных клеток, чтобы назвать несколько. В целом, данные накапливаются в пробирке обеспечить научную основу для дизайна доклинических исследований.
Настоящий Протокол два: во-первых, он показывает, как подготовить BCM. Во-вторых, она показывает, как проверить его биологическую активность на основе мезенхимальных клеток в пробирке.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка BCM
- Получить свинью челюсти от местного мясника, как свежие, как это возможно. Поместите челюсти на твердую поверхность и отпустите всю толщину лоскута уделяя особое внимание, чтобы не оставить никакого мягкие ткани или надкостницы прикреплены к кости. Работа в чистой окружающей среде, без необходимости работать под капотом потока.
- После того, как всю толщину лоскута освобожден, использовать кости скребок для уборки костных чипсов из ротовой стороне. Пожалуйста, обратите внимание, что кости скребок должен быть острым. Ручка твердо кости скребок и с длинными движения собрать кости. Откажитесь кости чипы меньше 1 мм, что.
- Для поддержания родные фишки кости, поместить непосредственно костных чипов в пластиковых блюд 10см диаметром со средой Игла в модификации Игла (DMEM) с добавлением 1% антибиотиков и противогрибковых средств не давая им высыхать.
- Чтобы оценить влияние термической обработки, подлежащие костной стружкой пастеризации в течение 30 мин при 80 ° С илиавтоклаве в течение 20 мин при 121 ° С.
- Чтобы оценить влияние деминерализации, встряхнуть костной стружки в 1 М HCl в течение 4-6 ч при 4 ° С и мыть раз культуральной средой до тех пор, пока рН не является нейтральным.
- Поместите в общей сложности 5 г костной стружкой в 10 мл свежей среды DMEM, дополненной 1% антибиотиков и противогрибковых средств в новую пластиковую чашку.
- Поместите пластиковую посуду в увлажненной атмосфере при 37 ° С в течение 24 ч. Тогда, урожай BCM. Центрифуга ВСМ при 200g в течение 10 мин для удаления мусора, фильтровать стерильной (0,2 нм), и держать аликвоты замораживали при -80 ° С.
- Оттепель BCM акции непосредственно перед использованием и во избежание повторных циклов замораживания и оттаивания.
- Для указанных экспериментов, впитать коллагеновые мембраны с ВСМ или бессывороточной среде в течение 1 часа при комнатной температуре. Вымойте энергично мембраны с PBS и поместить их в 96-луночных планшетах. Влажные мембраны клеток высевали с.
- Процесс подготовки ВСМ приводится на рисунке 1.
2. Биопробы на основе мезенхимальных клеток
- Семенной человека мезенхимальные клетки (например костных клеток, десны и пародонта связок фибробластов) в 12-луночного планшета с концентрацией 30000 клеток / см 2. Чтобы отобрать клетки используют ростовой среды, состоящей из DMEM, 10% фетальной телячьей сыворотки и антибиотики. Пусть клетки прикрепляются к пластина O / N.
- Отменить культуральной среды и промыть клетки с подогретого PBS при 37 ° С. Стимулирование клеток путем добавления подогретого бессывороточной культуральной среды с и без 20% ВСМ. Поместите клетки в увлажненной атмосфере при 37 ° С в течение 24 ч.
- Откажитесь от культуральной среды, промыть клетки с подогретого PBS и извлечь РНК в соответствии с вашим предпочтительного протокола.
- Регулировка концентрации РНК, чтобы иметь то же самое количество РНК в каждом образце. Готовят кДНК и выполнить Qrt-ПЦР для анализа выбранных генов с использованием праймеров, показанных в таблице 1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти разведения каждого компонента: 2x SYBR зеленый, 20x грунт вперед, 20x грунт наоборот, 5x стерильной воды ДД, 5x кДНК. Qrt-ПЦР проводили в 40 циклов 95 ° С 15 сек и 60 ° С 1 мин. - Рассчитать относительные уровни экспрессии по нормализации в генной уборка GAPDH с использованием метода Δ (& Delta; CТ), где & Delta; CТ является целевой КТ - КТ GAPDH и Δ (& Delta; CТ) является & Delta; CТ стимулировали - & Delta; CТ управления.
- После этого контроль качества, чтобы добавить ВСМ культуральной среды, чтобы стимулировать все типы клеток, включая мезенхимальные клетки, гемопоэтические клетки или эндотелиальные клетки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Костный кондиционированной среды получают из свежих свиных костной стружкой. Общий обзор процесса подготовить ВСМ и использовать биоматериалов в комбинации с БМВ показано на фиг.1 и 2, соответственно. Во время подготовки ВСМ, важно, чтобы получить большие фишки кости с длинными движений, как коротких движений или очень маленьких чипов кости может повлиять на качество конечного ВСМ. Качество BCM можно управлять с помощью анализа экспрессии гена BCM генов-мишеней: ADM, РТХ3, IL11, IL33, NOX4 и PRG4 (рис 3). АДМ и РТХ3 которые вниз регулируется до 0,4 раза и IL11, IL33, NOX4 и PRG4 может быть до-регулируется до 200 раз. Если устные фибробласты не выражают BCM целевых генов на уровне показанном проверить здоровье клеток или подготовить новый BCM от новых челюстями. Рисунок 4 представлены типичные результаты из выражения генов-мишеней BCM в устных фибробластов, посеянных на коллаген барьерной мембраной, Пероральные фибробласты стимулировали с 20% кондиционированной среды из пастеризованного костной стружкой и кондиционированной среды от деминерализованных костной стружкой, показали одинаковую экспрессию генов в клетках, стимулированных ВСМ (таблицах 2 и 3). Тем не менее, экспрессия генов устных фибробластов подвергается кондиционированной среды от стерилизованных (121 ° С) костной стружки, была сопоставима с ООН-стимулировали управления.
Рисунок 1. Резюме процессе подготовки кости кондиционером среды от свежих свиных челюстями. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Резюмеиз биопроб на основе мезенхимальных клеток с БСМ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Экспрессия генов среднего генов-мишеней костей кондиционером в устной фибробластов. Типичные результаты шести генов, используемых для контроля качества BCM. Гены ADM и РТХ3 которые подавляются () и IL11, IL33, NOX4, PRG4 которые активируются (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Экспрессия генов костного conditioneD средний гены-мишени в устных фибробластов, посеянных на коллаген барьерной мембраной. Типичные результаты шести генов, используемых для контроля качества BCM. Гены АДМ и РТХ3 которые подавляются () и IL11, NOX4, PRG4 которые активируются (B). В зависимости от используемого биоматериала, поглощение факторов роста может отличаться. Коллагеновые оболочки удалось поглотить факторов, которые контролируют IL33 выражение, поэтому выражение IL33 не регулируется в этом параметре. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Сокращение | Грунтовка вперед | Грунтовка обратная |
| GAPDH | AGCCACATCGCTCAGACAC | GCCCAATACGACCAAATCC |
| АДМ | GGACATGAAGGGTGCCTCTC | TGTTCATGCTCTGGCGGTAG |
| IL11 | TGCACCTGACACTTGACTGG | AGTCTTCAGCAGCAGCAGTC |
| IL33 | TCAGGTGACGGTGTTGATGG | GGAGCTCCACAGAGTGTTCC |
| NOX4 | TCTTGGCTTACCTCCGAGGA | CTCCTGGTTCTCCTGCTTGG |
| PRG4 | CGACGCCCAATGTAAGAAGT | GGTGATGTGGGATTATGCACT |
| РТХ3 | TGTATGTGAATTTGGACAACGAA | CATTCCGAGTGCTCCTGAC |
Таблица 1: Праймер последовательности из 6 генов, используемых.
| Гены | 80 ° С ± SD Среднее | 121 ° С Среднее ± SD |
| АДМ | 0,2 ± 0,1 | 1,1 ± 0,2 |
| РТХ3 | 0,1 ± 0,1 | 0,9 ± 0,2 |
| IL11 | 20 ± 10 | 1.5 ± 1 |
| IL33 | 15 ± 5 | 1.2 ± 4 |
| NOX4 | 35 ± 15 | 2 ± 1 |
| PRG4 | 40 ± 10 | 1.8 ± 1 |
Таблица 2: Типичный экспрессии генов ADM, РТХ3, IL11, IL33, NOX4 и PRG4 в оральных фибробластов, стимулированных 20% кондиционированной среды из термообработанных костной стружкой.
| Гены | Средняя ± SD |
| АДМ | 0,1 ± 0,1 |
| РТХ3 | |
| IL11 | 15 ± 5 |
| IL33 | 20 ± 10 |
| NOX4 | 60 ± 15 |
| PRG4 | 50 ± 20 |
Таблица 3: Типичные экспрессии генов ADM, РТХ3, IL11, IL33, NOX4 и PRG4 в оральных фибробластов, стимулированных 20% кондиционированной среды от деминерализованных костной стружкой.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Кость кондиционером среднего отражает выпущен деятельность костных имплантатов во время ранних стадиях регенерации костной ткани. Протокол, описанный здесь, может быть адаптирован для изучения реакции различных типов клеток, участвующих в регенерации кости. Кроме того, протокол может быть использован для получения кондиционированной среды от обрабатываемых кости или костного наполнителей. Методы просты для выполнения и полагаться на простой концепции: факторы, освобожденных из различных родной и обработанной кости. Понимание того, как BCM влияет мезенхимальные клетки могут помочь, чтобы узнать больше о консолидации трансплантата и свойствах костной аутотрансплантатов. На основе этой концепции мы накопили знания о влиянии BCM, полученной из родного 11,15 и 14,20 обработанной кости на экспрессию генов мезенхимальных клеток, но также на пролиферацию, миграцию и дифференцировку в трех основных линий; остеобласты, адипоциты и хондроциты 11. BCM также исследовали на его способность к таrget кроветворные клетки, например по отношению к модуляции остеокластогенеза 13. Многие потенциальные клетки-мишени ждут, чтобы ответить на ВСМ в пробирке, протоколы, представленные здесь, может служить в качестве праймера для этого исследования.
Представленные протоколы должны также анимировать для дальнейшего выявить молекулярные механизмы, как BCM активизирует особенно TGF-β-регулируется генов в мезенхимальных клеток. Например, TGF-β рецептора I антагонист SB431542 их эффект ВСМ на экспрессию гена панели ADM, ИЛ-11, NOX4, PRG4, и РТХ3 11,15. Интересно, щелочной фосфатазы и IL33 не отменено SB431542 11,15 предполагая, что другие пока неизвестные пути регулируются BCM. Еще открытым остается вопрос, какие молекулы в BCM ответственных за клеточный ответ? BCM содержит TGF-β, но не объясняет сложные клеточные реакции 10,11. Кроме того, в системуЭкстракорпоральное клеточные аспекты, в целом остается вопрос: в какой степени делает выпущен деятельность костных трансплантатов, как это отражается BCM, имеют влияние на в естественных условиях процесс регенерации костной ткани? Протоколы и данные биопроб следует ввести исследования в этом направлении.
Этот протокол имеет свои ограничения. BCM не может быть полностью стандартизированы, потому что вариаций между донорами и методов уборки. Кроме того, как ферментов, присутствующих в естественных условиях может повлиять на состав и активность ВСМ остается неизвестным. Будущие исследования должны, например, сосредоточиться на том, как методы сбора урожая влияет на биологическую активность "" в BCM. Роль остеоцитов о составе BCM также должны быть детально изучены. BCM содержит sclerostin, молекулу выпущенный почти исключительно остеоцитов 12. Ограничения, однако, обеспечить вдохновение для следующих шагов в исследовании. Даже если клиническая значимость исследования с BCM остается HYpothetical, наши протоколы поддерживают давнюю концепцию, что кости трансплантаты, либо родной или после обработки, выпустить "биологическую активность". Понимание того, как BCM воздействуют на клетки в пробирке, вероятно, может помочь понять, как кости аутографты будет работать в естественных условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать. Хорди Кабалье-Серрано получил стипендию от Фонда стоматологических исследований и образования, Базель, Швейцария.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pig Mandibles | Local bucher | ||
| Bone Scraper | Hu-Friedy | PPBUSE2/36 | |
| Antibiotics & Antimicotics | All life Technologies | 15240-062 | |
| Collagen Membranes (Bio-Gide) | Geistlich | ||
| Fetal Calf Serum | Invitrogen Corporation | 16030074 | |
| DMEM | Invitrogen Corporation | 21885-025 | |
High Pure RNA Isolation Kit |
Roche | 11828665001 | |
| Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit | Roche | 4379012001 | |
| Primers | Microsynth | ||
| SYBR Green (for Q-RT-PCR) | Roche | 4673484001 | |
| PBS | Roche | 11666789001 |
References
- Buser, D. Long-term Stability of Early Implant Placement with Contour Augmentation. Journal of dental research. , (2013).
- Chiapasco, M., Casentini, P., Bone Zaniboni, M. augmentation procedures in implant dentistry. The International journal of oral & maxillofacial implants. 24 Suppl. , 237-259 (2009).
- Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Bone Tsiridis, E. substitutes: an update. Injury. 36, Suppl 3. S20-S27. , (2005).
- Jensen, S. S., Broggini, N., Hjorting-Hansen, E., Schenk, R., Bone Buser, D. healing and graft resorption of autograft, anorganic bovine bone and beta-tricalcium phosphate. A histologic and histomorphometric study in the mandibles of minipigs. Clinical oral implants research. 17, 237-243 (2006).
- Jensen, S. S. Evaluation of a novel biphasic calcium phosphate in standardized bone defects: a histologic and histomorphometric study in the mandibles of minipigs. Clinical oral implants research. 18, 752-760 (2007).
- Grabowski, G., Bone Cornett, C. A. graft and bone graft substitutes in spine surgery: current concepts and controversies. The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 21, 51-60 (2013).
- Khan, S. N. The biology of bone grafting. The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 13, 77-86 (2005).
- Bohr, H., Ravn, H. O., Werner, H. The osteogenic effect of bone transplants in rabbits. The Journal of bone and joint surgery. British. 50, 866-873 (1968).
- Bone Urist, M. R. formation by autoinduction. Science. 150, 893-899 (1965).
- Caballé-Serrano, J. D., Buser, D., Gruber, R. Proteomic analysis of porcine bone conditioned medium. The International journal of oral & maxillofacial implants. , (2014).
- Peng, J. Bone-Conditioned Medium Inhibits Osteogenic and Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Cells In Vitro. Clinical implant dentistry and related research. , (2014).
- Brolese, E., Buser, D., Kuchler, U., Schaller, B., Gruber, R. Human bone chips release of sclerostin and FGF-23 into the culture medium: an in vitro pilot study. Clinical oral implants research. , (2014).
- Caballé-Serrano, J., Bosshardt, D. D., Gargallo-Albiol, J., Buser, D., Bone Gruber, R. conditioned medium enhances osteoclastogenesis in murine bone marrow cultures. Clin Oral Impl Res; in. Int J Oral Maxillofac Surg. , (2015).
- Zimmermann, M. Bone-conditioned medium changes gene expression in bone-derived fibroblasts). IJOMI accepted. , (2014).
- Fulzele, K. Myelopoiesis is regulated by osteocytes through Gsalpha-dependent signaling. Blood. 121, 930-939 (2013).
- Becerra, J., Andrades, J. A., Ertl, D. C., Sorgente, N., Nimni, M. E. Demineralized bone matrix mediates differentiation of bone marrow stromal cells in vitro: effect of age of cell donor. Journal of. 11, 1703-1714 (1996).
- Kupcova Skalnikova,, H, Proteomic techniques for characterisation of mesenchymal stem cell secretome. Biochimie. , (2013).
- Romanello, M. Osteoblastic cell secretome: A novel role for progranulin during risedronate treatment. , Bone. (2013).
- Schuldt Filho,, G, Conditioned medium of demineralized bone matrix activates TGF-β signaling pathways in mesenchymal cells in vitro. J Cranio Maxill Surg. , (2015).
- Buser, D., Chen, S. T., Weber, H. P., Belser, U. C. Early implant placement following single-tooth extraction in the esthetic zone: biologic rationale and surgical procedures). The International journal of periodontics & restorative dentistry. 28, 441-451 (2008).
- Stoecklin-Wasmer, C. Absorbable collagen membranes for periodontal regeneration: a systematic review. Journal of dental research. 92, progress. 773-781 (2013).
