Summary
Se describe aquí cómo preparar medio hueso acondicionado (BCM) y probar su actividad in vitro.
Abstract
Injertos óseos autólogos son ampliamente utilizados en la cirugía oral y maxilofacial, ortopedia y traumatología. Injertos óseos autólogos no sólo reemplazan el hueso faltante, también apoyan el complejo proceso de regeneración ósea. Este comportamiento favorable de los autoinjertos se atribuye a las tres características: osteoconductividad, osteogenicidad y osteoinductividad. Sin embargo, hay otro aspecto: Bone injertos de liberar una gran variedad de moléculas, incluyendo factores de crecimiento, que pueden dirigirse a las células mesenquimales implicadas en la regeneración ósea. Las propiedades paracrinos de injertos óseos se pueden estudiar in vitro mediante el uso de medio hueso acondicionado (BCM). Aquí presentamos un protocolo sobre cómo prepararse medio hueso acondicionado de hueso cortical cerdo nativo, y el hueso que sufrió el procesamiento térmico o desmineralización. Las células pueden ser expuestos directamente a BCM o sembradas en biomateriales, tales como membranas de colágeno, previamente remojados con BCM. Damos ejemplos para in vitro bioassays con células mesenquimales en la expresión de genes regulados TGF-β. Los protocolos presentados deben animar a revelar aún más los efectos paracrinos de injertos óseos durante la regeneración ósea y abrir un camino para la investigación traslacional en el amplio campo de la cirugía reconstructiva.
Introduction
El hueso autólogo es ampliamente utilizado para cerrar defectos que se produjeron como consecuencia de la malformación, la cirugía de resección, la cirugía reconstructiva trauma, y antes de la colocación del implante 1,2. La comprensión de los principios biológicos de cómo injertos óseos apoyan el proceso de consolidación del injerto no sólo es clave para entender por qué los autoinjertos son considerados como el estándar de oro en la cirugía reconstructiva, también es biónico para la mejora del diseño de los sustitutos óseos 3. Sin embargo, la consolidación del injerto es más rápido con hueso autólogo en comparación con sustitutos óseos 4,5. Por lo tanto, es imperativo para revelar los mecanismos moleculares y celulares que hacen hueso autólogo tan eficaz para apoyar la regeneración ósea.
Hay tres características de libros de texto de autoinjertos que se consideran para apoyar el proceso de consolidación 6,7. En primer hueso, autólogo es osteoconductiva, proporcionar orientación para el hueso de nueva formación para creceren el defecto. En segundo lugar, el hueso autólogo es osteogénico, lo que significa que contiene células mesenquimales que pueden diferenciarse en osteoblastos 8. Hueso Tercero, autólogo es osteoinductivo como factores de crecimiento, como las proteínas morfogenéticas óseas sepultados en la matriz pueden iniciar el proceso de endocondral o incluso la formación de hueso intramembranosa 9. Hay otro aspecto: astillas de hueso recién preparados tienen una función paracrina sobre la base de las observaciones in vitro con "medio hueso acondicionado" 10-15. También el impacto de mielopoyesis debe mencionarse 16. Un término similar "medio de matriz ósea desmineralizada acondicionado" ya fue acuñado en 1996 y es compatible con el concepto general de una función paracrina del hueso, incluso cuando procesada por desmineralización 17. Para nuestros propósitos, BCM puede prepararse a partir de cerdo fresca mandíbulas 10,11. Análisis proteómico de BCM revelaron la composición compleja, incluyendo hecho de crecimientoors y componentes de la matriz extracelular 10, que también se extiende el conocimiento existente sobre el proteasoma de toda ósea 18,19. Por lo tanto, BCM debe reflejar la actividad de lanzamiento de varias modificaciones de injertos óseos in vitro.
¿Qué ocurre cuando las células mesenquimales, por ejemplo los aislados de virutas de hueso o de tejido blando oral, están expuestos a BCM? In vitro, BCM reduce osteogénico y la diferenciación adipogénica, y provoca un fuerte aumento de la expresión de IL11 11. Genoma amplia microarrays reveló más genes que se expresó diferencialmente en las células mesenquimales en respuesta a BCM. Entre estos genes son adrenomedulina (ADM), IL11, IL33, NADPH oxidasa 4 (NOX4), proteoglicanos 4 (PRG4 o lubricina) y pentraxina 3 (PTX3) 15. BCM obtenido a partir de astillas de hueso en autoclave no pudo cambiar la expresión de los genes respectivos 14. BCM de astillas de hueso que se sometieron a la pasteurización y la congelación fue capaz decambiar la expresión del gen 14. Medio de la matriz ósea desmineralizada (DBM-CM) También acondicionado cambia la expresión de TGF-β genes regulados 20. Curiosamente, las membranas de barrera de colágeno utilizados para proteger los chips de hueso a partir del tejido blando circundante 21,22, adsorbidos aquellas partes de BCM que son responsables de los cambios en la expresión génica 23. Investigación BCM se puede extender a otros tipos de células que participan en la regeneración ósea, tales como los osteoclastos de resorción ósea y células endoteliales, para nombrar unos pocos. En general, los datos se acumulan in vitro proporcionan la base científica para el diseño de un estudio preclínico.
El presente protocolo es doble: Primero, muestra cómo preparar BCM. En segundo lugar, muestra cómo probar su actividad biológica basado en células mesenquimales in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparación BCM
- Obtener mandíbulas de cerdos de la carnicería local lo más fresco posible. Coloque las mandíbulas sobre una superficie firme y suelte un colgajo de espesor total con especial atención para no dejar ningún tejido blando o periostio unido al hueso. Trabajar en un ambiente limpio y sin la necesidad de trabajar bajo la campana de flujo.
- Una vez que se dio a conocer un colgajo de espesor total, use un raspador de hueso para recoger los fragmentos de hueso del lado bucal. Tenga en cuenta que el raspador de hueso tiene que ser fuerte. Maneje con firmeza el raspador de hueso y con movimientos largos recogen el hueso. Desechar astillas de hueso más pequeño que 1 mm.
- Para mantener astillas de hueso nativo, colocar directamente las astillas de hueso en placas de plástico de 10 cm de diámetro con medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 1% de antibióticos y antimicóticos no dejar que se sequen.
- Para evaluar el impacto del procesamiento térmico, astillas de hueso sometidos a pasteurización durante 30 minutos a 80 ° C oautoclave durante 20 min a 121 ° C.
- Para evaluar el impacto de la desmineralización, agitar astillas de hueso en 1 M HCL durante 4-6 horas a 4 ° C y lavar varias veces con medio de cultivo hasta que el pH es neutro.
- Coloque un total de 5 g de virutas de hueso por 10 ml de DMEM fresco suplementado con 1% de antibióticos y antimicóticos en un nuevo plato de plástico.
- Coloque los platos de plástico en una atmósfera húmeda a 37 ° C durante 24 horas. Entonces, cosecha BCM. Centrifugar el BCM a 200 xg durante 10 minutos para eliminar los residuos, filtrarla estéril (0,2 nm), y tener alícuotas congeladas a -80 ° C.
- Descongelar la población de BCM inmediatamente antes de su uso y evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación.
- Para los experimentos indicados, remojar las membranas de colágeno con medio BCM o sin suero durante 1 hora a temperatura ambiente. Lave vigorosamente las membranas con PBS y colocarlos en placas de 96 pocillos. Membranas húmedas se siembran con células.
- BCM proceso de preparación se resume en la Figura 1.
2. Los bioensayos Basado en células mesenquimales
- Células mesenquimales humanas de semillas (por ejemplo, células óseas, gingival y fibroblastos del ligamento periodontal) en una placa de 12 pocillos con una concentración de 30.000 células / cm2. Para sembrar las células utilizan el medio de cultivo que consiste en DMEM, 10% de suero fetal bovino y antibióticos. Deja que las células se adhieren a la placa de O / N.
- Deseche el medio de cultivo y se lavan las células con PBS precalentado a 37 ° C. Estimular las células mediante la adición de medio de cultivo libre de suero pre-calentado con y sin 20% BCM. Colocar las células en un ambiente humidificado a 37 ° C durante 24 hr.
- Deseche el medio de cultivo, enjuague las células con PBS precalentado y extraer el ARN de acuerdo con su protocolo preferido.
- Ajustar la concentración de ARN con el fin de tener la misma cantidad de ARN en cada muestra. Preparar ADNc y realizar una QRT-PCR para analizar los genes seleccionados utilizando los cebadores mostrados en la Tabla 1.
NOTA: Estas son las diluciones de todos los componentes: 2x SYBR verdes, 20x cebador directo, 20x cebador inverso, 5x agua DD estéril, ADNc 5x. La qRT-PCR se realiza en 40 ciclos de 95 ° C 15 seg y 60 ° C 1 min. - Calcular los niveles relativos de expresión mediante la normalización de la limpieza gen GAPDH utilizando el método Δ (Ct) donde Ct es objetivo CT - CT GAPDH y Δ (Ct) es estimulada Ct - Ct control.
- Después de este control de calidad, añadir BCM al medio de cultivo para estimular todos los tipos de células, incluidas las células mesenquimales, células hematopoyéticas o células endoteliales.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bone Medium acondicionado se preparó a partir de astillas de hueso porcino frescas. Visión general del proceso para preparar BCM y usar biomateriales en combinación con BCM se muestra en la Figura 1 y la Figura 2 respectivamente. Durante la preparación del BCM, es importante para obtener grandes astillas de hueso con movimientos largos como movimientos cortos o muy pequeñas astillas de hueso puede afectar a la calidad del BCM final. Calidad de BCM se puede controlar mediante el análisis de la expresión génica de genes diana BCM: ADM, PTX3, IL11, IL33, NOX4 y PRG4 (Figura 3). ADM y PTX3 están regulados por abajo de 0.4 veces y IL11, IL33, NOX4 y PRG4 pueden ser regulados hasta 200 veces. Si fibroblastos orales no expresan genes diana BCM en el nivel mostrado, comprobar el estado de las células o preparar nuevos BCM de nuevas mandíbulas. Figura 4 muestra los resultados típicos de la expresión de genes diana BCM en fibroblastos orales sembradas a una membrana de barrera de colágeno. Fibroblastos orales estimularon con 20% de medio acondicionado a partir de astillas de hueso pasteurizados y medio a partir de astillas de hueso desmineralizado acondicionado, mostró la expresión de genes similares a las células estimuladas con BCM (Tabla 2 y Tabla 3). Sin embargo, la expresión del gen de los fibroblastos orales expuesto a medio condicionado de esterilizados (121 ° C) astillas de hueso, era comparable a los controles de un-estimulado.
Figura 1. Resumen del proceso utilizado para preparar el medio hueso acondicionado de mandíbulas de cerdo frescos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Resumende los bioensayos basados en células mesenquimales con BCM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. La expresión génica de los genes diana de hueso medio acondicionado en fibroblastos orales. Los resultados típicos de seis genes utilizados para controlar la calidad de BCM. Genes ADM y PTX3 son downregulated (A) y IL11, IL33, NOX4, PRG4 son upregulated (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. La expresión génica de hueso conditioned genes diana medianas en fibroblastos orales sembradas a una membrana de barrera de colágeno. Los resultados típicos de seis genes utilizados para controlar la calidad de BCM. Genes ADM y PTX3 son downregulated (A) y IL11, NOX4, PRG4 son upregulated (B). Dependiendo del biomaterial utilizado, la absorción de los factores de crecimiento puede diferir. Membranas de colágeno no pudieron absorber los factores que controlan la expresión de IL33, por lo tanto, la expresión de IL33 no está regulada en esta configuración. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Abreviatura | Cebador | Cebador inverso |
| GAPDH | AGCCACATCGCTCAGACAC | GCCCAATACGACCAAATCC |
| ADM | GGACATGAAGGGTGCCTCTC | TGTTCATGCTCTGGCGGTAG |
| IL11 | TGCACCTGACACTTGACTGG | AGTCTTCAGCAGCAGCAGTC |
| IL33 | TCAGGTGACGGTGTTGATGG | GGAGCTCCACAGAGTGTTCC |
| NOX4 | TCTTGGCTTACCTCCGAGGA | CTCCTGGTTCTCCTGCTTGG |
| PRG4 | CGACGCCCAATGTAAGAAGT | GGTGATGTGGGATTATGCACT |
| PTX3 | TGTATGTGAATTTGGACAACGAA | CATTCCGAGTGCTCCTGAC |
Tabla 1: secuencia del cebador de los 6 genes utilizados.
| Genes | 80 ° C Media ± SD | 121 ° C Media ± SD |
| ADM | 0,2 ± 0,1 | 1,1 ± 0,2 |
| PTX3 | 0,1 ± 0,1 | 0,9 ± 0,2 |
| IL11 | 20 ± 10 | 1,5 ± 1 |
| IL33 | 15 ± 5 | 1,2 ± 4 |
| NOX4 | 35 ± 15 | 2 ± 1 |
| PRG4 | 40 ± 10 | 1,8 ± 1 |
Tabla 2: Típica de la expresión génica de ADM, PTX3, IL11, IL33, NOX4 y PRG4 en fibroblastos orales estimuladas con 20% de medio condicionado de astillas de hueso con tratamiento térmico.
| Genes | La media ± desviación estándar |
| ADM | 0,1 ± 0,1 |
| PTX3 | |
| IL11 | 15 ± 5 |
| IL33 | 20 ± 10 |
| NOX4 | 60 ± 15 |
| PRG4 | 50 ± 20 |
Tabla 3: Típica de la expresión génica de ADM, PTX3, IL11, IL33, NOX4 y PRG4 en fibroblastos orales estimuladas con 20% de medio a partir de astillas de hueso desmineralizado condicionado.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bone medio acondicionado refleja la actividad liberada de injertos óseos durante las primeras etapas de la regeneración ósea. El protocolo se describe aquí puede adaptarse para estudiar la respuesta de diferentes tipos de células implicadas en la regeneración ósea. Además, el protocolo se puede utilizar para preparar el medio de rellenos óseos o hueso procesado condicionado. Los métodos son fáciles de realizar y se basan en un concepto simple: los factores liberados de varios hueso nativo y procesados. La comprensión de cómo afecta BCM células mesenquimales pueden ayudar a aprender más acerca de la consolidación del injerto y las propiedades de los autoinjertos óseos. Sobre la base de este concepto hemos acumulado conocimiento sobre el impacto de BCM obtenido de nativos 11,15 y procesados hueso 14,20 en la expresión génica de las células mesenquimales, sino también en la proliferación, migración y diferenciación en los tres linajes principales; osteoblastos, adipocitos y condrocitos 11. BCM también fue examinado por su capacidad de target células hematopoyéticas, por ejemplo con respecto a la modulación de la osteoclastogénesis 13. Muchas células diana potenciales están esperando para responder a BCM in vitro, los protocolos que aquí se presentan, pueden servir como un manual para esta investigación.
Los protocolos presentados también deben animar a revelar adicionalmente los mecanismos moleculares de cómo BCM activa los genes particularmente TGF-β-regulada en las células mesenquimales. Por ejemplo, el receptor de TGF-β I antagonista SB431542 bloqueó el efecto de BCM en la expresión del gen panel de ADM, IL-11, NOX4, PRG4, y PTX3 11,15. Curiosamente, la fosfatasa alcalina y IL33 no se invirtieron por SB431542 11,15 lo que sugiere que otras vías aún desconocidas están regulados por BCM. Otra cuestión abierta es lo que son las moléculas en BCM siendo responsable de la respuesta celular? BCM contiene TGF-β pero no explica las complejas reacciones celulares 10,11. Además de la enVitro aspectos celulares, la pregunta general sigue siendo: a que se extienden hace la actividad de lanzamiento de injertos óseos como se refleja en BCM, tener un impacto en el proceso in vivo de regeneración ósea? Los protocolos y datos de bioensayos deben introducir la investigación en esta dirección.
Este protocolo tiene limitaciones. BCM no puede ser totalmente estandarizada debido a las variaciones entre los donantes y las técnicas de cosecha. Por otra parte, cómo las enzimas presentes in vivo pueden afectar a la composición o la actividad de BCM sigue siendo desconocido. Los estudios futuros deben, por ejemplo, se centran en cómo las técnicas de cosecha afectan a la "actividad biológica" de BCM. El papel de los osteocitos en la composición de BCM también debe ser estudiado en detalle. BCM contiene esclerostina, una molécula liberada casi exclusivamente por los osteocitos 12. Limitaciones, sin embargo, proporcionan la inspiración para los próximos pasos en la investigación. A pesar de que la relevancia clínica de investigación con BCM sigue siendo HYpothetical, nuestros protocolos soporta el concepto de larga data que los injertos óseos, ya sea nativa o sin transformación, liberan una "actividad biológica". La comprensión de cómo BCM afecta a las células in vitro, presumiblemente, puede ayudar a entender cómo los autoinjertos óseos trabajarán en vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar. Jordi Caballé-Serrano recibió una beca de la Fundación de Investigación Dental y Educación, Basilea, Suiza.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pig Mandibles | Local bucher | ||
| Bone Scraper | Hu-Friedy | PPBUSE2/36 | |
| Antibiotics & Antimicotics | All life Technologies | 15240-062 | |
| Collagen Membranes (Bio-Gide) | Geistlich | ||
| Fetal Calf Serum | Invitrogen Corporation | 16030074 | |
| DMEM | Invitrogen Corporation | 21885-025 | |
High Pure RNA Isolation Kit |
Roche | 11828665001 | |
| Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit | Roche | 4379012001 | |
| Primers | Microsynth | ||
| SYBR Green (for Q-RT-PCR) | Roche | 4673484001 | |
| PBS | Roche | 11666789001 |
References
- Buser, D. Long-term Stability of Early Implant Placement with Contour Augmentation. Journal of dental research. , (2013).
- Chiapasco, M., Casentini, P., Bone Zaniboni, M. augmentation procedures in implant dentistry. The International journal of oral & maxillofacial implants. 24 Suppl. , 237-259 (2009).
- Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Bone Tsiridis, E. substitutes: an update. Injury. 36, Suppl 3. S20-S27. , (2005).
- Jensen, S. S., Broggini, N., Hjorting-Hansen, E., Schenk, R., Bone Buser, D. healing and graft resorption of autograft, anorganic bovine bone and beta-tricalcium phosphate. A histologic and histomorphometric study in the mandibles of minipigs. Clinical oral implants research. 17, 237-243 (2006).
- Jensen, S. S. Evaluation of a novel biphasic calcium phosphate in standardized bone defects: a histologic and histomorphometric study in the mandibles of minipigs. Clinical oral implants research. 18, 752-760 (2007).
- Grabowski, G., Bone Cornett, C. A. graft and bone graft substitutes in spine surgery: current concepts and controversies. The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 21, 51-60 (2013).
- Khan, S. N. The biology of bone grafting. The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 13, 77-86 (2005).
- Bohr, H., Ravn, H. O., Werner, H. The osteogenic effect of bone transplants in rabbits. The Journal of bone and joint surgery. British. 50, 866-873 (1968).
- Bone Urist, M. R. formation by autoinduction. Science. 150, 893-899 (1965).
- Caballé-Serrano, J. D., Buser, D., Gruber, R. Proteomic analysis of porcine bone conditioned medium. The International journal of oral & maxillofacial implants. , (2014).
- Peng, J. Bone-Conditioned Medium Inhibits Osteogenic and Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Cells In Vitro. Clinical implant dentistry and related research. , (2014).
- Brolese, E., Buser, D., Kuchler, U., Schaller, B., Gruber, R. Human bone chips release of sclerostin and FGF-23 into the culture medium: an in vitro pilot study. Clinical oral implants research. , (2014).
- Caballé-Serrano, J., Bosshardt, D. D., Gargallo-Albiol, J., Buser, D., Bone Gruber, R. conditioned medium enhances osteoclastogenesis in murine bone marrow cultures. Clin Oral Impl Res; in. Int J Oral Maxillofac Surg. , (2015).
- Zimmermann, M. Bone-conditioned medium changes gene expression in bone-derived fibroblasts). IJOMI accepted. , (2014).
- Fulzele, K. Myelopoiesis is regulated by osteocytes through Gsalpha-dependent signaling. Blood. 121, 930-939 (2013).
- Becerra, J., Andrades, J. A., Ertl, D. C., Sorgente, N., Nimni, M. E. Demineralized bone matrix mediates differentiation of bone marrow stromal cells in vitro: effect of age of cell donor. Journal of. 11, 1703-1714 (1996).
- Kupcova Skalnikova,, H, Proteomic techniques for characterisation of mesenchymal stem cell secretome. Biochimie. , (2013).
- Romanello, M. Osteoblastic cell secretome: A novel role for progranulin during risedronate treatment. , Bone. (2013).
- Schuldt Filho,, G, Conditioned medium of demineralized bone matrix activates TGF-β signaling pathways in mesenchymal cells in vitro. J Cranio Maxill Surg. , (2015).
- Buser, D., Chen, S. T., Weber, H. P., Belser, U. C. Early implant placement following single-tooth extraction in the esthetic zone: biologic rationale and surgical procedures). The International journal of periodontics & restorative dentistry. 28, 441-451 (2008).
- Stoecklin-Wasmer, C. Absorbable collagen membranes for periodontal regeneration: a systematic review. Journal of dental research. 92, progress. 773-781 (2013).
