Abstract
흉선 선택의 효과를 조절하는 메커니즘은 잘못 정의 된 남아 있습니다. 생체가 자신과 외부 항원에 특이적인 T 세포의 발달 및 선택 분석 여기에 제시된 방법이 있습니다. 방법은 면역 결핍 SCID받는 사람에 다양한 세 생쥐에서 파생 된 흉선 이식의 이식을 수반한다. 비교적 짧은 시간 동안받는 완전히 주입 흉선 이식편 유래의 T 세포로 재구성된다. 흉선 세포 만 분리시 흉선 시드가 선택을 거쳐 성숙한 T 세포로 발달. 이와 같이, 연령 의존적 흉선 이벤트 함수로서 접목 T 세포의 특성 및 특이성의 변화가 평가 될 수있다. 전문 기술이 성공적 흉선 이식 필요하지만,이 방법은 생체 내 비정상적 흉선 기능 및 / 또는 homeostas의 결과로 인한 또는 병리 광범위한 연구하는 독특한 전략을 제공한다이다.
Introduction
T는 흉선 세포 발달에 중요한 이벤트가 1을 발생하는 기관이다. 상주 흉선 세포는 T 세포 수용체 (TCR) α 및 β 유전자의 재 배열시, 흉선 (2)의 피질 및 수질 지역 lymphostromal와 항원 제시 세포 (APC)와 일련의 상호 작용을 겪는다. 흉선 양성 선별은 호스트 주요 조직 적합성 복합체 (MHC) 클래스 I 및 II 분자 2-3의 컨텍스트에서 항원 성 펩타이드를 인식 흉선 세포를 생산하기 위해 피질 흉선 상피 세포 (TEC)에 의해 매개된다. 이후 흉선 음의 선택은 수질 TEC 또는 수지상 세포 (DC) MHC 클래스 I 및 II 분자 (3)에 의해 결합 된 자기 단백질로부터 유래 된 것을 본 펩타이드와의 상호 작용에 의해 구동 자기 반응성 흉선 세포의 정화를 수반한다. 이 프로세스의 최종 결과는 광범위한 스펙트럼 응답 할 수 성숙한 CD4 + 및 CD8 + T 세포의 풀의 설립이다외국 항원의 자기 단백질 4 최소한의 반응성을 전시한다.
흉선 선택 이벤트 효율 성숙 흉선, 골수 및 피질 TEC, 흉선 DC의 서브셋 조성물의 주파수 및 흉선 전구체 (3)의 소스를 포함 요인의 호스트에 의해 영향을 받는다. 특히, 비정상적인 흉선 선택은 각각 장애인 부정적 또는 긍정적 인 선택에서 발생하는자가 면역 5 또는 면역 결핍 병리,이 발생할 수 있습니다. 흉선 선택을 조절하는 분자 이벤트는, 그러나, 제대로 이해된다. 체외은 재 응집 흉선 기관 배양 (RTOC) 6으로 접근, 흉선 선택과 관련된 기본 이벤트를 분석하는 데 유용 할 수 있지만 완전히 진행의 역학을 요점을 되풀이하지 입증했다 생체 이벤트에서. 따라서이 흉선 이식 기반 접근법은 생체 (7)에 더 연구 흉선 세포 선택 이벤트에 설립되었다
이 프로토콜은 면역 결핍 SCID받는 마우스로 신생아와 성인 기증자 마우스에서 thymi 이식에 대해 설명합니다. 이 기술은 양극과 음극 흉선 선택뿐만 아니라, 개체 발생 동안 다양한 T 세포 서브 세트의 흉선 출력을 조절 메커니즘의 연구를 허용한다. 최근에,이 접근법은 흉선 선택의 효율성은 초기 자기 반응성 T 세포의 증가 된 발달 선도 마우스에서 생후 제한된다는 것을 입증하기 위해 사용하고, 외부 항원 7 감소 T 세포 레퍼토리 특정되었다.
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Protocol
쥐의 연구는 노스 캐롤라이나 채플 힐 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인 된 모든 동물 보호는 IACUC 지침에 따라이었다.
신생아 및 성인 Thymi 1. 준비
- 이전 기증자 쥐를 안락사에 대한 모든 시약 및 장비를 준비합니다.
- 고압 증기 멸균 또는 기타 적절한 방법으로 수술 도구를 소독. 모든 수술은 멸균 조건을 유지하고, 오염을 방지하기 위해 층류 후드에서 수행되어야한다. 기증자 마우스에서 thymi의 추출을 위해 필요한 도구를 조립합니다.
- 멸균 1X PBS (PH 7.4)와 60mm 요리를 입력하고 후드 내부의 얼음에 배치합니다. 이 전에 이식 기증자 마우스에서 절제 간단히 저장 thymi하는 데 사용됩니다.
- 윤리 지침에 따라, 공동으로 자궁 경부 전위 다음 2 질식을 참수 성인 기증자 마우스로 신생아 기증자 쥐를 안락사.
- R의 경우흉선의 emoval은 : 멸균 흡수 종이 타월에 지느러미 누운 위치에 마우스를 놓고 절개를하기 전에 70 % 에탄올로 스프레이.
- 피부를 통해 중간 선 절개를하여 복부와 흉강을 노출. 흉강을 나타 내기 위해 가슴과 앞발을 통해 피부를 접습니다.
- 우수한 종격동 노출과 흉강을 전방에 격막과 흉곽을 통해 두 가지 측면 절개를합니다. 흉선은 바로 위의 두 개의 흰색 로브로 볼 수 있고 마음에 인접한다.
- 캡슐을 방해하지 않도록 특정하고, 미세 집게로 흉선 주위의 결합 조직을 떨어져 애타게. 집게와 흉곽을 다시 누른 상태에서 장기 아래 곡선 집게의 위치를 수직으로 잡아 당겨 흉선의 두 로브를 추출 포셉의 두 번째 쌍을 사용합니다. 이는 신생아 마우스로부터 추출 thymi 해부 범위를 사용하여 수행 될 수있다.
- 60mm 디에 흉선 배치SH 결합 지협을 통해 절단에 의해 얼음과 별도의 흉선 로브에 멸균 1X PBS (PH 7.4)를 포함. 캡슐이 손상되지 않도록 특정 만드는 흉선 로브에서 모든 파편을 제거하고 이식 섹션의 해당 번호로 흉선를 잘라.
- 신생아 쥐에서 얻은 thymi를 조작하지 마십시오.
참고 :이받는 사람 마우스 (받는 사람 당 1 엽)의 최대 사용합니다. - 4-6받는 마우스의 최대로 성인 마우스로부터 수득 thymi 이식. 그림 1과 같이 신중하게, 성인 흉선 엽을 파악, 포셉 한 쌍을 사용하여, 수술 가위를 사용하여 세 개의 동일한 부분으로 흉선을 잘라.
- 반복 각 기증자 마우스 1.3-1.4 단계를 반복합니다. thymi 노출 시간을 제한하기 위해, 한 번에 한 도너 흉선을 준비한다.
신장 캡슐에서 2 흉선 이식
- 표 1에 예비 살균 장치를 조립한다. 적절한 무균기술은 오염 된 도구 나 시약에 이식받는 사람에게 노출되지 않도록하는 절차의 과정에서 활용되어야한다.
- 이전 이식에, 무게 및 각받는 사람 마우스를 태그.
- 층류 후드의 해부 현미경 및 마취 회로를 설정합니다.
- 전기 면도기를 사용하여 수신자 마우스의 좌측 면도와 털이 절개하는데 사용 지역 주위에 남아 있도록.
- 이소 플루오 란 기화기의 전원을 켜고 1 ~ 2 % 사이의 복용량을 사용하여 마우스를 마취. 이전 발가락 핀치 다음 반사의 부재를 확인하여 수술 절차를 시작하기에 적절한 마취를 확인.
- 마우스가 제대로 마취 후, 건조를 방지하고, 다음과 같이 이식 마우스를 준비하고, 마우스 눈 연고 수의학 적용
- 면도면이 위를 향하도록 오른쪽 측면 누운 위치에 해부 현미경으로 마우스를 놓습니다. StartiNG 외과 영역의 중심에서, 포비돈 요오드 (betadine) 뒤에 전송 일회용 피펫 70 % 에탄올을 사용하여 원을 그리 분배. 절개를 만들기 위해 3 시간 전에 에탄올 / betadine 처리를 반복합니다.
- 사용 해부 가위 직접 신장보다 1-2cm의 측면 절개를합니다.
- 신장에 인접하여 결합 조직을 파악하고 근육 위에 놓 이도록 부드럽게 신장을 들어 올려 매체 집게를 사용. 근육을 통해 노출 된 신장과 장소에 유지하려면, 신장 장골을 방해하지 않도록 특별한주의를 기울이고, 신장 아래 매체 집게의 한 팔을 삽입합니다.
- 조직의 탈수를 방지하기 위해, 신장과 신장 캡슐의 조작이 완료 될 때까지 각 단계 동안 멸균 1X PBS (PH 7.4)으로 신장 관개.
- 미세 집게가 끼지과 신장에서 분리하는 부신에 가장 말단 신장의 가장자리 근처에 캡슐을 들어 올려 사용.
- 18 게이지를 사용하여바늘은 기증자의 흉선 (그림 2A)의 준비 조각을 삽입하기에 충분히 큰 절개를합니다. 시간이 지남에 따라 그래프트의 전위를 방지하기 위해 가능한 한 작은 낭 절개를 유지 특정 확인.
- 캡슐을 유지하는 것은 신장에서 멀리 당겨 동안, 캡슐 아래 이식을 삽입 가능 (그림 2B)로 피막 절개에서까지 앞으로 흉선을 밀어 미세 집게의 두 번째 쌍을 사용합니다.
- 신장 아래에서 집게를 제거하고 부드럽게 절개를 통해 장소에 다시 신장을 반환합니다.
- 복막 벽을 봉합 한 번 폐쇄 betadine을 적용하여 근육을 닫습니다. 봉합이 완료되면, 진피를 닫고 주변부 betadine을 적용 창상 클립을 적용한다.
- 열 램프를 사용하여 예열 된 케이지에 마우스를 돌려줍니다.
- 이 전체 의식과 이동성을 회복 할 때까지 각각의 수술 후 마우스를 모니터와 마우스 그쪽을 배치하지 마십시오(T)는 다른 동물과 케이지에 마취를 다음 회복하지 않았습니다.
- 필요에 따라 수술 후 통증 관리의 약물과 쥐를 치료. 예컨대 1.6 mg / ml의 농도로 식수 아세트 아미노펜 등의 수술후 진통제와 마우스를 제공한다.
- 반복 각받는 사람 마우스 2.3-2.9 단계를 반복합니다.
- 1 시간 수술 후 내에서 정상적인 활동에 그 마우스 수익을 확인합니다. 이식 절차의 결과로서 발생하는 합병증을 결정 수술후 중량, 운동 능력뿐만 아니라, 각 마우스의 음주와 급전 활동을 모니터.
주 : 수술 전 중량뿐만 아니라, 이동도 변경 또는 먹는 음료 또는 합병증을 나타낼 수 실패에 비해 수술 후 체중 감소. - 꼬리 닉 제조업체의 사양에 따라 Lympholyte 세포 분리 미디어를 사용하여 림프구를 분리 한 다음을 통해 마우스를 출혈에 의해 말초 혈액에서 T 세포 재구성을 모니터링합니다. T 세포 characteriza 달성이러한 형광 활성화 숙신 이미 딜 에스테르 (8)과 같은 T 세포 마커 CD3, CD4, CD8 및뿐만 아니라 라이브 죽은 판별에 대한 특정 형광 복합 항체와 림프구를 염색하여 기. 도 3에 도시 된 바와 같이 분석 단봉, 생균 및 CD3 양성 세포상의 게이팅을 통해 달성 될 수있다.
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Representative Results
이 절차의 성공은 최소의 외상 수술뿐만 아니라, 신장 캡슐 밑에 그래프트의 정확한 위치에 의존한다. 도 1에 도시 된 바와 같이 흉선 그래프트 적절히 확보 후속 이식 흉선 섹션 크기로 절단되어야한다.도 1의 개략도에 따라, 신생아 나 성체 생쥐 thymi 일관되고 재현 T 세포의 생착 결과 성공적인 피막 하 이식에 사용될 수있다. 언급 한 바와 같이, 신장 캡슐 밑에 그래프트의 적절한 위치 설정은 이식 장기 생존, 기능 및 혈관 형성을 유지하는데 중요하다. 그림 2에서 보는 바와 같이, 흉선 이식은 신장, 캡슐 절개의 반대쪽에, 부신 (신장의 앞쪽)에 가장 가까운 (신장의 후방) 꼭대기에 배치해야합니다. 성공적인 흉선 이식 적절한 조혈 환경과 결합 할 때, 수, R30주 7 초과 생산이 메인.
이식 후, 생착 말초 혈액으로부터 얻어진 T 세포 분석 유동 세포 측정에 의해 평가된다.도 3 및 표 2를 이식받는 6주 이식 후에서의 기관 및 말초 혈액에서 관찰되는 T 세포의 생착의 전형적인 수준을 보여준다. 이 기술을 사용하여, 우리 그룹은 이전에 신생아 및 성인 thymi의 이식에 시간이 지남에 말초 혈액에서 CD4 +와 CD8 + T 세포 재구성의 반응 속도를 보여 주었다. 간략하게, 순환 T 세포는 일주일 후 수술 내 둘레에서 관찰 될 수 있고 CD4 + 및 CD8 + T 세포의 숫자는 말초 T 세포 구획 완전히 5~6주 이식 후 7에서 재구성 될 때까지 계속 증가.
그림 2. 낭 절개 및 흉선 그래프트의 배치 위치 도너 흉선으로부터 제조 된 적절한 크기의 절 신장 (A)의 후방 단부에 신장 캡슐에 작은 절개에 의해 생성 된 피막 하 공간 내로 삽입된다. 앞쪽은 신장, 부신에 가장 가까운 (안 사진)과 캡슐 절개로부터 대향 단부에, (B)에 도시 한 바와 같이 캡슐 아래에 삽입 이식을위한 최적의 위치이다.
말초 혈액과 림프 기관에서 T 세포 재구성을 통해 성공적인 생착을 결정 그림 3. 유세포 데이터는 T 세포 재구성의 대표 NB 흉선 이식 SCID받는 6 주에게 이식 후 관찰한다. T 세포의 생착 비슷한 수준의 말초 혈액, 비장, 췌장 림프절 (PLN)에서 관찰되며, 장간막 림프절 (MLN)은 흉선 그래프트의 성공적인 이식 다음.
| 미세 해부 집게 |
| 중간 해부 집게 (2) |
| 미세 해부 집게 (곡선 팁) |
| Betadine 솔루션 |
| 70 % 에탄올 |
| 18 게이지 바늘 |
| / 광원 승 해부 현미경 |
| 디sposable 전송 피펫 (2) |
| 통증 관리를위한 약물 : 아세트 아미노펜 |
| 멸균 와이프 |
| 가열 램프 |
| 전기 면도기 |
| 이소 플루 란과 이소 플루 란 기화기 |
| 봉합 (빠른 흡수, 일반 장) |
| 가위를 해부 |
| 9mm 스테인레스 스틸 상처 클립 |
| 상처 클립 제거 도구 |
| 무균 1X PBS |
| 60mm 요리 |
표 1.받는 사람 마우스의 신장 캡슐 아래 흉선을 이식하는 데 필요한 자료의 수술 흉선 이식시 필요한 재료 목록. 지정된 물질의 양이 괄호 안에 표시됩니다.
| 자는 totaCD4 T 세포의 L 번호 | CD8 T 세포의 총 개수 | |
| 혈액 | 1652 세포 / υl | 351 세포 / υl |
| 비장 | 11546617 | 4203299 |
| PLN | 1241789 | 364918 |
| MLN | 2182266 | 532059 |
흉선 이식받는 사람의 말초 혈액과 림프 기관에 존재하는 T 세포의 표 2. 총 수. CD4 +와 CD8 + T 기관에서 회수 된 세포의 총 숫자뿐만 아니라 신생아 흉선 이식받는 사람의 말초 혈액 육주 포스트 이식. 이 번호는 일반적으로 성공적인 신생아 및 성인 흉선 이식 수혜자에서 관찰되는 CD4 + 및 CD8 + T 세포의 세포 수의 대표이다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2705HC | |
| PBS | GIBCO | 14190-144 | pH 7.4 |
| Betadine Solution | Purdue Products | 67618-150-17 | |
| 18 gauge needle | BD | 305195 | |
| Sutures (1.0 metric) | Ethicon | J493G | 18" (45cm) |
| AUTOCLIP Wound Clips (9mm) | Clay Adams® Brand | 427631 | |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-20 | Sterile, disposable |
| Mouse anti-CD3 Ab | eBioscience | 11-0031-85 | Clone: 1452C11 |
| Mouse anti-CD4 Ab | eBioscience | 48-0042-82 | Clone: RM4-5 |
| Mouse anti-CD8 Ab | eBioscience | 25-0081-82 | Clone: 53-6.7 |
| Lancet | Medipoint | Goldenrod 4mm | |
| Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium Salt | Invitrogen | P30253 | |
| 96-well round botton polypropylene plates | Corning | 3365 | |
| 1.2 ml polypropylene cluster tubes | Corning | 4401 | |
| 5 ml polypropylene round-bottom tubes | BD | 352002 | |
| 40uM Nylon Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
| 16% Paraformaldehyde Solution, EM Grade | Electron Microscopy Services | 15710 | Hazardous |
| Puralube Optical Ointment | Fisher Scientific | NC0138063 | |
| Lympholyte | Cedarlane | CL5030 | |
| 60 mm cell culture dish | Corning | 430196 | 60 mm x 15 mm, Sterile |
References
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