Abstract
Los mecanismos que regulan la eficacia de la selección tímica permanecen mal definidos. El método presentado aquí permite en los análisis in vivo de el desarrollo y selección de las células T específicas para antígenos propios y extraños. El enfoque implica la implantación de injertos tímicos derivados de diversos ratones de edad en receptores SCID inmunodeficientes. Durante un período relativamente corto de tiempo los destinatarios están completamente reconstituidos con células T derivadas de injerto de timo implantado. Sólo timocitos siembra el timo en el momento de aislamiento se someten a selección y se desarrollan en células T maduras. Como tal, los cambios en la naturaleza y la especificidad de las células T injertadas como una función de los acontecimientos del timo dependientes de la edad pueden ser evaluados. Aunque se requiere experiencia técnica para el trasplante de timo éxito, este método proporciona una estrategia única para estudiar in vivo una amplia gama de patologías que se deben a o un resultado de la función y / o homeostas tímico aberrantees.
Introduction
El timo es un órgano en el que los eventos críticos en el desarrollo de células T producen 1. Timocitos Residentes, sobre reordenación del receptor de células T (TCR) α y β genes, se someten a una serie de interacciones con lymphostromal y células presentadoras de antígeno (APC) en las regiones corticales y medulares del timo 2. Selección positiva tímico está mediada por células epiteliales corticales del timo (TEC) para producir los timocitos que reconocen péptidos antigénicos en el contexto de anfitrión complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I y II moléculas 2-3. La posterior selección negativa tímica implica la purga de los timocitos autorreactivos, impulsado por una interacción con TEC medular o células dendríticas (DC) que presentan péptidos derivados de auto-proteínas unidas por MHC de clase I y II moléculas 3. El resultado final de estos procesos es el establecimiento de un grupo de células maduras T CD4 + y CD8 + capaces de responder a un amplio espectrode antígenos extraños mientras que exhiben una reactividad mínima a proteínas propias 4.
La eficiencia de eventos de selección tímica está influenciada por una serie de factores, incluyendo la maduración tímica, la frecuencia de TEC medular y cortical, composición subconjunto de tímico DC, y la fuente de los precursores tímicos 3. En particular, la selección tímica aberrante puede resultar en autoinmunes 5 o inmunodeficientes patologías, que surgen de deterioro de la selección negativa o positiva, respectivamente. Los eventos moleculares que regulan la selección tímica, sin embargo, son poco conocidos. In vitro enfoques tales como cultivos de órganos timo reaggregate (RTOC) 6, han demostrado ser útiles para el análisis de los acontecimientos básicos asociados con la selección del timo, pero no para recapitular completamente la dinámica del curso en los eventos in vivo. Como resultado, este enfoque basado en el trasplante de timo se estableció a mejores eventos de selección de timocitos estudio in vivo 7
Este protocolo describe el trasplante de timos de ratones donantes recién nacidos y adultos en ratones receptores SCID inmunodeficientes. Esta técnica permite el estudio de los mecanismos que regulan la selección tímica positivo y negativo, así como la producción tímica de diversos subconjuntos de células T durante la ontogenia. Más recientemente, este enfoque ha sido utilizado para demostrar que la eficiencia de la selección tímica se limita temprano después del nacimiento en ratones conduce a un mayor desarrollo de las células T autorreactivas, y un reducido repertorio de células T específicas para antígenos extraños 7.
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Protocol
Los estudios murinos fueron aprobados por el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC) de la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill y todo cuidado de los animales estaba en conformidad con las directrices del IACUC.
1. Preparación del Recién Nacido y del adulto Thymi
- Preparar todos los reactivos y el equipo antes de la eutanasia de los ratones donantes.
- Esterilizar los instrumentos quirúrgicos de esterilización en autoclave u otros métodos apropiados. Todos los procedimientos quirúrgicos deben realizarse bajo una campana de flujo laminar para mantener las condiciones estériles y evitar la contaminación. Montar las herramientas necesarias para la extracción de timos de ratones donantes.
- Llene un plato de 60 mm con estéril 1x PBS (pH 7,4) y colocar en hielo dentro de la campana. Esto se utilizará para almacenar brevemente timos extirpados de ratones donantes antes del trasplante.
- De acuerdo con las normas éticas, la eutanasia a los ratones donantes recién nacidos por decapitación y los ratones donantes adultos por asfixia de CO 2 seguido por dislocación cervical.
- Para removal del timo: Coloque el ratón en una posición reclinada dorsal sobre una toalla de papel absorbente estéril y rociar con etanol al 70% antes de hacer una incisión.
- Exponer la cavidad abdominal y torácica haciendo una incisión en la línea media a través de la piel. Doble la piel sobre el pecho y extremidades anteriores para revelar la cavidad torácica.
- Haga dos incisiones laterales a través del diafragma y la caja torácica para exponer el mediastino superior y anterior de la cavidad torácica. El timo debe ser visible como dos lóbulos blancos inmediatamente por encima y adyacente al corazón.
- Desmenuzar el tejido conectivo que rodea el timo con unas pinzas finas, asegurándose de no perturbar la cápsula. Mientras mantiene de nuevo la caja torácica con fórceps, utilizar un segundo par de pinzas para extraer los dos lóbulos del timo mediante la colocación de pinzas curvas debajo del órgano y tirando verticalmente. Esto se puede hacer usando un microscopio de disección para extraer timos de ratones recién nacidos.
- Coloque el timo en el 60 mm dish que contiene 1x PBS estéril (pH 7,4) en hielo y los lóbulos tímicos separados por el corte a través del istmo conectivo. Retire cualquier residuo de los lóbulos tímicos asegurándose de no dañar la cápsula, y cortar el timo en el número apropiado de secciones para el trasplante.
- No manipular el timos obtenido a partir de ratones recién nacidos.
NOTA: Se utiliza para un máximo de dos ratones receptores (1 lóbulo por destinatario). - Transplante las timos obtenido a partir de ratones adultos en un máximo de 4-6 ratones receptores. El uso de un par de pinzas, sujete cuidadosamente lóbulo tímico un adulto, como se muestra en la Figura 1, cortar el timo en tres secciones iguales utilizando tijeras quirúrgicas.
- Repita los pasos 1.3 a 1.4 para cada ratón donante. Con el fin de limitar el tiempo timos están expuestos, preparar timo donante 1 a la vez.
2. Implantación timo bajo la cápsula renal
- Montar el equipo de pre-esterilizados listado en la Tabla 1. Aséptica adecuadotécnica debe ser utilizada durante el curso del procedimiento para prevenir la exposición de trasplante-receptores a las herramientas o reactivos contaminados.
- Antes del trasplante, pesar y etiquetar cada ratón receptor.
- Configure el microscopio de disección y el circuito de la anestesia en la campana de flujo laminar.
- El uso de una máquina de afeitar eléctrica, afeitarse el lado izquierdo de la ratón receptor y asegurar sin pelo permanece alrededor de la zona utilizada para hacer la incisión.
- Encienda vaporizador isofluorano y anestesiar el ratón utilizando una dosis de entre 1-2%. Determinar anestesia adecuada antes de comenzar el procedimiento quirúrgico mediante la comprobación de una ausencia de reflejo siguiente pizca dedo del pie.
- Después de que el ratón está anestesiado adecuadamente, aplicar el ungüento veterinaria a los ojos del ratón para evitar la sequedad y preparar el ratón para el trasplante como sigue:
- Coloque el ratón bajo el microscopio de disección en posición decúbito lateral derecho para que el lado afeitado quede hacia arriba. Starting en el centro de la zona quirúrgica, dispensar en un movimiento circular usando una pipeta de transferencia desechable 70% de etanol, seguido de povidona-yodo (betadine). Repetir el tratamiento con etanol / betadine 3 veces antes de hacer una incisión.
- Usando tijeras de disección hacen una incisión en el flanco 1-2 cm directamente sobre el riñón.
- El uso de pinzas medianas agarrar el tejido conectivo adyacente al riñón y levantar suavemente el riñón de modo que se encuentra encima de la musculatura. Para mantener el riñón expuesto y en su lugar sobre la musculatura, inserte un brazo de fórceps medio por debajo del riñón, prestando especial atención a no perturbar el hueso ilíaco renal.
- Con el fin de evitar la desecación del tejido, irrigar el riñón con 1x PBS estéril (pH 7,4) durante cada paso hasta que la manipulación de la cápsula renal y el riñón es completa.
- Usando unas pinzas finas pellizcan y levantar la cápsula cerca del borde del riñón más distal a las glándulas suprarrenales para separarlo del riñón.
- Utilice un calibre 18aguja para hacer una incisión lo suficientemente grande como para insertar la pieza preparada de timo donante (Figura 2A). Asegúrese de mantener la incisión capsular tan pequeño como sea posible para evitar la dislocación del injerto con el tiempo.
- Mientras se mantiene la cápsula se apartó desde el riñón, utilizar un segundo par de pinzas finas para insertar el injerto debajo de la cápsula y empujar el timo lo más adelante de la incisión capsular como sea posible (Figura 2B).
- Retire las pinzas de debajo de los riñones, y volver suavemente el riñón nuevo en su lugar a través de la incisión.
- Cierre la musculatura suturando la pared peritoneal y aplicar betadine una vez cerrada. Después de sutura es completa, aplicar clips de la herida para cerrar la dermis y aplicar betadine a la zona circundante.
- Devuelva el ratón a una jaula que se ha calentado utilizando una lámpara de calor.
- Monitorear cada ratón postoperatorio hasta que recupera la conciencia plena y la movilidad y no coloque tha ratonest no se han recuperado después de la anestesia en una jaula con otros animales.
- Tratar ratones con fármacos de control del dolor post-operatorio, según sea necesario. Proporcionar ratones con analgésicos post-operatorias tales como el acetaminofeno en el agua de bebida a una concentración de 1,6 mg / ml.
- Repita los pasos 2.3 a 2.9 por cada ratón receptor.
- Asegúrese de que los ratones retorno a la actividad normal dentro de 1 hora después de la cirugía. Monitor de peso post-operatorio, habilidades motoras, así como la actividad de beber y la alimentación de cada ratón para determinar las complicaciones que surgen como resultado del procedimiento de trasplante.
NOTA: la pérdida de peso post-operatorio, en comparación con el peso preoperatoria, así como la movilidad alterada o el fracaso para comer o beber puede indicar complicaciones. - Monitor de reconstitución de células T en la sangre periférica por sangrado ratones a través de la cola nick seguido de separación de linfocitos usando Lympholyte medios de separación de células de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Lograr characteriza células Tción por tinción linfocitos con anticuerpos conjugados con fluorescencia específicos para marcadores de células T CD3, CD4, y CD8, así como un discriminador de muertos en vivo, tales como un éster de succinimidilo activado por fluorescencia 8. Análisis como se muestra en la Figura 3 se puede lograr a través de gating en interiores, de células vivas, y las células CD3 positivas.
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Representative Results
El éxito de este procedimiento es dependiente de mínimo trauma quirúrgico, así como el posicionamiento preciso del injerto por debajo de la cápsula renal. El injerto tímico se debe cortar para asegurar apropiadamente dimensionado secciones tímicos para posterior trasplante como se muestra en la Figura 1. Siguiendo el esquema de la Figura 1, los timos de ratones recién nacidos o adulto se puede utilizar para el trasplante subcapsular éxito con resultados injerto de células T consistentes y reproducibles. Como se ha mencionado, el posicionamiento apropiado del injerto bajo la cápsula renal es importante en el mantenimiento de la supervivencia a largo plazo, la función y la vascularización del injerto. Como se ve en la Figura 2, el injerto tímico debe ser colocado encima de la riñón, más cerca de las glándulas suprarrenales (anterior del riñón), en el extremo opuesto de la incisión capsular (posterior de riñón). Un trasplante de timo éxito, cuando se combina con un entorno hematopoyética apropiada, puede rEmain productiva de más de 30 semanas 7.
Después del trasplante, el injerto se evaluó por análisis de citometría de flujo de células T obtenidas de la sangre periférica. Figura 3 y la Tabla 2 demuestran el nivel típico de injerto de células T observada en los órganos y la sangre periférica en un receptor de trasplante 6 semanas post-trasplante. Usando esta técnica, nuestro grupo ha demostrado previamente la cinética de la reconstitución de células CD4 + y T CD8 + en la sangre periférica con el tiempo en receptores de trasplante de timos recién nacidos y adultos. Brevemente, las células T circulantes se pueden observar en la periferia dentro de una semana después de la cirugía y el número de células T CD4 + y CD8 + continúan aumentando hasta que el compartimento periférico de células T está completamente reconstituido a las 5-6 semanas después del trasplante 7.
Figura 2:. Posición del incisión capsular y la colocación de injerto tímico Una sección de tamaño apropiado preparado a partir del timo del donante se inserta en el espacio subcapsular creado por una pequeña incisión en la cápsula renal en el extremo posterior del riñón (A). Anterior al riñón, más cerca de las glándulas suprarrenales (no se muestra) y en el extremo opuesto de la incisión capsular, es la posición óptima para el injerto que se inserta debajo de la cápsula como se muestra en (B).
Figura 3. Determinación de injerto exitoso a través de la reconstitución de células T en la sangre y los órganos periféricos linfoides. Citometría de flujo de datos son representativos de reconstitución de células T observaron 6 semanas post-trasplante en un receptor SCID de un injerto tímico NB. Niveles similares de injerto de células T se observan en la sangre periférica, el bazo, los ganglios linfáticos pancreáticos (PLN), y el ganglio linfático mesentérico (MLN) después de un trasplante con éxito de un injerto tímico.
| Pinzas de disección Bellas |
| Pinzas de disección Mediano (2) |
| Pinzas de disección Bellas (punta curvada) |
| Solución Betadine |
| 70% Etanol |
| Aguja de calibre 18 |
| Microscopio de disección w / fuente de luz |
| Dipipetas de transferencia sposable (2) |
| Medicamentos para el tratamiento del dolor: paracetamol |
| Toallitas estériles |
| Lámpara de calor |
| Afeitadora eléctrica |
| Isoflurano y el isoflurano vaporizador |
| Las suturas (rápida absorción, intestino normal) |
| Tijeras de disección |
| 9 mm clips de acero inoxidable de la herida |
| Herramienta de eliminación de clip de la herida |
| 1x PBS estéril |
| 60 mm Plato |
Tabla 1:. Materiales necesarios durante el trasplante quirúrgico tímico Lista de materiales necesarios utilizados para implantar el timo debajo de la cápsula renal del ratón receptor. La cantidad de materiales especificados aparece en paréntesis.
| Total Número de células T CD4 | Número total de células T CD8 | |
| Sangre | 1652 células / υl | 351 células / υl |
| Bazo | 11546617 | 4203299 |
| PLN | 1241789 | 364918 |
| MLN | 2182266 | 532059 |
Tabla 2. Número total de células T presentes en la sangre y los órganos periféricos linfoides de un receptor de trasplante tímico. El número total de células recuperadas de los órganos CD4 + y T CD8 +, así como de sangre periférica de un receptor de trasplante tímico recién nacido 6 semanas post- trasplante. Estos números son representativos de CD4 + y celularidad de células T CD8 + que se observa típicamente en los receptores de trasplante de timo recién nacidos y adultos exitosos.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2705HC | |
| PBS | GIBCO | 14190-144 | pH 7.4 |
| Betadine Solution | Purdue Products | 67618-150-17 | |
| 18 gauge needle | BD | 305195 | |
| Sutures (1.0 metric) | Ethicon | J493G | 18" (45cm) |
| AUTOCLIP Wound Clips (9mm) | Clay Adams® Brand | 427631 | |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-20 | Sterile, disposable |
| Mouse anti-CD3 Ab | eBioscience | 11-0031-85 | Clone: 1452C11 |
| Mouse anti-CD4 Ab | eBioscience | 48-0042-82 | Clone: RM4-5 |
| Mouse anti-CD8 Ab | eBioscience | 25-0081-82 | Clone: 53-6.7 |
| Lancet | Medipoint | Goldenrod 4mm | |
| Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium Salt | Invitrogen | P30253 | |
| 96-well round botton polypropylene plates | Corning | 3365 | |
| 1.2 ml polypropylene cluster tubes | Corning | 4401 | |
| 5 ml polypropylene round-bottom tubes | BD | 352002 | |
| 40uM Nylon Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
| 16% Paraformaldehyde Solution, EM Grade | Electron Microscopy Services | 15710 | Hazardous |
| Puralube Optical Ointment | Fisher Scientific | NC0138063 | |
| Lympholyte | Cedarlane | CL5030 | |
| 60 mm cell culture dish | Corning | 430196 | 60 mm x 15 mm, Sterile |
References
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