Abstract
De mekanismer, der regulerer effekten af thymus udvælgelse forbliver dårligt defineret. Den præsenteres her metode tillader in vivo analyser af udviklingen og udvælgelsen af T-celler, der er specifikke for selv og fremmede antigener. Tilgangen indebærer implantation af thymiske transplantater afledt af forskellige ældre mus i immundefekte SCID modtagere. Over en relativt kort periode modtagerne er fuldt rekonstitueret med T-celler afledt fra den implanterede thymus graft. Kun thymocyter podning thymus på tidspunktet for isolation undergår udvælgelse og udvikle sig til modne T-celler. Som sådan kan ændringer i naturen og specificiteten af de indpodede T-celler som en funktion af alder-afhængige thymiske hændelser vurderes. Selv teknisk ekspertise kræves for vellykket thymus transplantation, denne fremgangsmåde tilvejebringer en unik strategi til at studere in vivo en bred vifte af patologier, som skyldes eller et resultat af aberrerende brisselfunktion og / eller homeostaser.
Introduction
Den thymus er et organ, hvor kritiske hændelser i T-celle udvikling forekommer 1. Resident thymocytter, ved omlejring af T-cellereceptoren (TCR) α og β gener, gennemgå en række interaktioner med lymphostromal og antigenpræsenterende celler (APC) i de kortikale og medullære regioner i thymus 2. Thymus positiv selektion medieres af corticale thymiske epitelceller (TEC) til fremstilling af thymocytter der genkender antigene peptider i forbindelse med værten dominerende histokompatibilitetskompleks (MHC) klasse I og II-molekyler 2-3. Efterfølgende thymisk negativ udvælgelse indebærer rensning af autoreaktive thymocytter, drevet af en interaktion med medullær TEC eller dendritiske celler (DC) at de nuværende peptider afledt af selvproteiner bundet af MHC klasse I og II-molekyler 3. Slutresultatet af disse processer er etableringen af en pulje af modent CD4 + og CD8 + T-celler i stand til at reagere på et bredt spektrumaf fremmede antigener, mens udstille minimal reaktivitet til selvproteiner 4.
Effektiviteten af thymiske udvalg begivenheder påvirkes af en række faktorer, herunder thymus modning, hyppigheden af medullær og kortikal TEC, delmængde sammensætning thymisk DC, og kilden til thymiske forstadier 3. Især kan afvigende thymisk valg resultere i autoimmune 5 eller immundefekte patologier, som stammer fra nedsat negativ eller positiv selektion hhv. De molekylære begivenheder, der regulerer thymus udvælgelse, er imidlertid dårligt forstået. In vitro metoder såsom reaggregate thymiske organkulturer (RTOC) 6, har vist sig at være nyttige til analyse af grundlæggende begivenheder forbundet med thymus udvælgelse, men ikke fuldt ud rekapitulere dynamikken i igangværende in vivo arrangementer. Som følge heraf var dette thymus transplantation tilgang etableret til bedre undersøgelse thymocyt udvælgelse begivenheder in vivo 7
Denne protokol beskriver transplantere thymi fra nyfødte og voksne donormus i immundefekte scid recipientmus. Denne teknik tillader studiet af mekanismer, der regulerer positiv og negativ selektion thymus, samt thymus produktion af forskellige T-celle-undergrupper under ontogenese. Senest har denne tilgang blevet anvendt til at påvise, at effektiviteten af thymus valg er begrænset tidligt efter fødslen i mus fører til øget udvikling af autoreaktive T-celler, og en reduceret T-celle repertoire specifik for fremmede antigener 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De murine undersøgelser blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) fra University of North Carolina Chapel Hill og alle dyr pleje var i overensstemmelse med de IACUC retningslinjer.
1. Udarbejdelse af Newborn og Adult Thymi
- Forbered alle reagenser og udstyr før euthanizing donor mus.
- Sterilisere kirurgiske instrumenter ved autoklavering eller andre egnede metoder. Alle kirurgiske procedurer skal udføres under en laminar flow hætte for at opretholde sterile forhold og undgå forurening. Saml de nødvendige redskaber til udvinding af thymi fra donor mus.
- Fyld en 60 mm skål med sterilt 1x PBS (pH 7,4) og anbring på is inde i hætten. Dette vil blive brugt til kortvarigt butik Thymi udskåret fra donormus inden transplantation.
- Som pr etiske retningslinjer, aflive nyfødte donormus ved halshugning og voksne donor mus ved CO 2 kvælning efterfulgt af cervikal dislokation.
- For removal af thymus: Lå musen i en dorsal liggende stilling på en steril absorberende køkkenrulle og sprøjte med 70% ethanol før at lave et snit.
- Eksponere den abdominale og brysthulen ved at lave en midtlinjeincision gennem huden. Fold huden over brystet og forlemmer at afsløre brysthulen.
- Lav to laterale indsnit gennem membranen og brystkassen at eksponere den overlegne mediastinum og forreste brysthulen. Thymus bør være synligt som to hvide lapper umiddelbart over og støder op til hjertet.
- Tease hinanden bindevævet omkring thymus med fine pincet, foretage visse for ikke at forstyrre kapslen. Mens du holder tilbage brystkassen med en pincet, bruge et andet par pincet til at udtrække de to kamre af thymus ved at placere buede pincet under orglet og trække lodret. Dette kan gøres ved anvendelse af en dissektionsmikroskop til ekstraktion Thymi fra nyfødte mus.
- Placer thymus i 60 mm dish indeholdende steril 1 x PBS (pH 7,4) på is og separate thymiske lapper ved at skære gennem bindevæv isthmus. Fjern eventuelle rester fra thymus lapper gør sikker på ikke at beskadige kapslen, og skær brissel i et passende antal sektioner for transplantation.
- Du må ikke manipulere thymi fås fra nyfødte mus.
BEMÆRK: Bruges til højst to modtagende mus (1 lap per modtager). - Transplantation thymi opnået fra voksne mus i højst 4-6 recipientmus. Anvendelse af et par pincet, forsigtigt gribe fat én voksen thymus lap, som vist i figur 1, sender en thymus i tre lige store sektioner ved hjælp af kirurgiske sakse.
- Gentag trin 1,3-1,4 for hver donor mus. For at begrænse den tid, thymi er udsat, forberede 1 donor thymus ad gangen.
2. Thymus Implantation Under nyrekapslen
- Saml præ-steriliseret udstyr opført i tabel 1. Aseptiskteknik bør udnyttes i løbet af den procedure, for at forhindre at udsætte transplantation-modtagere til forurenede værktøjer eller reagenser.
- Før transplantation, veje og tag hver modtager mus.
- Opstil dissektionsmikroskop og anæstesi kredsløb i laminar flow hætte.
- Ved hjælp af en elektrisk barbermaskine, barbere den venstre side af modtageren musen og sikre, at ingen hår forbliver rundt i området bruges til at lave snittet.
- Tænd isofluoran vaporizer og bedøver musen under anvendelse af en dosis på mellem 1-2%. Konstatere ordentlig bedøvelse før du starter den kirurgiske procedure ved at kontrollere for et fravær af refleks efter tå knivspids.
- Efter musen er korrekt bedøvet, anvende veterinær salve på øjnene af musen til at forebygge tørhed og forberede musen til transplantation som følger:
- Anbring musen under dissektionsmikroskop i en ret lateral liggende stilling, så at den barberede side vender opad. Starting i centrum af det kirurgiske område, dispensere i en cirkulær bevægelse ved hjælp af en engangs transfer pipette 70% ethanol efterfulgt af povidon-iod (betadine). Gentag ethanol / betadine behandling 3 gange inden du gør et snit.
- Ved hjælp dissekere saks lave en 1-2 cm indsnit direkte over nyrerne.
- Ved hjælp af medium pincet fatte bindevæv ved siden af nyre og forsigtigt løfte nyren, så den ligger på toppen af muskulaturen. For at holde nyrerne eksponeret og på plads over muskulaturen, indsætte den ene arm af mellemstore pincet under nyre, med særlig vægt på ikke at forstyrre den renale ilium.
- For at forhindre væv udtørring, skylles nyren med steril 1 x PBS (pH 7,4) i hvert trin, indtil manipulation af nyrerne og nyre kapsel er færdig.
- Ved hjælp af fine pincet klemme og løfte kapslen nær kanten af nyrerne mest distalt for binyrerne at adskille den fra nyrerne.
- Brug en 18 gaugenål til at gøre et snit stort nok til at indsætte den forberedte stykke donor thymus (figur 2A). Foretage visse at holde kapsulære indsnit så små som muligt for at forhindre dislokation af implantatet over tid.
- Samtidig holde kapslen trukket væk fra nyren, bruge et andet par fine tænger til at indsætte implantatet under kapslen og skubbe thymus så langt frem fra kapsulære indsnit som muligt (figur 2B).
- Fjern tangen fra undersiden af nyre og forsigtigt returnere nyre tilbage på plads gennem snittet.
- Luk muskulaturen ved suturering bugvæggen og anvendelse betadine engang lukket. Efter suturering er færdig, gælder sårklemmer at lukke dermis og anvende betadine til det omkringliggende område.
- Retur musen til et bur, der er blevet opvarmet ved hjælp af en varmelampe.
- Overvåge hver postoperativ mus, indtil det genvinder fuld bevidsthed og mobilitet og placer ikke mus that har ikke genvundet efter anæstesi i et bur med andre dyr.
- Behandle mus med postoperative smertebehandling medicin efter behov. Give mus med postoperative analgetika såsom acetaminophen i drikkevandet i en koncentration på 1,6 mg / ml.
- Gentag trin 2,3-2,9 for hver modtager mus.
- Sørg for, at mus tilbagevenden til normal aktivitet inden for 1 time efter operationen. Overvåg postoperativ vægt, motoriske færdigheder, samt drikke og fodring aktivitet af hver mus til at bestemme komplikationer, der opstår som følge af transplantationen procedure.
BEMÆRK: Postoperativ vægttab, når der sammenlignes med præoperativ vægt, samt ændret mobilitet eller manglende spise eller drikke kan indikere komplikationer. - Overvåge T-celle rekonstituering i perifert blod ved blødning mus via tail nick efterfulgt af separation af lymfocytter ved hjælp Lympholyte celleseparation medier ifølge producentens specifikationer. Udføre T-celle characterization ved farvning lymfocytter med fluorescens konjugerede antistoffer specifikke for T-celle-markører CD3, CD4, og CD8, samt en levende død diskriminator såsom en fluorescens-aktiveret succinimidylester 8. Analyse som vist i figur 3 kan udføres via gating på singletter, levende celler og CD3-positive celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Succesen af denne fremgangsmåde er afhængig af minimal kirurgisk trauma samt nøjagtig positionering af transplantatet under nyrekapslen. Den thymiske podning skal skæres for at sikre passende størrelse thymiske sektioner for efterfølgende transplantation som vist i figur 1. Efter skematiske i figur 1, kan Thymi fra nyfødte eller voksne mus anvendes til vellykket subkapsulær transplantation med konsistente og reproducerbare T-celle engraftment resultater. Som nævnt, passende positionering af transplantatet under nyrekapslen er vigtige for opretholdelsen af langsigtet overlevelse, funktion og vaskularisering af implantatet. Som det ses i figur 2 skal thymiske transplantat placeres oven på nyrerne, nærmest binyrerne (anterior renalis), på den modsatte ende fra kapsulære indsnit (bagende over nyre). En vellykket thymus transplantation, når kombineret med en passende hæmatopoietisk miljø, kan rEmain produktiv på over 30 uger 7.
Efter transplantation, er engraftment vurderet ved flowcytometrisk analyse af T-celler opnået fra perifert blod. Figur 3 og tabel 2 viser den typiske niveau af T-celle transplantation observeret i organer og perifert blod i en transplantatmodtager 6 uger efter transplantationen. Under anvendelse af denne teknik, har vores gruppe tidligere vist kinetikken for CD4 + og CD8 + T-celle-rekonstituering i perifert blod over tid hos transplanterede modtagere af nyfødte og voksne Thymi. Kort fortalt, kan cirkulerende T-celler observeres i periferien inden for en uge efter operation og CD4 + og CD8 + T-celletal fortsætte med at stige, indtil den perifere T-celle rummet er fuldstændig rekonstitueret ved 5-6 uger efter transplantationen 7.
Figur 2:. Placering af kapsel-incision og placering af thymus graft en hensigtsmæssigt dimensioneret sektion fremstillet fra donoren thymus indsættes i subkapsulær rum skabt af et lille snit i den renale kapsel ved den bageste ende af nyre (A). Anterior til nyren, nærmest binyrerne (ikke afbildet) og ved den modsatte ende fra kapsulære indsnit, er den optimale position for implantatet, som indsættes under kapslen som vist i (B).
Figur 3. Bestemmelse vellykket transplantation via T-celle rekonstituering i perifert blod og lymfoide organer Flow. Cytometriske data er repræsentative for T-celle rekonstituering observeret seks uger efter transplantationen i en scid modtager af en NB thymisk graft. Tilsvarende niveauer af T-celle-transplantation observeres i perifert blod, milt, pancreas lymfeknude (PLN), og mesenteriske lymfeknude (MLN) efter en vellykket transplantation af et thymisk graft.
| Fine Dissecting pincet |
| Medium Dissecting pincet (2) |
| Fine Dissecting pincet (buet spids) |
| Betadinopløsning |
| 70% Ethanol |
| 18 gauge nål |
| Dissektionsmikroskop m / lyskilde |
| Disposable overførselspipetter (2) |
| Lægemidler til smertebehandling: Acetaminophen |
| Sterile servietter |
| Varmelampe |
| Elektrisk barbermaskine |
| Isofluran og isofluran fordamper |
| Suturer (hurtigt absorberende, almindelig gut) |
| Dissekere saks |
| 9 mm Rustfrit stål Wound klip |
| Sår klip afsked værktøj |
| Steril 1 x PBS |
| 60 mm Dish |
Tabel 1:. Materialer, der er nødvendige under kirurgisk thymus transplantation Liste over nødvendige materialer, der anvendes til at implantere thymus under nyrekapslen modtagerens musen. Mængden af specificerede materialer er angivet i parentes.
| Total Antal CD4 T-celler | Samlet antal CD8 T-celler | |
| Blod | 1.652 celler / υl | 351 celler / υl |
| Spleen | 11546617 | 4203299 |
| PLN | 1241789 | 364.918 |
| MLN | 2182266 | 532.059 |
Tabel 2. Samlet antal tilstedeværende T-celler i perifert blod og lymfoide organer af en thymisk transplantatmodtager. Samlede antal CD4 + og CD8 + T-celler udvundet fra organerne samt perifert blod fra en nyfødt thymisk transplantatmodtager 6 uger post transplantation. Disse tal er repræsentative for CD4 + og CD8 + T-celle-cellularitet, der typisk observeres i vellykkede nyfødte og voksne thymiske transplanterede patienter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2705HC | |
| PBS | GIBCO | 14190-144 | pH 7.4 |
| Betadine Solution | Purdue Products | 67618-150-17 | |
| 18 gauge needle | BD | 305195 | |
| Sutures (1.0 metric) | Ethicon | J493G | 18" (45cm) |
| AUTOCLIP Wound Clips (9mm) | Clay Adams® Brand | 427631 | |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-20 | Sterile, disposable |
| Mouse anti-CD3 Ab | eBioscience | 11-0031-85 | Clone: 1452C11 |
| Mouse anti-CD4 Ab | eBioscience | 48-0042-82 | Clone: RM4-5 |
| Mouse anti-CD8 Ab | eBioscience | 25-0081-82 | Clone: 53-6.7 |
| Lancet | Medipoint | Goldenrod 4mm | |
| Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium Salt | Invitrogen | P30253 | |
| 96-well round botton polypropylene plates | Corning | 3365 | |
| 1.2 ml polypropylene cluster tubes | Corning | 4401 | |
| 5 ml polypropylene round-bottom tubes | BD | 352002 | |
| 40uM Nylon Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
| 16% Paraformaldehyde Solution, EM Grade | Electron Microscopy Services | 15710 | Hazardous |
| Puralube Optical Ointment | Fisher Scientific | NC0138063 | |
| Lympholyte | Cedarlane | CL5030 | |
| 60 mm cell culture dish | Corning | 430196 | 60 mm x 15 mm, Sterile |
References
- Kappler, J. W., Roehm, N., Marrack, P. T cell tolerance by clonal elimination in the thymus. Cell. 49 (2), 273-280 (1987).
- Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nat. Rev. Immunol. 6, 127-135 (2006).
- Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don’t see). Nat. Rev. Immunol. 14 (6), 377-391 (2014).
- Schwartz, R. H. Acquisition of immunologic self-tolerance. Cell. 57 (7), 1073-1081 (1989).
- Kishimoto, H., Sprent, J. A defect in central tolerance in NOD mice. Nat. Immunol. 2 (11), 1025-1031 (2001).
- Anderson, G., Jenkinson, E. J. Investigating central tolerance with reaggregate thymus organ cultures. Methods. Mol. Biol. 380, 185-196 (2007).
- He, Q., et al. Thymic development of autoreactive T cells in NOD mice is regulated in an age-dependent manner. J. Immunol. 191 (12), 5858-5866 (2013).
- Stewart, C. C., Stewart, S. J. Chapter 6. Immunophenotyping. Current Protocols in Cytometry. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Rice, H. E., et al. Thymic transplantation for complete DiGeorge syndrome: medical and surgical considerations. J. Pediatr. Surg. 39 (11), 1607-1615 (2004).
- Markert, M. L., et al. Transplantation of thymus tissue in complete DiGeorge Syndrome. N. Engl. J. Med. 341, 1180-1189 (1999).
- Market, M. L., Devlin, B. H., McCarthy, E. A. Thymus transplantation. Clin. Immunol. 135 (2), 236-246 (2010).
- Wells, A. D., Li, X., Strom, T. B., Turka, L. A. The role of peripheral T-cell depletion in transplantation tolerance. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 356 (1409), 617-623 (2001).
- Albuquerque, A. S., et al. Human FOXN1-Deficiency is associated with ab double-negative and FoxP3+ T-cell expansions that are distinctly modulated upon thymic transplantation. PLoS One. 7 (5), e37042 (2012).
- Chinn, I. K., Milner, J. D., Scheinberg, P., Douek, D. C., Markert, M. L. Thymus transplantation restores the repertoires of forkhead box protein 3 (FoxP3)+ and FoxP3- T cells in complete DiGeorge anomaly. Clin Exp Immunol. 173 (1), 140-149 (2013).
- Savino, W. The thymus is a common target organ in infectious diseases. PLoS Pathog. 2 (6), e62 (2006).
