Abstract
De mechanismen die de werkzaamheid van de thymus selectie reguleren blijft slecht gedefinieerd. De hier gepresenteerde methode maakt in vivo analyse van de ontwikkeling en selectie van T-cellen specifiek voor zichzelf en vreemde antigenen. De aanpak omvat implantatie van thymus transplantaten afkomstig van verschillende leeftijd van muizen in immunodeficiënte scid ontvangers. Over een relatief korte tijdsperiode de ontvangers volledig gereconstitueerd met T-cellen verkregen uit het geïmplanteerde transplantaat thymus. Slechts thymocyten enten de zwezerik bij de isolatie onderworpen selectie en ontwikkelen tot rijpe T-cellen. Als zodanig kunnen veranderingen in de aard en specificiteit van het getransplanteerde T-cellen als functie van de leeftijd afhankelijke thymus events worden beoordeeld. Hoewel technische expertise vereist is voor succesvolle transplantatie thymus, deze werkwijze verschaft een unieke strategie in vivo te bestuderen uiteenlopende aandoeningen die als gevolg van of berusten op afwijkende thymus functie en / of zijn homeostasis.
Introduction
De thymus is een orgaan waarin kritieke gebeurtenissen in T cel ontwikkeling plaatsvinden 1. Resident thymocyten na herschikking van de T-celreceptor (TCR) α en β genen ondergaat aantal interacties met lymphostromal en antigen presenterende cellen (APC) in corticale en medullaire gebieden van de thymus 2. Thymus positieve selectie wordt gemedieerd door ritmische thymus epitheelcellen (TEC) om thymocyten die antigene peptiden herkennen in de context van ontvangst major histocompatibility complex (MHC) klasse I en II moleculen 2-3 opleveren. Daaropvolgende thymus negatieve selectie leidt zuivering van autoreactieve thymocyten, aangedreven door een interactie met medullaire TEC of dendritische cellen (DC) aanwezige peptiden afgeleid van zelf-eiwitten die door MHC klasse I en II moleculen 3 gebonden. Het resultaat van deze processen is het opzetten van een pool van volwassen CD4 + en CD8 + T-cellen kunnen reageren op een breed spectrumvan vreemde antigenen, terwijl vertonen een minimale reactiviteit om zichzelf eiwitten 4.
De efficiëntie van thymus selectie gebeurtenissen wordt beïnvloed door een groot aantal factoren, waaronder thymus rijping, frequentie medullaire en corticale TEC subset samenstelling thymus DC, en de bron van thymus precursors 3. Met name kunnen afwijkende thymus selectie resulteren in autoimmune 5 of immunodeficiënte pathologieën die voortkomen uit verminderde negatieve of positieve selectie, resp. De moleculaire gebeurtenissen reguleren thymus selectie worden echter slecht begrepen. In vitro benaderingen zoals reaggregate thymus orgaankweken (RTOC) 6, bleken nuttig voor het analyseren basic afspraken verbonden thymus keuze zijn, maar niet om de dynamiek van lopende volledig recapituleren in vivo evenementen. Hierdoor was dit thymus transplantatie benadering vastgesteld beter onderzoek thymocyte selectie gebeurtenissen in vivo 7
Dit protocol beschrijft het transplanteren thymi vanaf de geboorte en volwassen donor muizen in immunodeficiënte scid ontvangende muizen. Deze techniek maakt de studie van mechanismen die positieve en negatieve selectie thymus, en thymus productie van verschillende T cel subsets gedurende ontogenie regelen. Onlangs heeft deze benadering toegepast om aan te tonen dat de efficiëntie van thymus selectie is beperkt vroeg na geboorte in muizen leidt tot toegenomen ontwikkeling van autoreactieve T-cellen en een verminderde T-cel repertoire specifiek voor vreemde antigenen 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De muizen studies werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van de Universiteit van North Carolina in Chapel Hill en alle dierlijke zorg in overeenstemming was met de IACUC richtlijnen.
1. Voorbereiding van de Pasgeboren en Adult Thymi
- Bereid alle reagentia en apparatuur voorafgaand aan euthanasie donor muizen.
- Steriliseren chirurgische instrumenten in een autoclaaf of andere geschikte methoden. Alle chirurgische procedures moeten worden uitgevoerd onder een laminaire stroming kap om steriele omstandigheden te handhaven en te voorkomen. Monteer de instrumenten die nodig zijn voor de winning van thymi van donor muizen.
- Vul een 60 mm schaal met steriel 1x PBS (pH 7,4) en plaats op ijs in de kap. Dit zal even worden slaan thymi uitgesneden uit donor muizen voorafgaand aan de transplantatie.
- Zoals per ethische richtlijnen, euthanaseren pasgeboren donormuizen door onthoofding en volwassen donor muizen door CO 2 stikken, gevolgd door cervicale dislocatie.
- Voor removal van de thymus: Leg de muis in een dorsale liggende positie op een steriele absorberende keukenpapier en nevel met 70% ethanol alvorens een incisie.
- Expose de buik- en borstholte door een incisie door de huid. Vouw de huid over de borst en voorpoten om de borstholte te onthullen.
- Maak twee zijdelingse inkepingen door het diafragma en ribbenkast de superieure mediastinum bloot en voorste borstholte. De thymus moet zichtbaar als twee witte lobben onmiddellijk boven en grenzend aan het hart.
- Plagen elkaar het bindweefsel rond de thymus met fijne tang, het maken van bepaalde de capsule niet te verstoren. Terwijl tegenhouden de ribbenkast met een tang, moet een tweede pincet de twee lobben van de thymus extract door het positioneren gebogen pincet onder het orgel en verticaal trekken. Dit kan worden gedaan met behulp van een dissectie ruimte voor het extraheren thymi van pasgeboren muizen.
- Plaats de thymus in het 60 mm dish bevattende steriel 1x PBS (pH 7,4) op ijs en afzonderlijke lobben van de thymus snijden door de verbindende isthmus. Verwijder alle vuil van de thymus lobben het maken van bepaalde de capsule niet te beschadigen, en snijd de thymus in de juiste aantal secties voor transplantatie.
- Niet manipuleren van de thymi verkregen van pasgeboren muizen.
NB: Gebruikt voor maximaal twee ontvangende muizen (1 kwab per ontvanger). - Transplantatie de thymi verkregen van volwassen muizen in maximaal 4-6 ontvangende muizen. Met behulp van een pincet voorzichtig grijpen een volwassene thymus kwab, zoals getoond in figuur 1, snijd de thymus in drie gelijke delen middels chirurgische schaar.
- Herhaal stap 1,3-1,4 voor elke donor muis. Om de tijd thymi blootgesteld beperken bereiden 1 donor thymus tegelijk.
2. Thymus Implantatie Onder de Kidney Capsule
- Monteer de vooraf gesteriliseerde materiaal in Tabel 1 opgesomd. Adequate sterieletechniek moet worden gebruikt tijdens de procedure te voorkomen transplantaat ontvangers blootstelling aan besmet gereedschap of reagentia.
- Voorafgaand aan de transplantatie, wegen en tag elke ontvanger muis.
- Stel de dissectiemicroscoop en anesthesie circuit in de laminaire stroming kap.
- Met behulp van een elektrisch scheerapparaat, scheren de linkerkant van de ontvanger muis en waarborgen geen haar blijft rond het gebied waar de incisie.
- Schakel isofluorane vaporizer en verdoven de muis onder toepassing van een dosis van tussen 1-2%. Vergewissen juiste verdoving voorafgaand aan het starten van de chirurgische procedure door te controleren op een afwezigheid van reflex volgende teen knijpen.
- Nadat de muis goed verdoofd toepassing veterinaire zalf voor de ogen van de muis tot droog preventie van en voorbereiding muis voor transplantatie als volgt:
- Plaats de muis onder de microscoop ontleden in een rechter laterale liggende positie, zodat de geschoren zijde naar boven. Starting in het midden van het operatiegebied, afgeven in een cirkelvormige beweging met behulp van een wegwerp pipet 70% ethanol, gevolgd door povidon-jood (betadine). Herhaal de ethanol / betadine behandeling 3 maal alvorens een incisie.
- Met behulp van het ontleden van een schaar maken een 1-2 cm flank incisie direct boven de nieren.
- Met medium tang te grijpen bindweefsel naast de nier en til de nier zodat het bovenop de musculatuur ligt. Om de nier blootgelegd en in plaats over de spieren te houden, steekt een arm van medium tang onder de nieren, met speciale aandacht de renale ilium niet te verstoren.
- Om weefsel uitdroging te voorkomen, irrigeren de nieren steriele 1x PBS (pH 7,4) gedurende elke stap tot manipulatie van de nieren en nierkapsel voltooid.
- Met behulp van fijne tang knijpen en til de capsule in de buurt van de rand van de nier meest distale aan de bijnieren om het scheiden van de nier.
- Gebruik een 18 gaugenaald een insnijding groot genoeg om de voorbereide stuk donor thymus (figuur 2A) te voegen. Zorg ervoor dat het capsulair insnijding zo klein mogelijk verplaatsing van het implantaat in de tijd te voorkomen houden.
- Houd de capsule weggetrokken van de nier, moet een tweede paar fijne tang om het implantaat onder de capsule voegen en druk de thymus zo ver naar voren vanuit de capsulaire insnijding mogelijk (figuur 2B).
- Verwijder de tang van onder de nieren, en voorzichtig terug de nier terug op zijn plaats door de incisie.
- Sluit de spieren hechten door de peritoneale wand en het toepassen betadine eenmaal gesloten. Nadat hechten voltooid, toepassing wondklemmen de dermis te sluiten en betadine toepassing op de omgeving.
- Breng de muis een kooi die is verwarmd met behulp van een warmtelamp.
- Monitor elke post-operatieve muis totdat het herwint volledige bewustzijn en mobiliteit en plaats geen muizen that nog niet hersteld na de anesthesie in een kooi met andere dieren.
- Behandel muizen met postoperatieve pijnbestrijding medicijnen als dat nodig is. Voorzie muizen met postoperatieve pijnstillers zoals acetaminofen in het drinkwater bij een concentratie van 1,6 mg / ml.
- Herhaal stap 2,3-2,9 voor elke ontvanger muis.
- Zorg ervoor dat de muizen terugkeer naar normale activiteit binnen 1 uur na de operatie. Monitor postoperatieve gewicht, motoriek, alsmede de drink- en voedselopname van elke muis complicaties ontstaan als gevolg van de transplantatie te bepalen.
OPMERKING: Post-operatieve gewichtsverlies, vergeleken met pre-operatieve gewicht, alsook veranderde mobiliteit of niet eten of drinken kan complicaties geven. - Monitor T cel reconstitutie in perifeer bloed door bloeden muizen via tail nick vervolgens afscheiding van lymfocyten gebruik Lympholyte cell scheidingsmedium volgens de specificaties van de fabrikant. Volbrengen T-cel characterizatie door kleuring lymfocyten met fluorescent geconjugeerde antilichamen specifiek voor T-cel markers CD3, CD4 en CD8, alsmede een levend dode discriminator zoals een fluorescent geactiveerde succinimidylester 8. Analyse zoals getoond in figuur 3 kan worden bereikt via gating op singlets, levende cellen en CD3 positieve cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het succes van deze procedure is afhankelijk minimaal chirurgisch trauma en de nauwkeurige positionering van het implantaat onder het nierkapsel. De thymus enten wordt gesneden gepaste wijze gedimensioneerd thymus secties te worden verplant zie figuur 1. Na het schema in figuur 1, kan thymi van pasgeboren of volwassen muizen worden gebruikt voor succesvolle transplantatie subcapsular met consistente en reproduceerbare T cel engraftment resultaten. Zoals gezegd, passende positionering van de graft onder de nier capsule is belangrijk voor het behoud op lange termijn overleven, functie en vascularisatie van het transplantaat. Zoals blijkt uit figuur 2, dient de thymus transplantaat bovenop de nieren, het dichtst bij de bijnieren (anterior van de nier), aan de andere kant van de capsulaire insnijding (posterior van de nier) geplaatst. Een succesvolle thymus transplantatie, wanneer gekoppeld aan een geschikte hematopoietische omgeving, kan rEmain productief dan 30 weken 7.
Na transplantatie wordt engraftment bepaald door flow cytometrische analyse van T-cellen verkregen uit perifeer bloed. Figuur 3 en Tabel 2 tonen de typische mate van T-cel engraftment waargenomen in organen en perifere bloed in een transplantaatontvanger 6 weken na transplantatie. Met deze techniek heeft onze fractie eerder aangetoond de kinetiek van CD4 + en CD8 + T cellen in perifeer bloed reconstitutie tijd in ontvangers van pasgeborenen en volwassenen thymi. In het kort kan circulerende T-cellen in de periferie worden waargenomen binnen één week na de operatie en CD4 + en CD8 + T-cel aantallen blijven stijgen totdat de perifere T-cel compartiment volledig is opgelost in 5-6 weken na transplantatie 7.
Figuur 2:. Positie van capsulair insnijding en plaatsing van thymus graft Een geschikte grootte bereid gedeelte van de donor thymus wordt in de subcapsulaire ruimte die door een kleine incisie in het nierkapsel aan het achterste uiteinde van de nier (A). Juist voor de nier, het dichtst bij de bijnieren (niet afgebeeld) en aan het tegenoverliggende uiteinde van de capsulaire insnijding, is de optimale positie van het implantaat die onder de capsule wordt geplaatst zoals in (B).
Figuur 3. Bepalen succesvolle enting via T cel terugvorming in perifeer bloed en lymfoïde organen. Flowcytometrische gegevens representatief T cel reconstitutie geobserveerd 6 weken na transplantatie in een ontvanger van een scid NB thymus graft. Vergelijkbare niveaus van T-cel engraftment waargenomen in perifeer bloed, milt, alvleesklier lymfeklieren (PLN) en de mesenterische lymfeklier (MLN) na succesvolle transplantatie van een transplantaat thymus.
| Fine Dissecting tang |
| Medium Ontleden tang (2) |
| Fine ontleden tang (gebogen tip) |
| Betadine Oplossing |
| 70% Ethanol |
| 18 gauge naald |
| Dissectiemicroscoop w / lichtbron |
| Disposable overdracht pipetten (2) |
| Geneesmiddelen voor pijnbestrijding: Paracetamol |
| Steriele doekjes |
| Warmtelamp |
| Elektrisch scheerapparaat |
| Isofluraan en isofluraan vaporizer |
| Hechtingen (snel absorberende, plain gut) |
| Ontleden Schaar |
| 9 mm RVS Wound clips |
| Wond clip removal tool |
| Steriel 1x PBS |
| 60 mm Dish |
Tabel 1:. Benodigde materialen tijdens chirurgische thymus transplantatie Lijst van benodigde materialen gebruikt om de thymus onder het nierkapsel van de ontvanger muis implanteren. De hoeveelheid specifieke materialen wordt in haakjes.
| Total aantal CD4 T-cellen | Totaal aantal CD8 T-cellen | |
| Bloed | 1652 cellen / υl | 351 cellen / υl |
| Milt | 11546617 | 4.203.299 |
| PLN | 1.241.789 | 364.918 |
| MLN | 2.182.266 | 532.059 |
Tabel 2. Het totale aantal T-cellen aanwezig in perifeer bloed en lymfoïde organen van een thymus transplantaatontvanger. Totaal aantal CD4 + en CD8 + T-cellen gewonnen uit de organen en perifere bloed van een pasgeboren thymus transplantatieontvanger 6 weken post- transplantatie. Deze cijfers zijn representatief voor CD4 + en CD8 + T cel cellulariteit die kenmerkend wordt waargenomen bij succesvolle pasgeborenen en volwassenen thymus transplantatie ontvangers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2705HC | |
| PBS | GIBCO | 14190-144 | pH 7.4 |
| Betadine Solution | Purdue Products | 67618-150-17 | |
| 18 gauge needle | BD | 305195 | |
| Sutures (1.0 metric) | Ethicon | J493G | 18" (45cm) |
| AUTOCLIP Wound Clips (9mm) | Clay Adams® Brand | 427631 | |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-20 | Sterile, disposable |
| Mouse anti-CD3 Ab | eBioscience | 11-0031-85 | Clone: 1452C11 |
| Mouse anti-CD4 Ab | eBioscience | 48-0042-82 | Clone: RM4-5 |
| Mouse anti-CD8 Ab | eBioscience | 25-0081-82 | Clone: 53-6.7 |
| Lancet | Medipoint | Goldenrod 4mm | |
| Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium Salt | Invitrogen | P30253 | |
| 96-well round botton polypropylene plates | Corning | 3365 | |
| 1.2 ml polypropylene cluster tubes | Corning | 4401 | |
| 5 ml polypropylene round-bottom tubes | BD | 352002 | |
| 40uM Nylon Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
| 16% Paraformaldehyde Solution, EM Grade | Electron Microscopy Services | 15710 | Hazardous |
| Puralube Optical Ointment | Fisher Scientific | NC0138063 | |
| Lympholyte | Cedarlane | CL5030 | |
| 60 mm cell culture dish | Corning | 430196 | 60 mm x 15 mm, Sterile |
References
- Kappler, J. W., Roehm, N., Marrack, P. T cell tolerance by clonal elimination in the thymus. Cell. 49 (2), 273-280 (1987).
- Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nat. Rev. Immunol. 6, 127-135 (2006).
- Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don’t see). Nat. Rev. Immunol. 14 (6), 377-391 (2014).
- Schwartz, R. H. Acquisition of immunologic self-tolerance. Cell. 57 (7), 1073-1081 (1989).
- Kishimoto, H., Sprent, J. A defect in central tolerance in NOD mice. Nat. Immunol. 2 (11), 1025-1031 (2001).
- Anderson, G., Jenkinson, E. J. Investigating central tolerance with reaggregate thymus organ cultures. Methods. Mol. Biol. 380, 185-196 (2007).
- He, Q., et al. Thymic development of autoreactive T cells in NOD mice is regulated in an age-dependent manner. J. Immunol. 191 (12), 5858-5866 (2013).
- Stewart, C. C., Stewart, S. J. Chapter 6. Immunophenotyping. Current Protocols in Cytometry. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Rice, H. E., et al. Thymic transplantation for complete DiGeorge syndrome: medical and surgical considerations. J. Pediatr. Surg. 39 (11), 1607-1615 (2004).
- Markert, M. L., et al. Transplantation of thymus tissue in complete DiGeorge Syndrome. N. Engl. J. Med. 341, 1180-1189 (1999).
- Market, M. L., Devlin, B. H., McCarthy, E. A. Thymus transplantation. Clin. Immunol. 135 (2), 236-246 (2010).
- Wells, A. D., Li, X., Strom, T. B., Turka, L. A. The role of peripheral T-cell depletion in transplantation tolerance. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 356 (1409), 617-623 (2001).
- Albuquerque, A. S., et al. Human FOXN1-Deficiency is associated with ab double-negative and FoxP3+ T-cell expansions that are distinctly modulated upon thymic transplantation. PLoS One. 7 (5), e37042 (2012).
- Chinn, I. K., Milner, J. D., Scheinberg, P., Douek, D. C., Markert, M. L. Thymus transplantation restores the repertoires of forkhead box protein 3 (FoxP3)+ and FoxP3- T cells in complete DiGeorge anomaly. Clin Exp Immunol. 173 (1), 140-149 (2013).
- Savino, W. The thymus is a common target organ in infectious diseases. PLoS Pathog. 2 (6), e62 (2006).
