Abstract
Die Mechanismen, die die Wirksamkeit von Thymus Auswahl, zu regeln schlecht definiert. Die hier vorgestellte Methode ermöglicht in vivo-Analysen von der Entwicklung und Auswahl bestimmter für Selbst- und Fremdantigene T-Zellen. Der Ansatz beinhaltet die Implantation von Thymus-Transplantate aus verschiedenen alten Mäusen in immundefiziente SCID-Empfänger ab. Über einen relativ kurzen Zeitraum die Empfänger sind mit T-Zellen aus dem Thymus implantierten Transplantats abgeleitet rekonstituiert. Nur Thymozyten Impfen der Thymus zum Zeitpunkt der Trennung zu unterziehen Auswahl und entwickeln sich zu reifen T-Zellen. Als solches können Änderungen in der Art und Spezifität der transplantierten T-Zellen als Funktion der altersabhängigen Thymus Ereignisse bewertet werden. Obwohl technische Know-how für erfolgreiche Thymus-Transplantation erforderlich ist, stellt dieses Verfahren eine einzigartige Strategie, um in vivo zu untersuchen eine breite Palette von Krankheiten, die durch oder aufgrund der abweichenden Thymus-Funktion und / oder sind homeostasist.
Introduction
Der Thymus ist ein Organ, in dem kritische Ereignisse in T-Zell-Entwicklung entstehen 1. Resident Thymozyten auf Umlagerung des T-Zell-Rezeptor (TCR) α und β-Gene, durchlaufen eine Reihe von Interaktionen mit lymphostromal und Antigen-präsentierenden Zellen (APC) in der Rinde und Mark Regionen des Thymus 2. Thymus-positive Selektion durch kortikale Thymusepithelzellen (TEC) vermittelte, um Thymozyten, die antigene Peptide im Kontext der Host Major Histocompatibility Complex (MHC) Klasse I und II-Moleküle erkennen 2-3 herzustellen. Nachfolgende Thymus negative Selektion bringt Spülen von autoreaktiven Thymozyten, durch eine Wechselwirkung mit Mark TEC oder dendritischen Zellen (DC), die vorhanden Peptide aus Selbstproteine durch MHC-Klasse-I und II-Moleküle gebunden 3 abgeleitet angetrieben. Das Ergebnis dieser Prozesse ist die Einrichtung eines Pools von reifen CD4 + und CD8 + T-Zellen in der Lage, ein breites Spektrum reagierenFremdgene während sie eine minimale Reaktivität mit Eigenproteine 4.
Die Effizienz des Thymus Auswahlereignisse durch eine Vielzahl von Faktoren, einschließlich Thymus-Reifung, die Häufigkeit der Mark und kortikaler TEC Teilzusammensetzung Thymus DC, und die Source des Thymus Vorstufen 3 beeinflusst. Bemerkenswert ist, können abweichende Thymus-Auswahl bei Autoimmun 5 oder immundefizienten Pathologien, die von eingeschränkter negative oder positive Selektion entstehen beziehungsweise führen. Die molekularen Ereignisse regulieren Thymus Auswahl, sind jedoch kaum verstanden. In vitro-Ansätze wie reaggregieren Thymus-Organkulturen (RTOC) 6, haben sich als nützlich für die Analyse von Basisereignissen mit Thymus Auswahl zugeordnet ist, aber nicht, um die Dynamik der laufenden vollständig rekapitulieren In-vivo-Veranstaltungen. Als Folge wurde dieses Thymus-Transplantation-basierten Ansatz für eine bessere Studien thymocyte Auswahl Veranstaltungen in vivo 7 fest
Dieses Protokoll beschreibt die Transplantation Thymi von Neugeborenen und erwachsenen Spendermäusen in immundefiziente SCID-Empfängermäuse. Diese Technik erlaubt die Untersuchung der Mechanismen, die positive und negative Selektion Thymus sowie Thymusfunktion verschiedener T-Zell-Teilmengen während der Ontogenese regulieren. In jüngster Zeit wurde dieser Ansatz verwendet, um zu zeigen, dass die Effizienz des Thymus Auswahl früh nach der Geburt in Mäusen führt zu einer erhöhten Entwicklung von autoreaktiven T-Zellen, und für die Fremdantigene 7 eine reduzierte T-Zell-Repertoire spezifisch.
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Protocol
Die Maus-Studien wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) der University of North Carolina in Chapel Hill und alle genehmigten Tierpflege wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien IACUC.
1. Herstellung von Neugeborenen und Erwachsene Thymi
- Bereiten Sie alle Reagenzien und Geräte vor euthanizing Spendermäusen.
- Sterilisieren chirurgischer Instrumente durch Autoklavierung oder andere geeignete Verfahren. Alle chirurgischen Verfahren müssen unter einer Haube mit laminarer Strömung, um sterile Bedingungen aufrecht zu erhalten und eine Verunreinigung zu vermeiden, durchgeführt werden. Montieren Sie die Werkzeuge für die Gewinnung von Thymi von Spendermäusen benötigt.
- Füllen Sie einen 60-mm-Schale mit steriler 1x PBS (pH 7,4) und auf Eis in der Kapuze. Dies wird zu kurz store Thymi von Spendermäusen vor der Transplantation entnommen werden.
- Nach ethischen Richtlinien, einschläfern Neugeborenen Spendermäusen durch Enthauptung und erwachsene Spendermäusen durch CO 2 Ersticken durch Genickbruch folgte.
- Für removal des Thymus: Legen Sie die Maus in einer dorsalen Rückenlage auf einem sterilen saugfähigen Papiertuch und sprühen mit 70% Ethanol vor der einen Einschnitt.
- Setzen Sie die Bauch- und Brusthöhle, indem Sie einen Mittelschnitt durch die Haut. Falten Sie die Haut über der Brust und Vorderbeine, um die Brusthöhle zu offenbaren.
- Machen Sie zwei seitliche Schnitte durch das Zwerchfell und Brustkorb, den oberen Mediastinum aussetzen und vorderen Brusthöhle. Der Thymus ist als zwei weißen Lappen unmittelbar über sichtbare und neben dem Herzen sein.
- Necken neben der rund um die Thymusdrüse mit feinen Pinzette Bindegewebe, so dass bestimmte nicht, um die Kapsel zu stören. Während den Brustkorb mit einer Pinzette zurückhalten, verwenden Sie eine zweite Zange, um die zwei Lappen des Thymus durch die Positionierung einer gebogenen Pinzette unter der Orgel und vertikal ziehen zu extrahieren. Dies kann unter Verwendung eines Binokular zur Extraktion Thymi von neugeborenen Mäusen durchgeführt werden.
- Setzen Sie den Thymus in der 60 mm dish, die steriles 1x PBS (pH 7,4) auf Eis und separater Thymus Lappen durch Durchtrennen des Bindelandenge. Entfernen Sie alle Fremdkörper aus dem Thymus Lappen mit dem bestimmte nicht, um die Kapsel beschädigt werden, und schneiden Sie die Thymus in die entsprechende Anzahl von Abschnitten für die Transplantation.
- Manipulieren Sie nicht den von neugeborenen Mäusen erhalten Thymi.
HINWEIS: Wird für maximal zwei Empfängermäuse (1 Lappen pro Empfänger). - Transplantation die aus erwachsenen Mäusen erhalten Thymi in maximal 4-6 Empfängermäuse. Mit Hilfe einer Pinzette vorsichtig greifen ein Erwachsener Thymus Lappen, wie in Abbildung 1 dargestellt ist, schneiden Sie den Thymus in drei gleiche Abschnitte mit chirurgische Scheren.
- Wiederholen Sie die Schritte 1,3-1,4 für jede Spendermaus. Um die Zeit zu begrenzen Thymi ausgesetzt sind, bereiten 1 Spender Thymus zu einem Zeitpunkt.
2. Thymus Implantation unter die Nierenkapsel
- Montieren Sie den pre-sterilisiert Ausrüstung in Tabelle 1 aufgeführt. AseptischeTechnik sollte im Verlauf des Verfahrens Belichten Transplantatrezipienten kontaminierte Werkzeuge oder Reagenzien zu verhindern, verwendet werden.
- Vor der Transplantation wiegen und etikettieren jeden Empfänger der Maus.
- Einrichten des Binokular und Anästhesie-Schaltung in der Sterilbank.
- Mit einem elektrischen Rasierer, rasieren Sie die linke Seite der Empfängermaus und sicherzustellen, dass keine Haare rund um die verwendet werden, um den Schnitt zu machen Bereich bleibt.
- Schalten Sie Isofluoran Verdampfer und betäuben die Maus mit einer Dosis von zwischen 1-2%. Ermitteln ordnungsgemäße Betäubung vor Beginn des chirurgischen Eingriffs durch Prüfen auf die Abwesenheit von reflex folgenden toe Prise.
- Nachdem die Maus ordnungsgemäß betäubt wird, gelten veterinär Salbe auf den Augen der Maus, um Trockenheit zu verhindern und bereiten Sie die Maus für die Transplantation, wie folgt:
- Bewegen Sie die Maus unter dem Binokular in einer rechten Seitenlage, so dass die rasierte Seite nach oben zeigt. Starting in der Mitte der OP-Bereich, verzichten in einer kreisförmigen Bewegung mit einem Einmaltransferpipette 70% Ethanol, gefolgt von PVP-Jod (Betadine). Wiederholen Sie die Ethanol / betadine Behandlung 3 mal vor einen Einschnitt.
- Verwendung Präparierscheren einen 1-2 cm Flankenschnitt direkt über die Niere.
- Verwendung Medium Pinzette fassen Bindegewebe neben der Niere und heben die Nieren, so dass es oben auf der Muskulatur liegt. Um die Niere freigelegt und an Ort und Stelle über die Muskulatur zu halten, legen Sie einen Arm des Mediums Zange unterhalb der Niere, wobei besonderes Augenmerk nicht auf die Nieren ilium stören.
- Um Gewebeaustrocknung zu verhindern, zu bewässern die Niere mit sterilem 1x PBS (pH 7,4) bei jedem Schritt, bis Manipulation der Nieren und Nierenkapsel ist abgeschlossen.
- Verwenden feinen Pinzette kneifen und heben Sie die Kapsel in der Nähe der Kante des Nieren meisten distal zu den Nebennieren, um es von der Niere zu trennen.
- Verwenden Sie eine 18-Gauge-Nadel, um einen Einschnitt groß genug, um das vorbereitete Stück Spender Thymus (2A) einfügen zu machen. Stellen Sie sicher, um die Kapselinzision so klein wie möglich zu Dislokation der Prothese im Laufe der Zeit zu verhindern.
- Während die Kapsel löste sich von der Niere, verwenden Sie ein zweites Paar von feinen Pinzette, um das Transplantat unter der Kapsel einlegen und drücken Sie den Thymus so weit nach vorne aus dem Kapselinzision wie möglich (2B).
- Entfernen Sie die Zange von unterhalb der Niere, und sanft die Niere wieder zurück an seinen Platz durch den Einschnitt.
- Schließen Sie die Muskulatur durch Annähen der Bauchwand und die Anwendung betadine einmal geschlossen. Nach der vollständigen Naht ist, gelten Wundklammern, um die Dermis zu schließen und betadine in die Umgebung.
- Gibt die Maus in einen Käfig mit einer Wärmelampe, die aufgewärmt hat.
- Überwachen sich postoperative Maus, bis es volle Bewusstsein und Mobilität gewinnt und stellen Sie keine Mäuse that wurden nicht nach Betäubung in einen Käfig mit anderen Tieren gewonnen.
- Behandlung von Mäusen mit postoperativen Schmerztherapie Medikamente nach Bedarf. Stellen Mäuse mit postoperativen Schmerzmittel wie Paracetamol im Trinkwasser in einer Konzentration von 1,6 mg / ml.
- Wiederholen Sie die Schritte 2,3-2,9 für jeden Empfänger der Maus.
- Stellen Sie sicher, dass Mäuse, den normalen Aktivitäten innerhalb 1 Stunde nach der Operation. Überwachen Sie die postoperative Gewicht, Motorik, sowie das Tränken und Futter Aktivität jeder Maus, um Komplikationen, die sich als Folge der Transplantation zu bestimmen.
HINWEIS: Post-operative Gewichtsverlust im Vergleich zu präoperativen Gewicht sowie veränderte Mobilität oder Misserfolg zu essen oder trinken können Komplikationen hinweisen. - Überwachen T Zellrekonstitution im peripheren Blut durch Ausbluten Mäusen über die Schwanzvene nick gefolgt von der Abtrennung der Lymphozyten mit Lympholyte Zelltrennungsmedien nach den Angaben des Herstellers. Erreichen T-Zell-characterization durch Anfärben Lymphozyten mit fluoreszenz konjugierte Antikörper spezifisch für T-Zellen-Marker CD3, CD4, CD8, sowie eine Live toten Diskriminator wie einem fluoreszenz aktivierte Succinimidylester 8. Analyse, wie in Figur 3 gezeigt ist über Gating Singuletts, lebenden Zellen und mit CD3-positiven Zellen erreicht werden.
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Representative Results
Der Erfolg dieses Verfahrens hängt von minimalen chirurgischen Traumas sowie die genaue Positionierung der Prothese unterhalb der Nierenkapsel. Der Thymus Transplantat sollte geschnitten angemessen sicherzustellen bemessen Thymus Abschnitte für eine nachfolgende Transplantation, wie in Abbildung 1 dargestellt. Nach der schematischen Darstellung in Figur 1 kann Thymi aus neugeborenen oder erwachsenen Mäusen für eine erfolgreiche Transplantation subkapsuläre mit eindeutigen und reproduzierbaren T Zelltransplantationsergebnisse verwendet werden. Wie erwähnt, ist eine geeignete Positionierung des Implantats unter die Nierenkapsel der Aufrechterhaltung langfristige Überleben, die Funktion und die Vaskularisation des Transplantates wichtig. Wie in Figur 2 zu sehen ist, sollte der Thymus Transplantat oberhalb der Niere, am nächsten an den Nebennieren (anterior der Niere), am gegenüberliegenden Ende von den Kapseleinschnitt (posterior der Niere) platziert werden. Eine erfolgreiche Thymus-Transplantation, wenn sie mit einem geeigneten hämatopoetischen Umgebung können rEmain produktiv über 30 Wochen 7.
Nach der Transplantation wird Verpflanzung durch durchflusszytometrische beurteilt Analysen der T-Zellen aus dem peripheren Blut erhalten werden. Figur 3 und Tabelle 2 zeigen das typische Niveau der T in den Organen und im peripheren Blut bei einem Transplantatempfänger 6 Wochen nach der Transplantation beobachtet Zelle Transplantation. Mit dieser Technik, unsere Gruppe hat bereits die Kinetik der CD4 + und CD8 + T-Zell-Rekonstitution im peripheren Blut im Laufe der Zeit bei Transplantatempfängern von Neugeborenen und Erwachsenen Thymi gezeigt. Kurz gesagt, kann zirkulierenden T-Zellen in der Peripherie innerhalb einer Woche nach der Operation beobachtet werden und CD4 + und CD8 + T-Zellzahlen weiter zunehmen, bis die periphere T-Zellenraum vollständig bei 5-6 Wochen nach Transplantation 7 rekonstituiert.
Fig. 2: Stellung der Kapselinzision und Platzierung des Thymus Transplantat eine entsprechend bemessene Abschnitt vom Spender Thymus hergestellt wird in den Raum, der durch subkapsuläre einen kleinen Einschnitt geschaffen, in die Nierenkapsel zu dem hinteren Ende der Niere (A) eingeführt ist. Ventral der Niere, in der Nähe der Nebennieren (nicht abgebildet) und an dem gegenüberliegenden Ende von dem Kapselinzision, ist die optimale Position für das Transplantat, das unterhalb der Kapsel eingesetzt ist, wie in (B) gezeigt.
Figur 3. Bestimmung erfolgreiche Transplantation über T-Zell-Rekonstitution in peripherem Blut und Lymphorganen. Durchflusszytometrische Daten sind repräsentativ für T-Zell-Rekonstitution beobachtet 6 Wochen nach der Transplantation in einen Empfänger einer scid NB Thymus Transplantats. Ähnliche Niveaus der T-Zell-Transplantation sind in dem peripheren Blut, der Milz, Pankreas-Lymphknoten (PLN) beobachtet, und die mesenterischen Lymphknoten (MLN) nach erfolgter Transplantation einer Thymus-Transplantats.
| Feine Pinzette |
| Medium Pinzette (2) |
| Feine Dissektionszangen (gebogener Spitze) |
| Betadine Lösung |
| 70% Ethanol |
| 18-Gauge-Nadel |
| Binokular w / Lichtquelle |
| Disposable Transferpipetten (2) |
| Medikamente zur Schmerztherapie: Acetaminophen |
| Sterile Tücher |
| Wärmelampe |
| Elektrorasierer |
| Isofluran und Isofluran Verdampfer |
| Nahtmaterial (schnell absorbierende, plain gut) |
| Präparierschere |
| 9 mm Edelstahl Wundklammern |
| Wundklammer-Tool zum Entfernen |
| Sterile 1x PBS |
| 60 mm Dish |
Tabelle 1:. Materialien bei chirurgischen Thymus-Transplantation erforderlich Liste der verwendet wird, um den Thymus unter die Nierenkapsel der Empfängermaus implantieren notwendigen Materialien. Die Menge der genannten Materialien ist in Klammern aufgeführt.
| Total Anzahl der CD4-Zellen | Gesamtzahl der CD8 T-Zellen | |
| Blut | 1.652 Zellen / υl | 351 Zellen / υl |
| Milz | 11546617 | 4203299 |
| PLN | 1241789 | 364.918 |
| MLN | 2182266 | 532.059 |
Tabelle 2 Anzahl der T im peripheren Blut und Lymphoidorganen eines Thymus Transplantatempfänger vorhandenen Zellen. Gesamtzahl der CD4 + und CD8 + T-Zellen aus den Organen gewonnen sowie peripheren Blut eines neugeborenen Thymus Transplantatempfänger 6 Wochen post- Transplantation. Diese Zahlen sind repräsentativ für CD4 + und CD8 + T-Zell-Zellularität, die typischerweise in erfolgreicher neugeborenen und adulten Thymus Transplantationspatienten beobachtet wird.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2705HC | |
| PBS | GIBCO | 14190-144 | pH 7.4 |
| Betadine Solution | Purdue Products | 67618-150-17 | |
| 18 gauge needle | BD | 305195 | |
| Sutures (1.0 metric) | Ethicon | J493G | 18" (45cm) |
| AUTOCLIP Wound Clips (9mm) | Clay Adams® Brand | 427631 | |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-20 | Sterile, disposable |
| Mouse anti-CD3 Ab | eBioscience | 11-0031-85 | Clone: 1452C11 |
| Mouse anti-CD4 Ab | eBioscience | 48-0042-82 | Clone: RM4-5 |
| Mouse anti-CD8 Ab | eBioscience | 25-0081-82 | Clone: 53-6.7 |
| Lancet | Medipoint | Goldenrod 4mm | |
| Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium Salt | Invitrogen | P30253 | |
| 96-well round botton polypropylene plates | Corning | 3365 | |
| 1.2 ml polypropylene cluster tubes | Corning | 4401 | |
| 5 ml polypropylene round-bottom tubes | BD | 352002 | |
| 40uM Nylon Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
| 16% Paraformaldehyde Solution, EM Grade | Electron Microscopy Services | 15710 | Hazardous |
| Puralube Optical Ointment | Fisher Scientific | NC0138063 | |
| Lympholyte | Cedarlane | CL5030 | |
| 60 mm cell culture dish | Corning | 430196 | 60 mm x 15 mm, Sterile |
References
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