בידוד והשתלה של שתלי הרתי Murine בני שונים.

Abstract

המנגנונים המסדירים את היעילות של בחירת הרתי יישארו לא מוגדר. השיטה שהוצגה כאן מאפשרת in vivo ניתוחים של הפיתוח והבחירה של תאי T ספציפיים לעצמית ואנטיגנים זרים. הגישה כרוכה השתלה של שתלי הרתי נגזרים מעכברים בגילים שונים למקבלי SCID immunodeficient. על פני תקופה קצרה יחסית של זמן הנמענים מחדש באופן מלא עם תאי T הנגזרים משתל התימוס המושתל. רק thymocytes זריעת התימוס בעת הבידוד לעבור בחירה ולהתפתח לתאי T בשלים. ככזה, שינויים באופי והספציפיות של תאי T engrafted כפונקציה של אירועי הרתי תלוי גיל ניתן להעריך. למרות שנדרשה מומחיות טכנית להשתלה הרתי מוצלחת, שיטה זו מספקת אסטרטגיה ייחודית ללמוד in vivo מגוון רחב של פתולוגיות המגיעות לי או תוצאה של פונקצית הרתי חריגה ו / או homeostasהוא.

Introduction

התימוס הוא איבר שבו אירועים קריטיים בהתפתחות תאי T להתרחש ^1. thymocytes התושב, עם סידורו מחדש של הקולטן תא T α (TCR) וגני β, לעבור סדרה של אינטראקציות עם תאי lymphostromal והצגת אנטיגן (APC) באזורים בקליפת המוח והלשדיים של בלוטת התימוס ^2. בחירה חיובית הרתי מתווכת על ידי תאי אפיתל הרתי קליפת המוח (TEC) לייצר thymocytes שמכיר פפטידים אנטיגני בהקשר של מעמד מארח גדול המורכב histocompatibility (MHC) I ו- II מולקולות ^2-3. סלקציה שלילית הרתי לאחר כרוכה טיהור של thymocytes אוטוריאקטיבים, מונעת על ידי אינטראקציה עם TEC הלשדי או תאים דנדריטים (DC) שפפטידים ההווה נגזרים מחלבונים עצמיים מחויבים אני כיתת MHC והשני מולקולות ^3. התוצאה הסופית של תהליכים אלה היא הקמת מאגר של תאים בוגרים מסוג CD4 ⁺ CD8 ⁺ T ומסוגל להגיב לקשת רחבהשל אנטיגנים זרים ואילו בתערוכת תגובתיות מינימאלית לחלבונים עצמיים ^4.

היעילות של אירועי בחירת הרתי מושפעת על ידי שורה של גורמים, כולל התבגרות הרתי, תדירות לשדית וTEC בקליפת המוח, הרכב משנה של DC הרתי, והמקור של מבשרי הרתי ^3. יש לציין, בחירת הרתי חריגה יכולה לגרום לפתולוגיות אוטואימוניות ⁵ או immunodeficient, שנובעות מסלקציה שלילית או חיובית פגומה, בהתאמה. האירועים המולקולריים המסדירים בחירת הרתי, לעומת זאת, הם הבינו היטב. במבחנה גישות כגון תרבויות איבר הרתי reaggregate (RTOC) ^6, הוכיח להיות שימושי לניתוח אירועים בסיסיים הקשורים לבחירת הרתי, אבל לא מצליחים לשחזר באופן מלא את הדינמיקה של שוטף באירועי vivo. כתוצאה מכך, גישה המבוססת על השתלת הרתי זה הוקמה לאירועי מבחר thymocyte מחקר טובים יותר in vivo ⁷

פרוטוקול זה מתאר השתלת thymi מעכברי תורם יילוד והמבוגר לעכברים נמען SCID immunodeficient. טכניקה זו מאפשרת לחקר מנגנונים המווסתים את הבחירה חיובית ושלילית הרתי, כמו גם תפוקת הרתי של תת תא T השונים במהלך ontogeny. לאחרונה, גישה זו הייתה בשימוש על מנת להוכיח כי היעילות של בחירת הרתי מוגבלת המוקדמת לאחר הלידה בעכברים המובילה לפיתוח מוגבר של תאי T אוטוריאקטיבים, ורפרטואר של תאי T ספציפי למופחת אנטיגנים זרים ^7.

Protocol

המחקרים בעכברים אושרו על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) מאוניברסיטת צפון קרוליינה בצ'פל היל וכל הטיפול בבעלי החיים היה בהתאם להנחיות IACUC.

1. הכנת היילוד והמבוגרים Thymi

1. הכן את כל חומרים כימיים וציוד לפני הרדמת חסד עכברים תורמים.
2. לעקר מכשירי ניתוח על ידי מעוקר או שיטות מתאימות אחרות. כל הניתוחים חייבים להתבצע בזרימה למינרית לשמור על תנאים סטריליים ולמנוע זיהום. להרכיב את הכלים דרושים להפקת thymi מעכברי תורם.
3. למלא צלחת 60 מ"מ עם סטרילי 1X PBS (pH 7.4) ומניח על קרח בתוך מכסה המנוע. זה ישמש לthymi חנות בקצרה נכרת מעכברי תורם לפני ההשתלה.
4. בהתאם להנחיות אתיות, להרדים עכברי תורם יילוד על ידי עכברי עריפת ראש ותורם למבוגרים על ידי CO ₂ מחנק ואחריו נקע בצוואר הרחם.
5. לremoval של התימוס: הנח את העכבר במצב שכיבה על גב מגבת נייר סופג סטרילית ולרסס עם אתנול 70% לפני ביצוע חתך.
6. לחשוף את חלל הבטן ובית חזה על ידי ביצוע חתך קו האמצע דרך העור. מקפלים את העור מעל החזה וforelimbs כדי לחשוף את חלל בית החזה.
7. לעשות שני חתכים רוחב דרך הסרעפת ובית החזה כדי לחשוף חלל החזה מעולה וקדמי חלל בית חזה. התימוס צריך להיות גלוי כשתי אונות הלבנות מייד לעיל וצמוד ללב.
8. להפריד את רקמות חיבור המקיפות את בלוטת התימוס עם מלקחיים בסדר, מה שהופך את מסוים לא לשבש את הכמוסה. בעוד מתאפק בית החזה עם מלקחיים, להשתמש זוג שני של מלקחיים כדי לחלץ שתי אונות של בלוטת התימוס ידי מיקום מלקחיים מעוקלים מתחת לאיבר ומושך בצורה אנכית. ניתן לעשות זאת באמצעות היקף ניתוחים לחילוץ thymi מעכברים שזה עתה נולד.
9. מניחים את התימוס בdi 60 מ"מsh מכיל סטרילי 1X PBS (pH 7.4) על קרח ואונות הרתי נפרדות על ידי חיתוך דרך מצר החיבור. הסר את כל פסולת מהאונות הרתי ביצוע מסוים שלא לפגוע בכמוסה, ולחתוך את התימוס למספר המתאים של חלקים להשתלה.
10. אל לתפעל thymi התקבל מעכברים שזה עתה נולד.
    הערה: משמשת למקסימום של שני עכברי נמען (אונה 1 למקבל).
11. השתלת thymi התקבל מעכברים בוגרים למקסימום של 4-6 עכברי נמען. בעזרת זוג המלקחיים, לתפוס בזהירות אונת הרתי מבוגר אחד, כפי שמוצג באיור 1, חתך התימוס לשלושה חלקים שווים באמצעות מספריים כירורגיות.
12. חזור על שלבים 1.3-1.4 עבור כל עכבר תורם. על מנת להגביל את הזמן thymi נחשפים, להכין התימוס תורם 1 בכל פעם.

2. קורנית השרשה תחת הקפסולה הכליות

1. להרכיב את הציוד מעוקר מראש המפורטים בטבלה 1. ספטית פרופרטכניקה צריכה להיות מנוצלת במהלך ההליך כדי למנוע חשיפת השתלת נמענים לכלים או חומרים כימיים מזוהמים.
2. לפני ההשתלה, לשקול ולתייג כל עכבר נמען.
3. הגדרת מיקרוסקופ לנתח ומעגל הרדמה בזרימה למינרית.
4. השימוש במכונת גילוח חשמלי, לגלח את הצד השמאלי של עכבר הנמען ולהבטיח שאין שיער נשאר מסביב לאזור המשמש לחתך.
5. הפעל מאדה isofluorane ולהרדים את העכבר באמצעות מינון של בין 1-2%. לברר הרדמה מתאימה לפני תחילת ההליך הכירורגי על ידי בדיקת עדר רפלקס הבא קמצוץ הבוהן.
6. לאחר העכבר הוא הרדים כראוי, להחיל משחה וטרינרים לעיניים של העכבר כדי למנוע יובש ולהכין את העכבר להשתלה באופן הבא:
7. מקם את העכבר תחת מיקרוסקופ לנתח במצב שכיבה לרוחב תקין כך שהצד המגולח פונה כלפי מעלה. Starting במרכז אזור הניתוח, לוותר בתנועה מעגלית באמצעות אתנול 70% פיפטה העברה חד פעמית, ואחריו povidone- יוד (בבטאדין). חזור על הטיפול באתנול / בטאדין 3 פעמים לפני ביצוע חתך.
8. מספריים לנתח באמצעות לעשות חתך אגף 1-2 סנטימטר ישירות מעל הכליות.
9. בעזרת מלקחיים בינוניים לתפוס רקמות חיבור סמוכות לכליות ועדינות להרים את הכליות, כך שהוא נמצא על גבי השרירים. כדי לשמור על הכליות חשופות ובמקום מעל השרירים, להכניס יד אחת של מלקחיים בינוניים מתחת לכליות, תשומת לב מיוחדת לא לשבש את הכסל הכליות.
10. על מנת למנוע התייבשות רקמות, להשקות את הכליות עם סטרילי 1X PBS (pH 7.4) בכל שלב, עד מניפולציה של הקפסולה הכליות וכליות הוא מלא.
11. בעזרת מלקחיים בסדר לצבוט ולהרים את הקפסולה בסמוך לקצה של הכליה דיסטלי ביותר לבלוטת יותרת הכליה כדי להפריד אותה מהכליה.
12. השתמש מד 18מחט לעשות חתך גדול מספיק כדי להכניס את פיסת התימוס תורם (איור 2 א) מוכנה. ודא לשמור חתך קופסית קטן ככל האפשר כדי למנוע פריקה של השתל לאורך זמן.
13. תוך שמירה על הכמוסה התרחקה מהכליות, להשתמש זוג שני של מלקחיים בסדר להכניס את השתל מתחת לכמוסה ולדחוף את התימוס ככל קדימה מחתך קופסית ככל האפשר (איור 2).
14. הסר את המלקחיים מתחת לכליה, ובעדינות לחזור הכליות בחזרה למקום דרך החתך.
15. סגור את השרירים על ידי תפירת קיר הבטן ויישום בטאדין נסגר פעם אחת. לאחר התפירה היא מלאה, להחיל קליפים פצע כדי לסגור את הדרמיס ולהחיל בטאדין לסביבה.
16. החזר את העכבר לכלוב שכבר חימם באמצעות מנורת חום.
17. צג כל עכבר שלאחר ניתוח עד שהוא חוזר להכרה וניידות מלאה ואל תניח tha עכבריםלא לא התאושש הבא הרדמה לתוך כלוב עם בעלי חיים אחרים.
18. פנק את העכברים עם תרופות לאחר ניתוח טיפול בכאבים בהתאם לצורך. לספק עכברים עם משככי כאבים שלאחר ניתוח כגון פרצטמול במי השתייה בריכוז של 1.6 מ"ג / מיליליטר.
19. חזור על שלבים 2.3-2.9 עבור כל עכבר נמען.
20. ודא שתמורת עכברים לפעילות רגילה תוך שלאחר ניתוח 1 שעה. צג משקל לאחר ניתוח, כישורים מוטוריים, כמו גם את פעילות השתייה והאכלה של כל עכבר כדי לקבוע סיבוכים הנובעים כתוצאה מהליך ההשתלה.
    הערה: ירידה במשקל לאחר ניתוח, בהשוואה למשקל טרום ניתוחי, כמו גם ניידות שינתה או כישלון לאכול או לשתות עשוי להצביע על סיבוכים.
21. צג הכינון מחדש של תאי T בדם היקפי על ידי דימום עכברים באמצעות זנב ניק ואחרי הפרדה של לימפוציטים באמצעות מדיה הפרדת תא Lympholyte על פי המפרט של היצרן. להשיג characteriza תא Ttion על ידי צביעה לימפוציטים עם נוגדנים מצומדות fluorescently ספציפיים לתא T סמני CD3, CD4, CD8 ו, כמו גם מאבחן מת חי כגון succinimidyl אסתר מופעלת fluorescently ^8. ניתוח כפי שמוצג באיור 3 ניתן להשיג באמצעות gating על singlets, תאי חיים, ותאים חיוביים CD3.

Representative Results

ההצלחה של הליך זה תלויה בטראומה כירורגית מינימאלית, כמו גם את המיקום מדויק של השתל מתחת לכמוסה בכליות. שתל הרתי יש לחתוך כדי להבטיח כראוי בגודל חלקי הרתי להשתלה הבאה, כפי שמוצג באיור 1. בעקבות סכמטי באיור 1, thymi מעכברים שזה עתה נולדו או מבוגר יכול לשמש להשתלת subcapsular מוצלחת עם תוצאות engraftment תא T עקביות ושחזור. כאמור, מיקום המתאים של השתל תחת הקפסולה הכליות הוא חשוב בשמירה על הישרדות לטווח ארוך, פונקציה, וכלי דם של השתל. כפי שניתן לראות באיור 2, שתל הרתי צריך להיות ממוקם מעל הכליות, קרוב ביותר לבלוטת יותרת הכליה (הקדמית של כליה), בסופו של הדבר ההפוך מחתך קופסית (האחורי של כליות). השתלת הרתי מוצלחת, כאשר בשילוב עם סביבת hematopoietic מתאימה, יכול remain יצרני בעודף של 30 שבועות ^7.

לאחר השתלה, engraftment נבחנת על ידי הזרימה cytometric מנתח של תאי T המתקבלים מהדם היקפי. איור 3 ולוח 2 מדגים את הרמה האופיינית לקליטתם של תאי T שנצפתה באיברים ודם היקפי באדם שעברה השתלה 6 שבועות לאחר השתלה. שימוש בטכניקה זו, הקבוצה שלנו הראתה בעבר קינטיקה של הכינון מחדש של תאים מסוג CD4 ⁺ CD8 ⁺ T ובדם היקפי לאורך זמן במושתלים של thymi יילוד והמבוגר. בקצרה, ניתן להבחין בתאי T במחזור בפריפריה תוך שלאחר ניתוח בשבוע אחד ומספרי תאי CD4 ⁺ CD8 ⁺ T וממשיכים להגדיל עד תא תא T ההיקפי מחדש באופן מלא ב5-6 שבועות לאחר השתלה ^7.

1:. הכנה של אונות וחתכים הרתי מעכברי יילוד תורם ותורמים מבוגרים thymi הם נכרת מהיום 1-ישן (NB) ו -4 שבועות בן (למבוגרים בלבד). קווים מקווקווים מוצגים כמדריך להכנת המספר המרבי של חלקים מאיבר תורם אחד להשתלה שלאחר מכן.

איור 2:. מיקום של חתך קופסית ומיקום של שתל הרתי סעיף בגודל מתאים שהוכן מהתימוס התורם מוכנס לתוך חלל subcapsular נוצר על ידי חתך קטן בכמוסת הכליות בקצה האחורי של הכליה (). קדמי לכליות, קרוב ביותר לבלוטת יותרת הכליה (לא בתמונה) ובסופו של הדבר ההפוך מחתך קופסית, הוא המיקום האופטימלי לשתל שמוכנס מתחת לכמוסה כפי שמוצג ב( B).

נתונים cytometric איור 3. קביעת engraftment המוצלחת באמצעות הכינון מחדש של תאי T באיברי דם והלימפה היקפיים. זרימה הם נציג של הכינון מחדש של תאי T נצפה 6 שבועות לאחר השתלה בנמען SCID של שתל הרתי NB. רמות דומות של קליטתם של תאי T הם נצפו בדם היקפי, טחול, לבלב צומת הלימפה (PLN), והבלוטות לימפה mesenteric (MLN) לאחר השתלה מוצלחת של שתל הרתי.

מלקחיים הביתור פיין

מלקחיים הביתור בינוניים (2)

מלקחיים עדינים לנתח (קצה מעוגל)

תמיסת פולידין

אתנול 70%

מחט מד 18

מיקרוסקופ לנתח w / מקור אור

דיטפטפות העברת sposable (2)

תרופות לטיפול בכאב: Acetaminophen

מגבונים סטריליים

מנורת חום

מכונת גילוח חשמלי

מאדה isoflurane וisoflurane

תפרים (מהיר קולטת, בטן רגיל)

לנתח מספריים

9 קטעי מ"מ נירוסטה פצע

כלי להסרת סרטון פצע

סטרילי 1X PBS

צלחת 60 מ"מ

טבלת 1:. חומרים דרושים במהלך השתלת הרתי כירורגית רשימה של חומרים הדרושים משמשים להשתיל התימוס מתחת הקפסולה הכליות של עכבר הנמען. כמות חומרים שצוינו מופיעה בסוגריים.

	טוטהמספר L של תאי CD4 T	מספר כולל של תאי CD8 T
דם	1,652 תאים / υl	351 תאים / υl
טחול	11546617	4203299
PLN	1241789	364918
MLN	2182266	532059

טבלת 2. סה"כ תאי T הנוכחיים באיברי דם והלימפה היקפיים של אדם שעבר השתלת הרתי. סה"כ מספרים של CD4 ⁺ CD8 ⁺ T ותאים התאוששו מהאיברים כמו גם דם היקפי של אדם שעברה השתלת הרתי יילוד 6 שבועות שלאחר השתלה. מספרים אלה הם נציג של CD4 ⁺ וcellularity תא CD8 ⁺ T שנצפה בדרך כלל במושתלים מוצלחים שזה עתה נולד ומבוגרים הרתי.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol	Decon Laboratories	2705HC
PBS	GIBCO	14190-144	pH 7.4
Betadine Solution	Purdue Products	67618-150-17
18 gauge needle	BD	305195
Sutures (1.0 metric)	Ethicon	J493G	18" (45cm)
AUTOCLIP Wound Clips (9mm)	Clay Adams® Brand	427631
Transfer pipette	Fisher Scientific	13-711-20	Sterile, disposable
Mouse anti-CD3 Ab	eBioscience	11-0031-85	Clone: 1452C11
Mouse anti-CD4 Ab	eBioscience	48-0042-82	Clone: RM4-5
Mouse anti-CD8 Ab	eBioscience	25-0081-82	Clone: 53-6.7
Lancet	Medipoint	Goldenrod 4mm
Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium Salt	Invitrogen	P30253
96-well round botton polypropylene plates	Corning	3365
1.2 ml polypropylene cluster tubes	Corning	4401
5 ml polypropylene round-bottom tubes	BD	352002
40uM Nylon Cell Strainer	Falcon	352340
16% Paraformaldehyde Solution, EM Grade	Electron Microscopy Services	15710	Hazardous
Puralube Optical Ointment	Fisher Scientific	NC0138063
Lympholyte	Cedarlane	CL5030
60 mm cell culture dish	Corning	430196	60 mm x 15 mm, Sterile