Abstract
De mekanismer som reglerar effekten av tymisk urval förblir dåligt definierad. Den metod som presenteras här tillåter in vivo analyser av utvecklingen och urval av T-celler specifika för sig själv och främmande antigener. Tillvägagångssättet innebär implantation av tymiska ympkvistar som härrör från olika äldre möss i immundefekta scid mottagare. Under en relativt kort tidsperiod mottagarna är helt upplösta med T-celler som härrör från den implanterade bräss transplantat. Endast tymocyter ympning tymus vid tiden för isolering genomgå selektion och utvecklas till mogna T-celler. Som sådan, kan förändringar i naturen och specificitet ympade T-celler som en funktion av åldersberoende tymiska händelser bedömas. Även om teknisk expertis som krävs för en lyckad thymic transplantation, ger denna metod en unik strategi för att studera in vivo ett brett spektrum av sjukdomar som beror på eller till följd av avvikande tymus funktion och / eller homeostasär.
Introduction
Den bräss är ett organ där kritiska händelser i T-cell utveckling sker 1. Resident tymocyter vid omlagring av den T-cellreceptor (TCR) α och β gener, genomgå en serie av interaktioner med lymphostromal och antigenpresenterande celler (APC) i de kortikala och medullära regioner av tymus 2. Tymus positiv selektion förmedlas av kortikala tymiska epitelceller (TEC) för att producera tymocyter som känner igen antigenpeptider i samband med värden större histokompatibilitetskomplex (MHC) klass I- och Il-molekyler 2-3. Efterföljande tymisk negativ selektion innebär rening av autoreaktiva tymocyter, som drivs av en interaktion med medullär TEC eller dendritiska celler (DC) som presenterar peptider härledda från kroppsegna proteiner som är bundna av MHC klass I och II molekyler 3. Slutresultatet av dessa processer är inrättandet av en pool av mogna CD4 + och CD8 + T-celler kan svara på ett brett spektrumav främmande antigener samtidigt uppvisar minimal reaktivitet mot kroppsegna proteiner 4.
Effektiviteten av tymiska urvals händelser påverkas av en mängd faktorer, inklusive tymisk mognad, frekvensen av medullär och kortikal TEC, delmängd sammansättningen av tymus DC, och källan till tymiska prekursorer 3. Särskilt kan avvikande thymic val resultera i autoimmuna 5 eller immundefekta sjukdomar, som uppstår av nedsatt negativ eller positiv selektion, respektive. De molekylära händelser som reglerar tymisk val, dock dåligt kända. In vitro metoder såsom reaggregate tymiska organkulturer (RTOC) 6, har visat sig vara användbart för att analysera grundläggande händelser i samband med tymisk val, men misslyckas med att fullt ut sammanfatta dynamiken i pågående in vivo-händelser. Som ett resultat, var detta tymisk transplantation baserat tillvägagångssätt inrättas för att bättre händelser studie tymocyt urval in vivo 7
Detta protokoll beskriver trans Thymi från nyfödda och vuxna donatormöss i immunodeficienta scid recipientmöss. Denna teknik medger studier av mekanismerna som reglerar positivt och negativt tymisk val, såväl som tymisk produktion av olika T-cellunderuppsättningar under ontogeni. Senast har detta tillvägagångssätt använts för att visa att effektiviteten i thymic val begränsas tidigt efter födseln hos möss leder till ökad utveckling av autoreaktiva T-celler, och en minskad T-cellsrepertoar specifik för främmande antigener 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De murina studier har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid University of North Carolina Chapel Hill och alla djuromsorg var i enlighet med de IACUC riktlinjer.
1. Framställning av nyfödda och vuxna Thymi
- Förbered alla reagenser och utrustning före euthanizing donatormöss.
- Sterilisera kirurgiska instrument genom autoklavering eller andra lämpliga metoder. Alla kirurgiska ingrepp måste utföras under laminärt flöde huva för att upprätthålla sterila förhållanden och undvika kontaminering. Montera de verktyg som behövs för utvinning av Thymi från donatormöss.
- Fyll en 60 mm skålen med sterilt 1x PBS (pH 7,4) och placera på is inne i huvan. Detta kommer att användas för att kortvarigt lagra Thymi ut från donatormöss före transplantation.
- Per etiska riktlinjer, avliva nyfödda donatormöss genom halshuggning och vuxna donatormöss av CO 2 kvävning följt av halsdislokation.
- För removal av tymus: Lägg musen i en dorsal liggande ställning på ett sterilt absorberande pappershandduk och spraya med 70% etanol före att göra ett snitt.
- Exponera buk- och brösthålan genom att göra en mittlinje snitt genom huden. Vik huden över bröstet och framben att avslöja brösthålan.
- Gör två sido snitt genom membranet och bröstkorgen för att exponera den överlägsna mediastinum och främre brösthålan. Tymus ska vara synliga som två vita lober omedelbart ovanför och intill hjärtat.
- Reta isär den bindväv som omger tymus med fin pincett, göra vissa inte störa kapseln. Håll tillbaka bröstkorgen med pincett, använd en andra pincett för att extrahera två lober bräss genom att placera böjd pincett under orgel och dra vertikalt. Detta kan göras med hjälp av en dissekera omfattning för att extrahera Thymi från nyfödda möss.
- Placera bräss i 60 mm dish innehållande steril 1x PBS (pH 7,4) på is och separata tymiska lober genom att skära genom den sammanbindande näs. Ta bort eventuellt skräp från tymiska lober göra vissa att inte skada kapseln, och skär bräss i rätt antal sektioner för transplantation.
- Inte manipulera Thymi erhålls från nyfödda möss.
OBS: Används för högst två recipientmöss (1 lob per mottagare). - Transplantation Thymi erhålls från vuxna möss i högst 4-6 recipientmöss. Med hjälp av en pincett, försiktigt tag en vuxen tymisk lob, som visas i figur 1, skär bräss i tre lika stora sektioner med hjälp av kirurgisk sax.
- Upprepa steg 1,3-1,4 för varje donator mus. För att begränsa den tid Thymi exponeras, förbereda en donatortymus i taget.
2. Thymus Implantation under njurkapseln
- Montera försteriliserad utrustning som förtecknas i tabell 1. Lämplig aseptiskteknik bör användas under förfarandet för att förhindra att utsätta transplanterade-mottagare förorenade verktyg eller reagens.
- Före transplantation, väga och märka varje mottagare mus.
- Ställ upp dissektionsmikroskop och anestesikrets i laminärt flöde huva.
- Med användning av en elektrisk rakapparat, raka den vänstra sidan av den mottagande musen och säkerställa inget hår håller sig runt området som används för att göra snittet.
- Slå på isofluoran förångare och söva musen med en dos på mellan 1-2%. Ta reda på korrekt anesthetization före start av kirurgiskt ingrepp genom att kontrollera för en frånvaro av reflex efter tå nypa.
- Efter musen är ordentligt sövda, tillämpa veterinär salva för ögonen på musen för att förhindra torrhet och förbereda musen för transplantation på följande sätt:
- Placera musen under dissekera mikroskop i en rätt stupa sidoläge så att den rakade sidan är vänd uppåt. Starting i mitten av operationsområdet, fördela i en cirkelrörelse med hjälp av en engångs överföringspipett 70% etanol, följt av povidon-jod (Betadine). Upprepa etanol / Betadine behandling 3 gånger innan du köper ett snitt.
- Använda dissekera sax göra en 1-2 cm flank snitt direkt ovanför njurarna.
- Använda medel pincett förstå bindväv i anslutning till njuren och försiktigt lyfta njuren så att den ligger ovanpå muskulaturen. För att hålla njuren exponeras och på plats över muskulaturen, sätter ena armen av medel pincett under njuren, med särskild uppmärksamhet för att inte störa njurhöftbenet.
- För att förhindra vävnads uttorkning, skölj njuren med steril 1 x PBS (pH 7,4) under varje steg tills manipulering i njure och njurkapseln är klar.
- Med fin pincett nypa och lyft kapseln nära kanten av njuren mest distalt binjurarna att skilja den från njuren.
- Använd en 18 gaugenål för att göra ett snitt tillräckligt stor för att sätta in den förberedda bit donatortymus (Figur 2A). Se till att hålla den kapsulära snittet så litet som möjligt för att förhindra dislokation av transplantatet över tiden.
- Under det att kapseln dras bort från njuren, använda ett andra par av fin pincett för att infoga transplantatet under kapseln och pressa tymus så långt framåt från den kapsulära snitt som möjligt (figur 2B).
- Avlägsna tången från undersidan av njuren, och försiktigt tillbaka njuren tillbaka på plats genom snittet.
- Stäng muskulaturen genom att sy peritonealväggen och tillämpa Betadine gång stängd. Efter suturering är klar, applicera sårklämmor att stänga dermis och tillämpa Betadine till omgivningen.
- Återgå musen till en bur som har värmts med användning av en värmelampa.
- Övervaka varje postoperativ musen tills det återfår full medvetenhet och rörlighet och inte placera möss that har inte återhämtat sig efter anestesi i en bur med andra djur.
- Behandla möss med postoperativ smärtlindring läkemedel som behövs. Ge möss med postoperativa analgetika såsom acetaminofen i dricksvattnet i en koncentration av 1,6 mg / ml.
- Upprepa steg 2,3-2,9 för varje mottagare mus.
- Se till att möss återgång till normal aktivitet inom en timme efter operationen. Övervaka postoperativ vikt, motorik, samt dricka och näring av varje mus för att bestämma komplikationer som uppstår som en följd av transplantationen.
OBS: Postoperativ viktminskning, jämfört med pre-operativ vikt, såväl som förändrad mobilitet eller underlåtenhet att äta eller dricka kan indikera komplikationer. - Övervaka T cellsrekonstitution i perifert blod genom blödning möss via svans nick följt av separation av lymfocyter använder Lympholyte cellseparationsmedier enligt tillverkarens specifikationer. Åstadkomma T-cell characterizaning genom att färga lymfocyter med fluorescerande konjugerade antikroppar specifika för T-cellmarkörer CD3, CD4, och CD8 samt en levande död diskriminator såsom en fluorescens aktiverad succinimidylester 8. Analys såsom visas i fig 3 kan åstadkommas via grind på singletter, levande celler och CD3-positiva celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Framgången med detta förfarande är beroende på minimalt kirurgiskt trauma samt noggrann positionering av transplantatet under njurkapseln. Den tymisk transplantatet bör klippas för att säkerställa lämplig storlek tymiska sektioner för efterföljande transplantation såsom visas i fig 1. Efter den schematiska i fig 1, kan Thymi från nyfödda eller vuxna möss användas för framgångsrik subkapsulära transplantation med konsekventa och reproducerbara T-celltransplantationsresultaten. Som nämnts, är viktig för att upprätthålla långsiktig överlevnad, funktion och vaskularisering av transplantatet lämplig placering av transplantatet under njurkapseln. Såsom framgår av fig 2, bör det tymisk transplantatet placeras ovanpå njuren, närmast till binjurarna (anterior av njure), på den motsatta änden från den kapsulära snitt (bakre delen av njuren). En framgångsrik tymus transplantation, när den kombineras med en lämplig hematopoietisk miljö kan REmain produktiv i över 30 veckor 7.
Efter transplantation är inympning bestämdes genom flödescytometrisk analys av T-celler erhållna från perifert blod. Figur 3 och Tabell 2 visar typiska nivån av T-cell engraftment observerats med organ och perifert blod i en transplantatmottagare 6 veckor efter transplantation. Med hjälp av denna teknik, har vår grupp tidigare visat kinetiken av CD4 + och CD8 + T-cells beredning i perifert blod över tiden i transplantationmottagare av nyfödda och vuxna Thymi. I korthet kan observeras cirkulerande T-celler i periferin inom en vecka efter operationen och CD4 + och CD8 + T-cellantal fortsätter att öka tills den perifera T-cell-utrymmet är helt rekonstituerades vid 5-6 veckor efter transplantation 7.
Figur 2:. Position för kapsel snitt och placering av tymisk transplantat Ett avsnitt med lämplig storlek framställd från donator tymus är införd i den subkapsulära utrymme som skapas av ett litet snitt i den renala kapseln på den bakre änden av njuren (A). Anterior till njuren, närmast till binjurarna (ej på bild) och vid den motsatta änden från den kapsulära snittet, är den optimala positionen för transplantatet som sätts in under kapseln, såsom visas i (B).
Figur 3. Bestämning framgångsrik ympning via T-cell rekonstitution i perifert blod och lymfoida organ. Flödescytometriska data som är representativa för T-cell rekonstituering observerade sex veckor efter transplantation i en scid-mottagare av en NB tymus transplantat. Liknande nivåer av T-cell engraftment observeras i perifert blod, mjälte, pankreas lymfkörtel (PLN), och mesenteriala lymfkörtel (MLN) efter en lyckad transplantation av ett tymus-transplantatet.
| Fine dissekera pincett |
| Medium dissekera pincett (2) |
| Fine dissekera pincett (böjd spets) |
| Betadinlösning |
| 70% Etanol |
| 18 gauge nål |
| Dissekera mikroskop w / ljuskälla |
| Disposable överföringspipetter (2) |
| Läkemedel för smärtbehandling: paracetamol |
| Sterila dukar |
| Värmelampa |
| Rakapparat |
| Isofluran och isofluran förångare |
| Suturer (snabb absorberande, vanligt tarmen) |
| Dissecting Saxar |
| 9 mm rostfritt stål sårklämmor |
| Sår klipp borttagningsverktyg |
| Sterilt 1 x PBS |
| 60 mm skål |
Tabell 1:. Material som behövs under kirurgiska thymic transplantation Lista över nödvändigt material som används för att implantera bräss under njurkapseln hos mottagaren musen. Mängden specificerade material som anges i parentes.
| Total Antal CD4 T-celler | Totalt antal av CD8 T-celler | |
| Blod | 1652 celler / υl | 351 celler / υl |
| Mjälte | 11.546.617 | 4.203.299 |
| PLN | 1.241.789 | 364.918 |
| MLN | 2.182.266 | 532.059 |
Tabell 2. Totalt antal T-celler som finns i perifert blod och lymfoida organ ett tymisk transplantation mottagare. Totalt antal CD4 + och CD8 + T-celler återhämtat sig från de organ liksom perifert blod från en nyfödd thymic transplantation mottagare 6 veckor efter avslutad transplantation. Dessa siffror är representativa för CD4 + och CD8 + T-cells cellularitet som normalt observeras i framgångsrika nyfödda och vuxna tymiska transplantationspatienter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2705HC | |
| PBS | GIBCO | 14190-144 | pH 7.4 |
| Betadine Solution | Purdue Products | 67618-150-17 | |
| 18 gauge needle | BD | 305195 | |
| Sutures (1.0 metric) | Ethicon | J493G | 18" (45cm) |
| AUTOCLIP Wound Clips (9mm) | Clay Adams® Brand | 427631 | |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-20 | Sterile, disposable |
| Mouse anti-CD3 Ab | eBioscience | 11-0031-85 | Clone: 1452C11 |
| Mouse anti-CD4 Ab | eBioscience | 48-0042-82 | Clone: RM4-5 |
| Mouse anti-CD8 Ab | eBioscience | 25-0081-82 | Clone: 53-6.7 |
| Lancet | Medipoint | Goldenrod 4mm | |
| Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium Salt | Invitrogen | P30253 | |
| 96-well round botton polypropylene plates | Corning | 3365 | |
| 1.2 ml polypropylene cluster tubes | Corning | 4401 | |
| 5 ml polypropylene round-bottom tubes | BD | 352002 | |
| 40uM Nylon Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
| 16% Paraformaldehyde Solution, EM Grade | Electron Microscopy Services | 15710 | Hazardous |
| Puralube Optical Ointment | Fisher Scientific | NC0138063 | |
| Lympholyte | Cedarlane | CL5030 | |
| 60 mm cell culture dish | Corning | 430196 | 60 mm x 15 mm, Sterile |
References
- Kappler, J. W., Roehm, N., Marrack, P. T cell tolerance by clonal elimination in the thymus. Cell. 49 (2), 273-280 (1987).
- Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nat. Rev. Immunol. 6, 127-135 (2006).
- Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don’t see). Nat. Rev. Immunol. 14 (6), 377-391 (2014).
- Schwartz, R. H. Acquisition of immunologic self-tolerance. Cell. 57 (7), 1073-1081 (1989).
- Kishimoto, H., Sprent, J. A defect in central tolerance in NOD mice. Nat. Immunol. 2 (11), 1025-1031 (2001).
- Anderson, G., Jenkinson, E. J. Investigating central tolerance with reaggregate thymus organ cultures. Methods. Mol. Biol. 380, 185-196 (2007).
- He, Q., et al. Thymic development of autoreactive T cells in NOD mice is regulated in an age-dependent manner. J. Immunol. 191 (12), 5858-5866 (2013).
- Stewart, C. C., Stewart, S. J. Chapter 6. Immunophenotyping. Current Protocols in Cytometry. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Rice, H. E., et al. Thymic transplantation for complete DiGeorge syndrome: medical and surgical considerations. J. Pediatr. Surg. 39 (11), 1607-1615 (2004).
- Markert, M. L., et al. Transplantation of thymus tissue in complete DiGeorge Syndrome. N. Engl. J. Med. 341, 1180-1189 (1999).
- Market, M. L., Devlin, B. H., McCarthy, E. A. Thymus transplantation. Clin. Immunol. 135 (2), 236-246 (2010).
- Wells, A. D., Li, X., Strom, T. B., Turka, L. A. The role of peripheral T-cell depletion in transplantation tolerance. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 356 (1409), 617-623 (2001).
- Albuquerque, A. S., et al. Human FOXN1-Deficiency is associated with ab double-negative and FoxP3+ T-cell expansions that are distinctly modulated upon thymic transplantation. PLoS One. 7 (5), e37042 (2012).
- Chinn, I. K., Milner, J. D., Scheinberg, P., Douek, D. C., Markert, M. L. Thymus transplantation restores the repertoires of forkhead box protein 3 (FoxP3)+ and FoxP3- T cells in complete DiGeorge anomaly. Clin Exp Immunol. 173 (1), 140-149 (2013).
- Savino, W. The thymus is a common target organ in infectious diseases. PLoS Pathog. 2 (6), e62 (2006).
