Abstract
Изготовление и характеристика сопряженных нано-биологических систем, взаимодействующими металлические наноструктуры на твердых носителях с иммобилизованными биомолекул сообщается. Вся последовательность соответствующих экспериментальных этапов описан, включая изготовление наноструктурных подложках с использованием электронной лучевой литографии, иммобилизации биомолекул на подложках, и их характеристики, используя поверхность с повышенной спектроскопия комбинационного рассеяния (SERS). Используются три различных конструкций нано-биологических систем, в том числе белка А, глюкоза-связывающего белка, и связывание дофамина аптамера ДНК. В двух последних случаях, связывание соответствующих лигандов, D-глюкозы и допамина, также включены. Три вида биомолекул иммобилизуют на субстратах наноструктурных различными методами, и результаты съемки SERS сообщается. Возможности SERS для обнаружения колебательных мод от поверхности с иммобилизованным белков, а также захватить белок-лиганд ANсвязывание d аптамер-лиганд продемонстрировали. Результаты также показывают влияние геометрии поверхности наноструктур, биомолекул стратегии иммобилизации комбинационного активности молекул и наличия или отсутствия связывания лиганда на спектры SERS приобретенного.
Introduction
Возможности по разработке и характеризующие сопряженных нано-биологических систем сопряжения твердотельных наноструктур и биологических полимеров становится все более важным дальнейшего прогресса в области следующего поколения био-зондирования и био-исполнительных технологий в 1,2 раза. Это включает в себя междисциплинарные исследования в целом ряде научных направлений, таких как изготовление соответствующих твердотельных компонентов (микро-или нано-электродов, нано-покрытий, нанопроволоки, или наночастиц) 2,3,4; иммобилизация биомолекул на поверхности, чтобы создать нужные Биоконъюгаты 5,6,7; и мониторинга нано-биологических интерфейсы 1. В большинстве случаев, выбор оптимального производства, био-функционализации и методов характеризации сильно взаимосвязаны. Очевидно, что выбор методов нанофабрикации будет определяться требованиями твердотельных компонентов системы, будучи в значительной степени зависит от метода обнаружения, который в Тун определяется природой биополимеров, участвующих и с целью мониторинга интерфейс.
Из широкого разнообразия методик, применяемых для характеристики биоконъюгата системы 1,3, поверхность повышается спектроскопии комбинационного рассеяния света (ГКР) стала весьма перспективным методом для обнаружения химических и биологических видов на поверхностях 8,9,10,11. ГКР работает неупругое рассеяние монохроматического света на поверхностных иммобилизованных биомолекул (рис 1), что позволяет захвата уникальных подписей, соответствующих молекулярных колебаний. Эта возможность выделить среди различных молекул, не привлекая этикетки, сложные химии, или времени действия, делает ГКР потенциально очень эффективный метод био-обнаружения. Еще одним важным преимуществом ГКР является его высокая чувствительность. Возбуждение локализованных поверхностных плазмонов светом, взаимодействуя с благородных металлов наноструктур (SERS субстраты) резко увеличивает Intensity комбинационного рассеяния аналита, позволяя обнаруживать очень малых количеств молекул, из монослоев до предела в одиночных молекул 8,9,10,11. Наконец, большинство биомолекулы водные растворы требуют, чтобы быть стабильной. Поскольку вода часто имеет ограниченную комбинационного деятельность, фоновый сигнал из водных образцов минимизируется 9. Применение ГКР выставлен экспоненциальный рост в течение последнего десятилетия 10. Тем не менее, много говорили задача ГКР является то, что электромагнитное усиление комбинационного рассеяния в решающей степени зависит от размера, формы и расстояния между металлическими наноструктур, где плазмонных волн индуцированной 11,12,13. Для того, чтобы достичь эффективного и воспроизводимые SERS измерений, контролировать геометрию подложки требуется на наноуровне размеров.
Рисунок 1. Scгема поверхности с повышенной спектроскопии комбинационного рассеяния.
Многочисленные методы, используемые для изготовления ГКР субстраты 11,12,13 условно можно разделить на снизу вверх и сверху вниз методов. Методы первого типа используют различные процессы самосборки или направленного химического синтеза для получения наноструктур. Часто имя примеры включают иммобилизации монодисперсных наночастиц на твердых подложках 11,12,13, тепловой, распыления или электрохимического осаждения шероховатых металлических пленок 11,12, и различных химических методов синтеза 13. Хотя такие методы, как правило, относительно простой и недорогой, большинство из них сталкиваются с проблемой отсутствия контроля над расположения сооружений, и ограниченная воспроизводимости образца к образцу.
В отличие от этого, методы сверху вниз литографии использовать манипулировать инструментов, таких как пучки частиц, чтобы создать нужные узоры на поверхности. Один из наиболее часто используемыхметоды нанолитографии, электронно-лучевой литографии (EBL), предлагает превосходный контроль над услугам вниз до уровня ниже 10 нм, а также гибкость, позволяющую различных конструкций подложки, на твердых носителях 11,12. В ЭВН, пучок электронов фокусировался в пятно в несколько нанометров, сканирования диаметра по всей поверхности чувствительной электронной материала (сопротивляться), вызывающим химические изменения в открытых районах. Для положительного тона сопротивляется, такие как полиметилметакрилат (ПММА), электронных результатов воздействия света в разрыва полимерных цепей, составляющих сопротивления, что приводит к повышенной растворимости в соответствующем растворителе (разработчик). Процесс электронно-лучевой литографии включает спин-покрытие равномерным слоем резиста на подложке; облучение целевой резиста материала в вакуумной камере с электронным пучком; и развитие образца, чтобы удалить растворимые участки.
Диэлектрические опоры В нижней металлических наноструктур, таких, как плавленого кварца, имеют Bееп значительно повышают интенсивность в ГКР из-за локализации плазмонов волн по сравнению с другими материалами, такими как кремний 14,15. Однако ЭВН рисунка на диэлектрической подложке, особенно на наноуровне, включает в себя существенные проблемы, связанными с перезарядкой наращивание во время экспозиции. Ранее мы показали, 16,17, что эти трудности могут быть преодолены путем размещения проводящих слоев полимера выше сопротивляться. Рисунок 2 показана схема общего процесса изготовления с помощью EBL экспозиции и развития с последующим развитием осаждения металла и старта для производства металлических наноструктур на плавленый кремния опоры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2. Схема еLectron лучевой литографии, осаждения металлов и старта этапов процесса, используемых для изготовления металлических наноструктур на диэлектрических подложках 16-19. В данной статье мы представляем всю последовательность шагов процесса, включающих SERS субстратов изготовление по ЭВН, био-функционализации субстратов, и Коллекция спектров комбинационного рассеяния. Три конструкции, изученные в наших последних работ 18,19 решаются (см рис 3 и 4, а в таблице 1). В Design 1, рекомбинантный белок иммобилизуют на био-функционализированные Au наноструктур на плавленый кварц (FS) поддержки 18, и обнаружение SERS белка показано. В конструкции 2, рекомбинантный глюкозо-связывающий белок 21,26,27 с и без лиганда (D-глюкозы) иммобилизуют посредством гистидина тегов в промежутках между Ag наноструктур на FS никелевым покрытием, а связывание глюкозы с белком обнаружено. В конструкции 3, тиолированного допамина связывания DNАптамер 19,23 обездвижен на Au наноструктур на FS, и связывание дофамина с иммобилизованным аптамера демонстрируется. С учетом всех соответствующих экспериментальных шагах от подготовки основания до комбинационного приобретения спектров и представителя различных биомолекул и стратегий иммобилизации, эти примеры являются полезными для широкого круга применений, от поисково-разведочные работы допроса нано-биологических интерфейсы по ГКР в развитие ГКР биосенсоры малых молекул, использующих белково или аптамера-лиганд-связывающий как метод распознавания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3. Схемы трех представительных образцов, используя различные биомолекулы, методы immobilizaции, и материалы подложки: (A) белок, иммобилизованный на благородного металла нано-точек функционализированных посредством самоорганизующейся монослоя (SAM) из 11-mercaptodecanoic кислоты (почтовый клиент) в деионизированной воде; (В) гистидин-меченый глюкозы связывающий белок (GBP) в комплексе с D-глюкозы, иммобилизованным на поверхности подложки между благородных металлов нано-точек; (C) тиольное концевыми дофамина связывания аптамер укомплектованный дофамина (DBA), иммобилизованного на благородных металлов нано-точек. Более подробно см в таблице 1. В конструкции 2, показанном на панели (В), образец без соответствующего лиганда был также подготовлен для сравнения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 4.Биомолекулы, используемые в трех конструкций: (A) белка А; (В) белок, связывающий глюкозы и D-глюкозы; (С) допамина связывания аптамер ДНК и допамин. Белковые третичные структуры в (а) и (б) взяты из белка банке данных, PDB ID 1BDD 20 и 2HPH 21, соответственно, и обращается с VMD для LINUXAMD64, версия 1.9.1 22. Аптамер вторичная структура в (С) предсказал из последовательности 23, используя ValFold 24 программное обеспечение и обращается с PseudoViewer 3,0 25. Буквы G, A, T, и C соответствуют гуанин, аденин, тимин и цитозин нуклеотидов, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
| Дизайн 1 Дизайн 2 | Дизайн 3 | ||
| Биополимер | Протеин А | Глюкоза связывающий белок (GBP) | Допамин связывания аптамер (DBA) |
| Связующее вещество | 11-меркаптоундекановой кислоты (MUA) самоорганизующихся монослоя (SAM) | Гистидин теги | Тиоловые Линкеры |
| Лиганд | Ни один | D-глюкозы | Допамин |
| Решение | Деионизированная (DI) воды | Калий фосфатном буфере | Трис (гидроксиметил) (ТРИС) и этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) буфере; Забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) |
| Подложка | Au структуры на FS | Ag структуры на FS никелевым покрытием | Au структуры на FS |
| Узорчатое AREA | 4 мкм х 10 мкм | 4 мкм х 8 мкм | 4 мкм х 10 мкм |
| Шаблон | Au точки, 50 нм шаг | Ag точки, 40 нм шаг | Au шестиугольники, шаг 200 нм |
| Ag шестиугольники, шаг 200 нм | Au неструктурированные колодки | ||
| Ag неструктурированные колодки | |||
| ЭЛП дозы облучения | Точки: | Точки: 105 мкКл / см 2 | Шестигранники: 180 мкКл / см 2 |
| Массив I 120 мкКл / см 2 | Шестигранники: 170 мкКл / см 2 | ||
| Массив II 96 мкКл / см 2 | |||
| Массив III 72мкКл / см 2 | |||
| Длина волны лазерного возбуждения | 532 нм | 532 нм | 780 нм |
Таблица 1. Три конструкции нано-биологических систем.
Protocol
1. Подготовка основания
- Используйте полупроводниковый перетасовки видел, чтобы вырезать из плавленого кварца (FS) пластины в 1 см × 1 см или менее в кости.
- Чистые образцы в растворе пираньи (H 2 SO 4: H 2 O 2, 3: 1; ВНИМАНИЕ: сильный окислитель) ванна 28 15 мин, затем смыть кости в деионизированной воде и сушат в азоте.
- Поместите образцы на плите лицевой стороной вверх при 180 ° С в течение 15 мин. Охладите образцы после удаления из конфорки до комнатной температуры.
- Для конструкций 1 и 3, перейдите к шагу 2.
- Для дизайна 2, поместите образец в электронно-лучевой испарительной камеры и пальто с 10 нм слоем никеля.
2. Изготовление Nano-узорчатые ПММА Маски помощью электронно-лучевой литографии (EBL)
- Спин-пальто PMMA сопротивляться и проводящие слои на подложках.
- Использование пластины счетчик с вакуумной оправки и место образцов по отдельности в центре на патроне. Место1 каплю полиметилметакрилата (ПММА) резиста по центру образцов с использованием стеклянной пипетки и спина при 3500 оборотов в минуту в течение 60 секунд с 2 сек темпа.
- Выпекать основаниях на 180 ° С в течение 3-5 мин. После выпечки подложек, охлаждения образцов до комнатной температуры.
- С подложки охлаждают и возвращают в патроне вращателя, распространение каплю проводящего полимера на подложке. Спин субстрат для 40 сек при 3000 оборотах в минуту с 2 сек время подъема. Образцы Выпекать при температуре 80 ° С в течение 1 мин.
- Выполните EBL экспозиции в соответствии со стандартной процедурой 16,17,18,29.
- Использование инструкции производителя, подготовить дизайн экспозиции, использующий художественные дозы из таблицы 1 с наименьшим возможным шагом луч размера.
- Загрузите образец в электронно-лучевой литографии камеры. Если ЭВН система не имеет автофокусировку, используйте маленькую царапину от места, где картина быть выявлены и от борта края для фокусировкиIng.
- Использование инструкции производителя, выполнить необходимые фокусировки и коррекции астигматизма, а также записи Выравнивание поля по мере необходимости, и подвергнуть образец. Для обеспечения надлежащего профиля экспозиции и лучшего качества картины, использовать 30 кэВ энергии электронного пучка и 7,5 мкм отверстие для экспозиций.
- Удалить проводящий полимер и развивать открытые образцы.
- Приготовьте стакан с деионизированной (ДИ) воды для удаления проводящего полимера и второй стакан со смесью разработчику (IPA: H 2 O, 7: 3), и перемешивают в течение 5 мин при комнатной температуре. Подготовка изопропанол (высокой чистоты) в третьем химическом стакане в виде полосканий агента.
- С помощью пинцета поместите образцы в воде в течение 3 сек, чтобы удалить проводящий полимерную пленку, затем поместите образец в разработчика и переместите пинцетом, медленно вверх и вниз в течение 20 сек. Сразу передачи подложек, чтобы изопропанола и промывать более 10 секунд, а затем высушить образец азотом. </ OL>
3. благородного металла наноструктуры Изготовление
- Загрузка образцов вверх дном в системе пучок электронов испарителя, чтобы обеспечить испаренного металла, осаждаемого на передней поверхности образцов. Депозит толстый слой Au 10 нм на образцы для образцов 1 и 3, а также нм слоя 10 Ag для проектирования 2 со скоростью около 0,1 нм / с.
- Заполните систему обработки ультразвуком с рекомендуемой высоты с водой и заполнить отдельную стакан с ацетоном. Поместите образец лицевой стороной вверх в дне стакана и позволяют образец впитаться в течение 10 мин. Проведение стакан, поместите его в водяной бане и позволяют высота ацетона, чтобы соответствовать высоте воды и включить систему обработки ультразвуком. Разрешить ультразвуком происходит до 60 сек.
- Используя ту же процедуру, как описано в шаге 3.1, подготовить единые Au и Ag площадку подложек путем осаждения 10 нм толстых металлических пленок на FS (проекты 1 и 3) и FS Ni-покрытием (конструкция 2) SUBSTRТочные шаг 2 пропуская.
4. Био-функционализации субстратов
- Подготовку проектно-1 образцы:
- Подготовьте 1 мМ раствора 11-mercaptodecanoic кислоты (MUA) в этаноле при комнатной температуре. Ультразвук на 10 мин.
- Погружают надлежащего наноструктурного подложки в раствор МСХ в течение 48 ч. Промыть образец этанолом три раза и сушат в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Подготовка 75 мМ раствора N-этил-N '- (3- (диметиламино) пропил) карбодиимид (EDC) в деионизированной воде. Подготовка 15 мМ раствора N -hydroxysuccinimide (NHS) в деионизированной воде.
- Использование депозит микропипетка 100 мкл NHS на Au на подложке, и сразу же добавить 100 мкл EDC на той же площади. Выдержите в течение 1 мин, чтобы активировать самостоятельно монослоя (SAM) из MUA.
- Поместить каплю 100 мкл белка раствор (47 мкМ) на одной и той же поверхности подложки и хранить пробу в течение 24 ч при 5 ° С в многокамерных Петри DМОГ с 1 мл дистиллированной воды в другом отсеке, и с герметичной крышкой.
- Промойте образец в дистиллированной водой 3 раза, непрерывно помешивая образцов в отдельных стаканах в течение 20 сек в каждом стакане. Не позволяйте образцы сухой после промывки или во время полоскания.
- Перейдите к шагу 5.
- Подготовку проектно-2 образцы:
- Подготовьте 0,9 мМ раствор глюкозы связывающего белка (GBP) в калий-фосфатного буфера (K 2 HPO 4, 25 мМ, рН 7,5). Приготовьте 100 мМ раствора D-глюкозы в буфере.
- Смешайте 30 мкл 100 мМ раствора D-глюкозы и 30 мкл 0,9 мМ раствора GBP использованием 1 мл пластиковый контейнер и микропробирок микропипетки. Инкубируют в течение 30 мин.
- Депозит 20 мкл лиганда без GBP решения и лиганд-связанным GBP решения каждой на подготовленную подложках с использованием микропипетки. Хранить образцы при 5 ° С в течение 24 ч в чашку Петри с герметичной крышкой.
- Промыть образцы 3 раза враствор фосфатного буфера калия при комнатной температуре.
- Перейдите к шагу 5.
- Подготовку проектно-3 образцы:
- Развести допамина связывания аптамер (DBA) раствора до концентрации 1 мкМ, используя буфер Трис ЭДТА с конечного рН 7,4.
- Подготовка допамина решение концентрации 5 мкМ путем измерения дофамина порошка на аналитических весах и смешивание его в фосфатном буферном солевом растворе (PBS) с перемешиванием валика в течение 5 мин.
- Депозит каплю 20 мкл раствора DBA на поверхности каждой подложки, и пусть образцы сидеть в течение 1 ч при комнатной температуре с крышкой в течение чашке Петри.
- Промыть образцы 3 раза в калий-фосфатного буфера (K 2 HPO 4, 25 мМ, рН 7,5).
- Поместите образцы в вертикальном положении на верхней части класса чистых помещений стереть, чтобы высушить заднюю при сохранении пленки на передней стороне подложки. Установка образец сторону в качестве контрол.
- Поместите каплю 5 мкл раствора дофамина Oп поверхность существующей капли буферного раствора PBS на остальных образцах с требуемой концентрации допамина. Инкубируйте образца в течение 10 мин.
- Поместите каплю дофамина решения на площадку поверхности Au без аптамера. Инкубируют в течение 10 мин.
- Промыть образцы в буферном растворе фосфата калия в 3 раза.
5. спектроскопия комбинационного рассеяния
- Поместите каждый образец в водонепроницаемом камеры, чтобы избежать испарения лазерного воздействия.
- Заполните пластиковый шприц с химически инертным высокого вакуума жира, место образцов на предметных стеклах и отказаться от нескольких миллиметров жира, окружающего образцы, не касаясь образцов.
- Поместите микроскопа покровное на вершине подложки и аккуратно нажать вниз, чтобы образовать уплотнение, создавая тонкую жидкую интерфейс между подложками и покровные, не позволяя буфер чтобы войти в контакт с вакуумной смазки.
- ИспользованиеОптическая система микроскопа комбинационного рассеяния, получаем фокус на поверхности металла нано-рисунком области для отбора проб без включения лазера.
- Выполните отбор проб комбинационного 18,19 с лазерной интенсивности между 2.4-3.1 МВт с общей продолжительностью менее 20 сек, чтобы предотвратить повреждение образца с целью 10Х. Приобретение спектры комбинационного рассеяния для образцов из образцов 1, 2, и 3 с использованием длин волн возбуждения, как показано в таблице 1. Кроме того, получить спектры комбинационного управления для решений белок, GBP и D-глюкозы, и дофамина порошка с использованием стеклянных слайдов без металла наноструктуры в качестве опор для сравнения.
Representative Results
Сбор управления спектров комбинационного рассеяния для основных компонентов, в том числе свободных белков в растворе и свободных лигандов в растворе или в виде порошка без использования металлических подложек, содержащих, важно, чтобы дать возможность надлежащего сравнение, а также для целей интерпретации. 5А представлена типичная Рамана Спектр для свободного белка А в деионизированной воды на предметное стекло без наноструктурных субстратов. Две полосы с наибольшей интенсивностью комбинационного рассеяния полоса 2931 см -1 и в 1091 см -1, соответствуют колебания с участием СН и CS облигации, соответственно. Другие группы с более низким комбинационного интенсивности, такие как 563 см -1, 1450 см -1, 1653 см -1 и 2426 см -1, можно отнести к суперпозиции мод колебаний 18,32,33,34. Контроль спектры комбинационного рассеяния для свободного лиганда ГПБ в буферном растворе с трех различных концентрациях, 0,3, 0,9 и 1,3 мм, показаны на фиг.5В. В т он понять, широкая полоса вокруг 3400 см -1 соответствует растворителя 35, в то время как полосы при 2935 см -1 представляет колебания с участием СН-связей белка 32,33. 5С показывает высокий волны спектр комбинационного рассеяния для D-глюкозы в буферный раствор для различных концентрациях: 1, 6, 100, 200 и 400 мм. Когда концентрация глюкозы увеличивается, Н-связей вибрации полосы возникают при 2890 см -1 и 2960 см -1. Управление спектры комбинационного рассеяния света дофамина в кристаллической форме, полученной с обеих 532 нм и 780 нм длинах волн возбуждения показаны на рис 5D. Большая часть спектра комбинационного рассеяния происходит от бензольного кольца изгиба и CH облигаций участки молекулы 19,36. Некоторые из полос около 3000 см -1 наблюдаются только в 532 нм, но волны возбуждения не 780 нм.
pload / 52712 / 52712fig5.jpg "/>
Рисунок 5. Контроль Спектр комбинационного рассеяния белка А в деионизированной воде, полученный при 532 нм длины волны возбуждения 18 (а); Спектры комбинационного рассеяния лиганда свободной глюкозы связывающего белка в буферном растворе, полученный в 532 нм длины волны возбуждения (б); Спектры комбинационного рассеяния D-глюкозы в буферный раствор, полученный при 532 длины волны возбуждения нм (С); и спектры допамина порошок, полученный в 532 нм и 780 нм длинах волн возбуждения 19 (D). Все спектры являются регулярными спектры комбинационного рассеяния растворов (а, б, в) и порошка (г) на предметные стекла, не наноструктурных субстратов. В (D), назначение комбинационного рассеяния сдвига режимов различных молекулярных колебаний было сделано с помощью общих атомных и молекулярных электронных структуры системы (GAMESS) 30 и MacMolPlt 31 программное обеспечение, как описано в другом месте 19. Печатается панель () с разрешения 18 Americвакуумное общество. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Для того чтобы получить спектры SERS для поверхности с иммобилизованным биомолекул, субстраты, содержащие металлические наноструктуры на расплавленных носителей кремнезема изготавливают, как описано в шагах 1-3. Качество готовых субстратов отслеживается с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM). Стандартные процедуры SEM описаны в других 16,17,18, 19 и не входит в настоящем протоколе. Рисунок 6 показывает представительства SEM-изображения поверхности золота и серебра нано-точек и нано-шестигранник, как структуры (панели н.э.), а также не -structured Au и Ag колодки (панели Д и Е, соответственно). Следующие шаги включают в себя иммобилизацию биологического материала на нано-структурированных подложках, использующих три варианта, перечисленные в таблице 1, и приобретение их спектров ГКР. В O rder поддерживать в водную окружающую среду во время съемки комбинационного, каждый образец помещают в соответствующем растворе (таблица 1), закрывают тонкой стеклянной крышкой, и печатью, как показано на фиг.7.
Рисунок 6. Сканирующий электронный микроскоп (SEM) изображения толщиной 10 нм Au и Ag поверхностных наноструктур, используемых в качестве ГКР субстратов: (A, B) массивы наноточек; (C, D) массивы нано-шестиугольников; (E, F) неструктурированные колодки. Подложки с Au структур (слева) используют ФС опоры, в то время как подложки с Ag структур (справа) использовать 10 нм Ni покрытия на поверхности Ферми. Были получены изображения как описано в других 16,17,18.PG "TARGET =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 7. Схема водонепроницаемой камеры для КРС изображений образцов био-функционализирован в растворе.
В Design 1, рекомбинантный белок обездвижен на подложках модифицируетс самоорганизующейся монослоя 11-mercaptodecanoic кислоты (MUA) в деионизированной воде 18. Подложки в этой конструкции состоит из трех массивов Au точек с шагом 50 нм и различной между точечными расстояниях плавленого кварца (см 6А и 8). Процесс иммобилизации белков начинается с образованием SAM на подложках. Чтобы получить ковалентное связывание между SAM и белка, группы карбоновых кислот МПС превращаются в амин реактивной NHS-эфира, путем обработки смеси N этил-N '- (3- (диметиламино) пропил) карбодиимид (EDC), раствор и N -hydroxysuccinimide (NHS) раствор в дистиллированной водой. Иммобилизация белка А происходит путем перемещения группы NHS с остатками лизина белка 37. Пример изображения образцов для дизайна 1 с белком А, иммобилизованным на Au наноструктур показано на рисунке 9. 9А представляет собой оптический микроскоп файл из образцов, которые содержат три массива био-функционализирован Au наноточек с различными между точечными пробелов (см также рис 3AA и 8), а на рис 9В показана спектральная отображение комбинационного рассеяния над этими массивами. Это можно увидеть, что самые высокие интенсивности комбинационного рассеяния находятся в массиве I, где между точечные разрывы узкой, в то время как низкие интенсивности получены для массива III с отдыхом между точечными пробелов. Это можно объяснить более сильным плазмонного связи эффекта, производимого более высокой электрической тьфуLDS в узких пространствах между точками 18. Фиг.9С показывает сильный спектры ГКР, полученный для массивов I и II. Спектры проявляют несколько полос (1630 см -1, 1964 см -1, 2280 см -1, 2577 см -1, 2916 см -1) в непосредственной близости от комбинационных мод свободного белка А в растворе показано на рисунке 5А. Принадлежащая колебаний различных связей, найденных в белках, эти полосы либо появляются в тех же местах как в иммобилизованным белком и в растворе, или слегка сдвинуты к несколько более высокие волновые числа, когда обездвижен. В отличие от этого, спектры ГКР подобных наноструктурированных подложек функционализированы MUA SAM без белка показывают совершенно иную картину 18, подтверждая, что рис 9 представляет ГКР картирование поверхности с иммобилизованным белком А. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть Более крупная версия этой фигуры.
Рисунок 8. СЭМ изображения трех массивов Au наноточек на FS подложки, используемые в конструкции 1 18. Массивы имеют одинаковую высоту 50 нм и немного разные радиусы точек в результате различной ширины между точечными пробелов. Это достигается за счет применения различных доз ЭВН экспозиции для получения ПММА маски для трех массивов (табл 1). Более высокие дозы облучения приводит к более широкие отверстия в ПММА масок, что позволяет для больших AU Размеры точка после металлизации и старта. Печатается с разрешения 18 Американское вакуумное общество. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
ле / ftp_upload / 52712 / 52712fig9.jpg "/>
9. SERS визуализации подложки с иммобилизованным белком А в Design 1 18. (А) Оптический микроскоп изображение образца, включающий три массивы золота нанодотах с шагом 50 нм и различных точек между зазорами на кварцевой подложке (смотри также Фиг.6), био-функционализированные, как показано на фиг.3А. (В) комбинационного отображение образца. (C) спектры ГКР от точечного массив, который я и II. В панели (В), вертикальная ось представляет расстояние между подложкой, горизонтальная ось представляет рамановского сдвига, а бар Легенда показывает интенсивность комбинационного рассеяния. Вертикальные пунктирные линии на графиках (B) и (C) представляют тестов комбинационных полос свободного белка А в растворе и (*) в панели (С) указывает на ГКР группы из массива I. В спектрах комбинационного рассеяния света были получены возбуждение 532 нмдлина волны. Печатается с разрешения 18 Американское вакуумное общество. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
В конструкции 2, рекомбинантный белок, связывающий глюкозы (GBP) 21 в виде комплекса с D-глюкозой (лиганда) иммобилизуют на соответствующих подложках в фосфатном буфере калия. Образцы с иммобилизованным лигандом бесплатно GBP получают также для сравнения. В этой конструкции, глюкозо-связывающий белок присоединен к поверхности с помощью гистидин тег, который связывается также с Ni, но не благородных металлов 6. Так как субстраты включают массивы Ag нано-точек, нано-шестиугольники и неструктурированные колодки Ag на FS никелевым покрытием (рис 6В, 6D, и 6F соответственно), можно ожидать, большинство из иммобилизованными белковых молекул будет находиться в промежутках между Ag наноструктур, где Ni покрытие прailable. Спектры комбинационного рассеяния, полученные для иммобилизованным без глюкозы и глюкозо-связаны GBP показаны на рисунках 10А и 10В соответственно. Все эти спектры демонстрируют широкую полосу при примерно 3300 см -1, которая соответствует буферного раствора 35. Спектры, полученные с неструктурированной Ag площадку содержать только эту одну полосу и не показывают каких-либо режимы белок вибрации, подтверждая, что иммобилизованным белком не нашли на поверхности Ag, как ожидалось. В отличие от этого, спектры, полученные с массивами Ag нано-точек и нано-шестиугольников выставочных полос вокруг 1550 см -1 и 2900 см -1, которые представляют собой аналит 32,33. В частности, широкая полоса вокруг 1550 см -1, известный как полоса Амид II, которая относится к пептидных связей вибрации в белках 33,34. В рассматриваемом случае, эта группа представляет собой суперпозицию режимов вибрации от GBP иммобилизованных на поверхности Ni между функцией Agс, а это свидетельствует о повышение SERS из этих режимов в непосредственной близости от благородных металлов наноструктур, когда субстраты, содержащие нано-точки или нано-шестиугольники используют. Эта группа очень слаба для белка в растворе в отсутствие улучшения SERS (фиг.5В) и отсутствуют на Ag колодки без поверхности Ni, доступной для связывания с белками, но она хорошо заметно в наноструктурированных подложек с какой-либо поверхности Ni, доступных для белка связывать. Тем не менее, даже более важным для настоящего исследования являются другие, более узкие полосы вокруг примерно 2900 см -1, которые могут быть отнесены к СН-связи wibrations 32,33. Спектр без глюкозы GBP показывает заметное группу в 2933 см -1 с нано-точек подложки, и слабой, но заметной полосы в аналогичной длины волны с нано-шестиугольников подложки (фиг.10А). В отличие от случая глюкозы свободного белка, спектры ГКР глюкозы переплете GBP показано на FIGU повторно 10B демонстрируют две полосы, соответствующие Н-связей сотрясения режимы, в 2850 см -1 и 2910 см -1. Полосы хорошо выражены в спектре глюкозы связана GBP на нано-шестиугольников подложки, и они могут также рассматриваться в спектре GBP на нано-точек подложки. Полоса при 2850 см -1 является достаточно близко к 2890 см -1 один в спектре комбинационного рассеяния управления от D-глюкозы в растворе, и, следовательно, его можно отнести к глюкозе, связанный с белком, в то время как другая группа (в 2910 см -1) относится к связи С-Н колебаний как белка и глюкозы. Можно сделать вывод, что разница подписей ГКР от глюкозо-и без глюкозы связанного субстрата с иммобилизованным GBP наблюдается в этом регионе, и CH облигаций колебания белком глюкозы обнаруживаются с использованием дизайна описаны.
10.jpg "/>
Рисунок 10. спектры ГКР лиганд-Free () и лиганд-связей (В) глюкозо-связывающий белок, иммобилизованного на трех различных подложках в области дизайна 2. Спектры получены с длиной волны возбуждения 780 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию из этой фигуры.
В Design 3, связывание настроены допамина аптамер (DBA) с тиолом прекращения 23 иммобилизуют на подложке в трис (гидроксиметил) (ТРИС) этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) буферного раствора, а затем допамина связан с иммобилизованным аптамера 19. Подложки для этой конструкции содержат массивы Au нано-шестиугольников на FS (6С). Неструктурированные Au колодки (рис 6E) также используются для целей управления. С ДНК сути флуоресцентная 38, 780 нм waveleng возбуждения го используется в конструкции 3, чтобы уменьшить этот фактор. В этой конструкции, элемент распознавания (аптамер) не комбинационный в области комбинационных сдвигов, рассмотренных на фиг.11, в то время как дофамин показывает значительное комбинационного активность в этой области. Поскольку сигнал от образцов, подвергшихся воздействию только допамина, не иммобилизованным аптамера не показывает результирующие допамина полосы 19, наблюдаемые SERS полосы, как ожидается, происходят из аптамеров связанного допамина. Рисунок 11 сравнивает SERS-спектры иммобилизованным аптамера на золотых наноструктур до и после добавления допамина. Как и ожидалось, иммобилизованных допамина бесплатно аптамер не проявляет полос КР. В отличие от этого, число выраженных комбинационных полос наблюдаются для допамина связанный иммобилизованным аптамера. Позиции большинства групп на рис 11, близки к кристаллической дофамина, хотя и с различиями в амплитуд.
igure 11 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 52712 / 52712fig11.jpg "/>
Рисунок 11. спектры ГКР лиганд-Free (фиолетовая линия) и лиганд-связанным (синяя линия) дофамин-связывающий аптамер иммобилизованного на Au нано-шестигранными субстратов в области дизайна 3 19. Красная линия показывает управление ГКР спектр дофамина порошка. Пожалуйста, Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой цифры.
Discussion
ГКР набирает признание как чрезвычайно мощной техники био-обнаружения, предлагая множество уникальных преимуществ. Соотношение с молекулярных колебаний позволяет избирательно идентификации "отпечатки пальцев" конкретных аналитов из спектров SERS, в то время как чрезвычайно высокая чувствительность позволяет обнаруживать очень малые количества аналита 9,10,11,35. Кроме того, SERS является неразрушающим методом, который также относительно нечувствительны к воде, и тем самым он очень хорошо подходит для исследований биологических материалов в их естественном водной среде 9. Результаты, представленные подчеркнуть эти преимущества, а также дополнительно демонстрируют мощный потенциал ГКР как очень гибкой этикетки без технике био-обнаружения. В трех конструкций с применением различных монослоев подложки с иммобилизованными биомолекулами, рамановские режимы были обнаружены, которые могут быть с уверенностью отнесены к конкретным аналитов. Это обнаружение этих биомолекул, ØR их соответствующие лиганды, были продемонстрированы с использованием плоских поверхностей из плавленого кварца в качестве поддержки для ГКР субстратов, делает дизайн совместим с существующими электроники и настройки микрофлюидики, обещая многочисленные приложения в связи с появление био-электронные архитектуры сопряжения биологических материалов с поверхностей электронный и электрохимические устройства 2,3. Важно отметить, что в двух из трех образцов Обнаружение SERS была продемонстрирована для специфического связывания малых молекул, таких как глюкоза и дофамина, с использованием монослоев на поверхности с иммобилизованным белком и аптамера, соответственно, в качестве элементов распознавания.
Однако некоторые аспекты должны быть учтены в целях достижения эффективного ГКР био-обнаружения в настройках "на-чипе". Прежде всего, хорошо известно, что задача является общей для большинства биомолекул является их склонность к ухудшению, особенно при контакте с не-природных условий, таких как сухой окружасреды или интенсивного лазерного света. На протяжении протокола, мы подчеркивали важность всегда держать био-функционализирован образцы, погруженные в соответствующих решений в течение всего эксперимента, начиная с подготовки образцов к приобретению спектров комбинационного рассеяния. Для последнего, пользовательские водонепроницаемый камера была разработана (рис 7), чтобы избежать испарения жидкости при лазерном воздействии. Продолжительность воздействия и интенсивности лазерного также должно быть ограничено, как описано в шаге 5.3 протокола, чтобы избежать повреждения образцов.
Результаты обнаружения SERS найдены чувствительны к геометрии подложки, используемой, в частности, и разделение между особенностью металлических наноструктур. Как следует из фиг.8 и 9, интенсивность SERS из дизайн 1 образцов сильно зависит от ширины зазоров между Au нано-точек на кварцевом стекле. Из трех массивов Au наноточек испытания IN Эта конструкция (рис 8), высокая интенсивность комбинационного рассеяния достигается с массивом I, который имеет узкие зазоры между функциями Аи и поэтому обеспечивает более эффективное электромагнитное усиление поля. Как показано на рисунке 9 показана, контроль между удобства разделения на уровне 10-20 нм или менее требуется. Используя ЭВН для изготовления ГКР субстраты, как показано здесь, обеспечивает эффективное решение специально для управления шириной между художественных пробелов. С положительным тона EBL противостоять такие как ПММА, размер отверстий в ПММА масок можно варьировать путем простого изменения дозы облучения. После отрыва это приводит к различным размерам готовых металлических точек, а ширина зазоров между точками может быть настроен по желанию, выбрав правильное EBL доз облучения 18.
Другой проблемой является оптимизация геометрии ГКР подложки для конкретного применения био-обнаружения. Хотя эффект усиления Increases с уменьшением зазоров между художественных, относительно большой размер биологических молекул накладывает ограничения на как сократить разрыв может быть. Это видно из результатов для проектирования 2, где метод иммобилизации такова, что белок эффективно связывается только с поверхности между точками благородных металлов, но не самих точек (см фиг.3В). Как следует из рис 10, спектры ГКР для неструктурированных колодок Ag не показывают какие-нибудь группы из анализируемого вещества. Несмотря на то, колодки обладают нано-кристаллическую структуру с очень тонкими межостровных пробелов (рис 6F) эти пробелы являются слишком узкими, чтобы вместить молекулу белка. Еще один аспект сложности добавляют при белок-лиганд связывания должен быть обнаружен. На фиг.10, полосы SERS CH более выражены в спектрах от лиганд-связанным GBP, чем в свободной лиганда один, который может быть гипотетически объяснить изменением конформации GBPпри связывании D-глюкозы 2 7,27, что приводит к более жесткой структуры с повышенной активностью комбинационного рассеяния. Если сравнить два наноструктурированных подложек, СН-группа из лиганда без белка сильнее в спектрах ГКР, полученные с нано-точек подложки, в то время как оба белка и CH глюкозы группы из лиганд-связанного белка более выражены с нано-шестиугольников Подложка. Два фактора, как ожидается, приведет к этим различиям, наличие пространства между Ag есть где GBP может связываться с Ni, и восприимчивость лиганд-связанных и лиганда бесплатно белка электромагнитного повышения комбинационного рассеяния в "горячие точки" между этими функциями. С одной стороны, нано-точек шаблон предлагает относительно большую площадь между функции, где Ni покрытия для белок для связывания, который может объяснить более выраженный CH группу наблюдаемое для глюкозы, свободных GBP на Ag нано-точек подложки. С другой стороны, из-за их неравномерного струкры (рис 6D), Ag нано-шестиугольники может быть подвержен показать сильное электромагнитное усиление в узких промежутках между Ag островов в пределах нано-шестиугольников, в результате сильных полос CH вибрация от глюкозы связаны GBP на нано-шестиугольников подложки. Некоторые детали этого взаимодействия требует дальнейшей проверки и оптимизации ГКР подложек для сложных анализируемых с участием крупных белков, таких как GBP все еще находится в стадии разработки.
Очевидно, что определение SERS связывания лиганда с использованием иммобилизованных молекул, в качестве элемента распознавания облегчается, если только лиганд комбинационного активность в выбранной области, в то время как другие компоненты нет. Это случай Design 3, где получают выраженные SERS полосы аптамера переплете дофамина (рисунок 11). Пара аптамер-дофамин проявляет отличную специфичность и спектре ГКР включает выраженные полосы без каких-либо значительных фонового сигнала.
11,12,13, что позволяет лучше контролировать металл размер наноструктуры и позиции в отношении надежного определения оптимальной конструкции подложки для широкого разнообразия приложений. Масштабируемость из этих методов может впоследствии быть улучшено путем объединения EBL с дополнительными методами нанолитографии, таких как наноВыходные данные литографии 19 к будущему массового производства наноразмерных конструкций оптимизированной используя настраиваемые EBL методы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 11-Mercaptoundecanoic acid (MUA) |  Sigma Aldrich |
450561 ALDRICH | Used for surface functionalization in Design 1 |
| Conductive polymer | Mitsubishi Rayon |
aquaSAVE-57xs | A 70 nm thick layer is used as anti-charging coating for EBL exposures |
| D-glucose | Collaborator Lab. | Ligand in Design 2 | |
| Dopamine | Collaborator Lab. | Ligand in Design 3 | |
| Dopamine binding aptamer (DBA) | Integrated DNA Technologies Inc. |
5'- /Thiol Modifier C6 S-S/ AAAAAAAAAA GTCTCTGTGT GCGCCAGAGA ACACTGGGGC AGATATGGGC CAGCACAGAA TGAGGCCC-3' | Biopolymer in Design 3 |
| Fused silica wafers | Mark Optics |
||
| Glucose binding protein (GBP) | Collaborator Lab. |
PDB ID 2HPH | Biopolymer in Design 2 |
| High vacuum grease | Dow Corning |
Used to seal water-proof chamber | |
| Hydrogen Peroxide 30%, H2O2 | J.T. Baker | Used for pirahna solution | |
| N-ethyl-N'-(3-(dimethylamino) propyl) carbodiimide (EDC) | Sigma Aldrich |
03450 FLUKA | Used for immobilization of biopolymer in Design 1 |
| N-Hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma Aldrich |
130672 ALDRICH | Used for immobilization of biopolymer in Design 1 |
| Potassium phosphate buffer | Collaborator Lab. | Buffer used in Raman sampling | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Collaborator Lab. | Solvent in Design 3 | |
| Polymethylmethacrylate (PMMA) 950 A2 | MicroChem |
A 90 nm thick layer is used as EBL positive tone resist | |
| Recombinant protein A | Protein Mods Inc |
PDB ID 1BDD | Biopolymer in Design 1 |
| Sulfuric acid 96%, H2SO4 | J.T. Baker | Used for pirahna solution | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (TRIS) and ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) buffer | Sigma Aldrich |
T9285 SIGMA | Buffer in Design 3
|
| |
|||
| Equipment | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dicing saw | Diamond Touch Technology Inc. (17301 W Colfax Ave # 152, Golden, CO) |
Used to cut FS wafer | |
| Electron beam evaporator | Kurt J. Lesker |
Used for Au and Ag evaporation | |
| Electron beam evaporator | Johnsen Ultravac (JUV) |
JuV E-gun | Used for Ni evaporation |
| Microscope cover slips (25 mm) | Fisher Scientific |
12-545-102 | Used in water-proof chamber |
| Microscope slides (3×1 in.) | Fisher Scientific |
Used in water-proof chamber | |
| Raith 150TWO EBL exposure system | Raith Inc. |
Raith 150TWO system | Used for EBL exposures |
| Raman microscope | Thermo Scientific |
Nicolet Almega XR | Used for Raman spectroscopy |
| Sonicator system | Branson |
Used for liftoff and solutions mixing | |
| Spinner | Brewer Spinner and Hotplate |
Cee 200X and Cee 1300X | Used to spin-coat PMMA and conductive polymer |
References
- Sapsford, K. E., Tyner, K. M., Dair, B. J., Deschamps, J. R., Medlintz, I. L. Analyzing Nanomaterial Bioconjugates: A Review of Current and Emerging Purification and Characterization Techniques. Anal. Chem. 83, 4453-4488 (2011).
- Walcarius, A., Minteer, S. hD., Wang, J., Yu, L., Merkoçi, A. Nanomaterials for Bio-Functionalized Electrodes: Recent Trends. J. Mater. Chem. B. 1, 4878-4908 (2013).
- Kim, J., et al. Applications, Techniques, and Microfluidic Interfacing for Nanoscale Biosensing. Microfluid. Nanofluid. 7, 149-167 (2009).
- Rassaei, L., Singh, P. S., Lemay, S. G. Lithography-Based Nanoelectrochemistry. Anal. Chem. 83, 3974-3980 (2011).
- Wong, L. S., Khan, F., Micklefield, J. Selective Covalent Protein Immobilization: Strategies and Applications. Chem. Rev. 109, 4025-4053 (2009).
- Ley, C., Holtmann, D., Mangold, K. -M., Schrader, J. Immobilization of Histidine-Tagged Proteins on Electrodes. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 88, 539-551 (2011).
- Kim, D., Herr, A. E. Protein Immobilization Techniques for Microfluidic Assays. Biomicrofluidics. 7, 041501 (2013).
- Anker, J. N., Hall, W. P., Lyandres, O., Shah, N. C., Xhao, J., Van Duyne, R. P. Biosensing with Plasmonic Nanosensors. Nature Materials. 7, 442-453 (2008).
- Bantz, K. C., et al. Recent Progress in SERS Biosensing. Phys.Chem. 13, 11551-11567 (2011).
- Sharma, B., Frontiera, R. R., Henry, A. -I., Ringe, E., Van Duyne, R. P. SERS: Materials, Applications, and the Future. Mater. Today. 15, 16-25 (2012).
- Kleinman, S. L., Frontiera, R. R., Henry, A. -I., Dieringer, J. A., Van Duyne, R. P. Creating, Characterizing, and Controlling Chemistry with SERS Hot Spots. Phys.Chem.Chem.Phys. 15, 21-36 (2013).
- Fan, M., Andrade, F. S., Brolo, A. G. A Review on the Fabrication of Substrates for Surface Enhanced Raman Spectroscopy and their Applications in Analytical Chemistry. Anal. Chim. Acta. 693, 7-25 (2011).
- Cao, Y., Li, D., Jiang, F., Yang, Y., Zh, H. Engineering Metal Nanostructure for SERS Application. J. Nanomater. 123812, 1-12 (2013).
- Glembocki, O., Rendell, R., Alexson, D., Prokes, S., Fu, A., Mastro, M. Dielectric-Substrate-Induced Surface-Enhanced Raman Scattering. Phys. Rev. B. 80, 085416 (2009).
- Merlen, A., et al. Surface Enhanced Spectroscopy with Gold Nanostructures on Silicon and Glass Substrates. Surf. Sci. 605, 1214-1218 (2011).
- Muhammad, M., Buswell, S. C., Dew, S. K., Stepanova, M. Nanopatterning of PMMA on Insulating Surfaces with Various Anticharging Schemes Using 30 keV Electron Beam Lithography. J. Vac. Sci. Technol. B. 29, 06F304 (2011).
- Peters, R., Fito, T., Gutierrez-Rivera, L., Dew, S. K., Stepanova, M. Study of Multilayer Systems in Electron Beam Lithography. J. Vac. Sci. Technol. B. 31, 06F407 (2013).
- Gutierrez-Rivera, L., Peters, R., Dew, S., Stepanova, M. Application of EBL Fabricated Nanostrucutred Substrates for SERS Detection of Protein A in Aqueous Solution. J. Vac. Sci. Technol.B. 31, (2013).
- Gutierrez-Rivera, L., Peters, R., Dew, S., Stepanova, M. Surface-Enhanced Raman Spectroscopy Detection of Protein-Ligand Binding Using D-glucose and Glucose Binding Protein on Nanostructured Plasmonic Substrates. , (2014).
- Peters, R. Fabrication and Testing of Surface-Enhanced Raman Spectroscopy Substrates for the Detection of Biomolecules [MSc Thesis]. , University of Alberta. (2014).
- Gouda, H., Torigoe, H., Saito, A., Sato, M., Arata, Y., Shimada, I. Three-Dmensional Solution Structure of the B Domain of Staphylococcal Protein A: Comparisons of the Solution and Crystal Structures. Biochemistry. 31, 9665-9672 (1992).
- Cuneo, M. J., Johnson, S. J., Beese, L. S., Hellinga, H. W. High Resolution Structure of E. Coli Glucose/Galactose Binding Protein Bound with Glucose. Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB) Protein Data Bank. , (2009).
- Humphrey, W., Dalke, A., Schulten, K. VMD - Visual Molecular Dynamics. J. Molec. Graphics. 14, 33-38 (1996).
- Walsh, R., DeRosa, M. C. Retention of Function in the DNA Homolog of the RNA Dopamine Aptamer. Biochem. Biophys. Res. Comm. 388, 732-735 (2009).
- Akitomi, J., Kato, S., Yoshida, Y., Horii, K., Furuich, M., Waga, I. ValFold: Program for the Aptamer Truncation Process. Biomed. Inf. 7, 38-40 (2011).
- Han, K., Lee, Y., Kim, W. PseudoViewer: Automatic Visualization of RNA Pseudoknots. Bioinformatics. 18, S321-S327 (2002).
- Dwyer, M. A., Hellinga, H. W. Periplasmic Binding Proteins: a Versatile Superfamily for Protein Engineering. Curr. Opin. Struct. Biol. 14, 495-504 (2004).
- Benson, D. E., Conrad, D. W. Design of Bioelectronic Interfaces by Exploiting Hinge-Bending Motions in Proteins. Science. 293, 1641-1644 (2001).
- Bozic, S., Chorzempa, J. Pirahna Cleaning. , University of Alberta. (2011).
- Mohammad, M. A. Raith 150TWO SOP. , University of Alberta. (2011).
- Schmidt, M. W., et al. General Atomic and Molecular Electronic Structure System. J. Comput. Chem. 14, 1347-1363 (1993).
- Bode, B. M., Gordon, M. S. MacMolPlt: a Graphical User Interface for GAMESS. J. of Mol. Graph. Mod. 16, 133-138 (1998).
- Bright, A., Devi, T. S. R., Gunasekaran, S. Spectroscopical Vibrational Band Assignment and Qualitative Analysis of Biomedical Compounds with Cardiovascular Activity. Int. J. Chem. Tech. Res. 2, 379-388 (2010).
- Bandekar, J. Amide Modes and Protein Conformation. Biochim. Biophys. Acta. 1120, 123-243 (1992).
- Barth, A., Zscherp, C. What Vibrations Tell About Proteins. Quarterly Reviews of Biophysics. 35, 369-340 (2002).
- Chrimes, A. F., Khoshmanesh, K. h, Stoddart, P. R. M. itchellA., Kalantar-Zadeh, K. Microfluidics and Raman Microscopy: Current Applications and Future Challenges. Chem. Soc. Rev. 42, 5880-5906 (2013).
- Park, S. -K., Lee, N. -S., Lee, S. -H. Vibrational Analysis of Dopamine Neutral Base based on Density Functional Force Field. Bull.-Korean Chem. Soc. 21, 959-968 (2000).
- Briand, E., Salmain, M., Compère, C., Pradier, C. M. Immobilization of Protein A on SAMs for the elaboration of immunosensors. Coll. Surf. B: Biointerfaces. 53, 215-224 (2006).
- Lakowicz, L. R., et al. Radiative decay engineering: 2. Effects of Silver Island Films on Fluorescence Intensity, Lifetimes, and Resonance Energy Transfer. Analytical biochemistry. 301, 261-277 (2002).
