Abstract
Fabrikasjon og karakterisering av konjugerte nano biologiske systemer grensesnitt metalliske nanostrukturer på fast underlag med immobiliserte biomolekyler er rapportert. Hele sekvensen av relevante eksperimentelle fremgangsmåten er beskrevet, som omfatter fremstilling av nanostrukturerte substrater ved hjelp av elektronstrålelitografi, immobilisering av biomolekyler på substratene, og deres karakterisering utnytte overflate forbedret Raman-spektroskopi (SERS). Tre forskjellige design av nano biologiske systemer er ansatt, inkludert protein A, glukose bindende protein, og en dopamin bindende DNA aptamer. I de to sistnevnte tilfeller binding av respektive ligander, D-glukose og dopamin, er også inkludert. De tre typer av biomolekyler er immobilisert på nanostrukturerte substrater av forskjellige metoder, og resultatene av SERS avbildning blir rapportert. Egenskapene til SERS å detektere vibrasjonsmodi fra overflate immobiliserte proteiner, så vel som for å fange protein-ligand-end aptamer-ligandbindende blir demonstrert. Resultatene viser også innflytelsen av overflatenanostrukturen geometri, biomolekyler immobilisering strategi, Raman-aktivitet av molekylene og tilstedeværelse eller fravær av den ligand binding på SERS spektra ervervet.
Introduction
Evner til å utvikle og karakter konjugerte nano biologiske systemer grensesnitt solide nanostrukturer og biologiske polymerer blir stadig viktigere for ytterligere fremskritt innen neste generasjons bio-sensing og bio-aktiverings teknologier 1,2. Dette innebærer tverrfaglige studier på tvers av en rekke forskningsfelt, for eksempel fabrikasjon av relevante solid-state komponenter (mikro-eller nano-elektroder, nano-konstruert belegg, nanotråder, eller nanopartikler) 2,3,4; immobilisering av biomolekyler på flatene for å skape ønskede bioconjugates 5,6,7; og overvåking av nano biologisk grensesnitt 1. I de fleste tilfeller er valg av optimal fabrikasjon, bio-funksjon, og karakterisering metoder sterkt inter-relatert. Åpenbart vil valget av Nanofabrication teknikker bli drevet av kravene til halvlederkomponenter i systemet, som i stor grad avhengig av påvisningsmetoden, som i turn er bestemt av arten av de biopolymerer som er involvert, og hensikten med å overvåke grenseflaten.
Ut av et bredt spekter av teknikker som brukes for å karakterisere Bioconjugate systemer 1,3, overflaten forbedret Raman-spektroskopi (SERS) har dukket opp som en svært lovende metode for påvisning av kjemiske og biologiske arter på overflater 8,9,10,11. SERS syssels uelastisk spredning av monokromatisk lys ved overflate immobilisert biomolekyler (figur 1) slik at fangst av unike signaturer som tilsvarer molekylære vibrasjoner. Denne evnen til å skille mellom ulike molekyler uten å involvere etiketter, kompleks kjemi, eller tidkrevende trinn, gjør SERS en potensielt svært effektiv metode for bio-gjenkjenning. En annen viktig fordel med SERS er den høye følsomhet. Eksitasjon av lokaliserte overflateplasmons av lys i samspill med edle metall nanostrukturer (SERS substrater) øker dramatisk intensity av Raman spredning av analytten, slik at påvisning av meget små mengder av molekyler, fra monolag ned til enkelt-molekyl grense 8,9,10,11. Endelig er de fleste biomolekyler krever vandige oppløsninger for å være stabil. Fordi vann har ofte begrenset Raman aktivitet, er bakgrunnssignal fra vandige prøver minimert 9. Anvendelser av SERS har utstilt en eksponentiell økning det siste tiåret 10. Men en omdiskutert utfordring SERS er at den elektromagnetiske forbedring av Raman-spredning avhenger kritisk av størrelsen, formen og avstanden mellom metallnanostrukturer hvor Plasmonic bølger blir indusert 11,12,13. For å oppnå effektive og reproduserbare målinger SERS, kontroll over substratet geometri er nødvendig på nanoskala dimensjoner.
Figur 1. Scheme av overflate forbedret Raman-spektroskopi.
Mange metoder som benyttes for å dikte SERS underlag 11,12,13 kan grovt deles inn i bottom-up og top-down metoder. Metoder for den første typen benytter ulike prosesser av selvbygging eller rettet kjemisk syntese å produsere nanostrukturer. Ofte adressert eksempler er immobilisering av monodisperse nanopartikler på faste støtte 11,12,13, termisk, frese, eller elektrokjemisk deponering av ru metall filmer 11,12, og ulike kjemiske syntesemetoder 13. Selv om slike teknikker har en tendens til å være forholdsvis enkel og billig, er de fleste av dem utfordret av en mangel på kontroll over plasseringen av strukturer, og begrenset sample-til-sample reproduserbarhet.
I kontrast, top-down litografi teknikker ansette manipulable instrumenter som partikkelstråler for å skape ønskede mønstre på overflater. En av de mest bruktenanolithography metoder, elektronstråle litografi (EBL), tilbyr suveren kontroll over funksjoner ned til under 10 nm og også en fleksibilitet til å tillate ulike substrat design på fast underlag 11,12. I EBL, en stråle av elektroner rettet ned mot en flekk av noen få nanometer i diameter skanninger tvers av en overflate av et elektron følsomt materiale (motstå) å bevirke en kjemisk forandring i eksponerte områder. For positiv tone motstår som polymethylmethacrylate (PMMA), elektron resultater eksponerings bjelke i spalting av polymerkjedene som utgjør motstå, som fører til en økt løselighet i et passende løsemiddel (utbygger). Prosessen med elektronstrålelitografi omfatter spinn-belegging av et ensartet lag av motstand på et substrat; eksponering av det målrettede motstå materiale i et vakuumkammer med en elektronstråle; og utvikling av prøven for å fjerne de oppløselige områder.
Dielektriske stolper under metalliske nanostrukturer, for eksempel smeltet silisiumdioksid, har been vist til en betydelig øke intensiteten i SERS grunn av lokalisering av Plasmonic bølger i forhold til andre materialer som silisium 14,15. Men EBL mønster på dielektriske underlag, spesielt på nanonivå, innebærer betydelige utfordringer som følge av lade oppbygging under eksponering. Tidligere har vi vist 16,17 at disse vanskelighetene kan overvinnes ved å anbringe ledende polymerlag over resisten. Figur 2 viser en skjematisk fremstilling av den samlede fremstillingsprosess ved bruk av EBL eksponering og utvikling fulgt av metallavsetning og liftoff å produsere metallnanostrukturer for smeltet silisiumdioksydbærere. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Scheme av eLectron bjelke litografi, metall avsetning, og liftoff prosessen trinn ansatt for å dikte metalliske nanostrukturer på dielektriske underlag 16-19. I denne artikkelen presenterer vi hele sekvensen av prosesstrinn som involverer SERS underlag fabrikasjon av EBL, bio-funksjon av underlag, og samling av Raman-spektrene. Tre utførelser utforsket i våre nyere arbeider 18,19 er adressert (se figur 3 og 4, og tabell 1). I design 1, er rekombinant protein A immobilisert på bio-funksjonalisert Au nanostrukturer på et smeltet silisiumdioksyd (FS) støtte 18, og SERS påvisning av proteinet er vist. I Design 2, rekombinant glukose-bindende protein 21,26,27 med og uten ligand (D-glukose) er immobilisert ved hjelp av histidin-koder i mellomrommene mellom Ag nanostrukturer på Ni-belagte FS, og bindingen av glukose til proteinet blir detektert. I Design 3, tiolert dopamin-bindende DNEn aptamer 19,23 er immobilisert på Au nanostrukturer på FS, og binding av dopamin ved immobilisert aptamer blir demonstrert. Inklusive alle relevante eksperimentelle skritt fra forbehandling til Raman spektra oppkjøpet, og representant for ulike biomolekyler og strategier for immobilisering, disse eksemplene er nyttige for et bredt spekter av applikasjoner, fra leting forskning avhør nano-biologisk grensesnitt ved SERS til utvikling av SERS biosensorer av små molekyler som syssels protein- eller aptamer-ligandbinding som en anerkjennelse metode. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Ordninger av tre representative design ved hjelp av ulike biomolekyler, metoder for immobilizasjon, og substrat-materialer: (a) protein A immobilisert på edelmetallnano prikker funksjonalisert ved en selv-sammenstilt monolag (SAM) 11-mercaptodecanoic syre (MUA) i DI vann; (B) histidin-merket glukose-bindende protein (GBP) kompleksdannet med D-glukose immobilisert på substratoverflaten mellom edelmetallnano punkter; (C) tiol-terminert dopamin bindende aptamer ferdig med dopamin (DBA) immobilisert på edle metall nano prikker. Se nærmere omtale i tabell 1. I Design 2 illustrert av panel (B), ble en prøve uten tilsvarende ligand også forberedt for sammenligning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4.Biomolekyler ansatt i tre utførelser: (A) protein A; (B) glukose bindende protein, og D-glukose; (C) dopamin bindende DNA aptamer og dopamin. Protein tertiære strukturer i (a) og (b) er hentet fra Protein Databanken, PDB ID 1BDD 20 og 2HPH 21, henholdsvis, og trukket med VMD for LINUXAMD64, versjon 1.9.1 22. Den aptamer sekundærstruktur i (c) er spådd fra sekvensen 23 bruker ValFold 24 programvare og trukket med PseudoViewer 3.0 25. Bokstavene G, A, T, og C tilsvarer guanin, adenin, tymin, og cytosin nukleotider, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Design 1 Design 2 | Design 3 | ||
| Biopolymer | Protein A | Glukose bindende protein (GBP) | Dopamin bindende aptamer (DBA) |
| Binder | 11-Mercaptoundecanoic syre (MUA) selv-montert monolayer (SAM) | Histidin tags | Tiol linkere |
| Ligand | None | D-glucose | Dopamin |
| Oppløsning | Deionisert (DI) vann | Kaliumfosfatbuffer | Tris (hydroksymetyl) aminometan (TRIS) og etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) buffer; Fosfatbufret saltvann (PBS) |
| Substrat | Au strukturer på FS | Ag strukturer på Ni-belagt FS | Au strukturer på FS |
| Mønstret area | 4 mikrometer x 10 mikrometer | 4 mikrometer x 8 mikrometer | 4 mikrometer x 10 mikrometer |
| Mønster | Au prikker, 50 nm banen | Ag prikker, 40 nm banen | Au sekskanter, 200 nm banen |
| Ag sekskanter, 200 nm banen | Au ustrukturerte pads | ||
| Ag ustrukturerte pads | |||
| EBL eksponeringsdoser | Dots: | Dots: 105 mikrochipen / cm 2 | Hexagons: 180 mikrochipen / cm 2 |
| Array jeg 120 mikrochipen / cm 2 | Hexagons: 170 mikrochipen / cm 2 | ||
| Array II 96 mikrochipen / cm 2 | |||
| Array III 72Mikrochipen / cm 2 | |||
| Laser eksiteringsbølgelengde | 532 nm | 532 nm | 780 nm |
Tabell 1. Tre design av nano biologiske systemer.
Protocol
1. Forbehandling
- Bruk en halvleder dicing så å klippe en smeltet silisiumdioksid (FS) wafer inn en cm x 1 cm eller mindre terninger.
- Rene prøver i en piraja løsning (H 2 SO 4: H 2 O 2, 3: 1; FORSIKTIG: sterk oksidant) bad 28 i 15 min, og skyll terningen i avionisert vann og tørk i nitrogen.
- Plassere prøvene på en kokeplate møte opp ved 180 ° C i 15 min. Kjøle prøvene etter fjerning fra kokeplaten til RT.
- For Designs 1 og 3, går du videre til trinn 2.
- For Design 2 plasser prøven i en elektronstråle fordampning kammer og frakk med en 10 nm lag Ni.
2. Fabrikasjon av Nano-mønstrede PMMA Masker Bruke Electron Beam Litografi (EBL)
- Spin-coat PMMA motstå og ledende lag på underlag.
- Bruk en wafer spinner med et vakuum chuck og plassere prøvene individuelt i sentrum på chucken. Sted1 dråpe av polymetylmetakrylat (PMMA) motstå på midten av prøven ved bruk av en glass-pipette og sentrifugering ved 3500 opm i 60 sek med en 2 sek rampetiden.
- Bake substratene ved 180 ° C i 3-5 min. Etter baking av substratene, avkjøle prøvene til RT.
- Med substratene avkjøles og returneres til spinneren klemmer og spre en dråpe av den ledende polymer på substratet. Snurr substrat for 40 sek ved 3000 rpm med en 2 sek rampetiden. Bake prøvene ved 80 ° C i 1 min.
- Utføre EBL eksponering i henhold til standard prosedyre 16,17,18,29.
- Ved hjelp av produsentens instruksjoner, forberede en eksponering utforming ansette har doser fra tabell 1 med minst mulig bjelke trinnstørrelse.
- Laste prøven inn i elektronstrålelitografi kammeret. Hvis EBL systemet ikke har autofokus, bruk en liten ripe unna der mønsteret er å bli utsatt for og vekk fra beadkanten for fokusing.
- Ved hjelp av produsentens instruksjoner, utføre det nødvendige fokus og astigmatisme korreksjon samt skrivefeltet justering som hensiktsmessig, og utsetter prøven. For å få riktig eksponering profil og beste mønsteret kvalitet, bruk en 30 keV elektronstråle energi og 7,5 mikrometer blenderåpning for eksponeringer.
- Ta av ledende polymer og utvikle utsatte prøver.
- Forbered et beger med deionisert (DI) vann for å fjerne den ledende polymer og en andre begerglass med en fremkallingsblanding (IPA: H 2 O, 7: 3), og omrør i 5 min ved RT. Forbered isopropanol (høy renhet) i en tredje beger som en skyllemiddel.
- Ved hjelp av pinsett, plassere prøvene i vannet i 3 sekunder for å fjerne den ledende polymerfilm, deretter plassere prøven til utbygger og flytte pinsett sakte opp og ned i 20 sek. Umiddelbart overføre substratene til isopropanol og skyll i 10 sekunder, og deretter tørke prøven med nitrogen. </ Ol>
3. Noble Metal nanostrukturer Fabrication
- Laste prøvene opp ned inn i elektronstråle evaporatorsystem for å tillate den fordampede metall som skal avsettes på den fremre flate av prøvene. Deponere en 10 nm tykk Au lag på prøvene for Design 1 og 3, og en 10 nm tykk Ag lag for Design 2 med en hastighet på ca. 0,1 nm / sek.
- Fyll en ultralydsystem til anbefalt nivå med vann og fylle et separat begerglass med aceton. Plassere en prøve med forsiden opp i bunnen av begeret og la prøven å suge i 10 min. Holder begeret, plassere den i vannbad og la høyden av aceton for å passe høyde over vannet og slå på ultralydsystem. Tillate ultralyd å skje i opptil 60 sek.
- Ved bruk av samme fremgangsmåte som beskrevet i trinn 3.1, utarbeide ensartede Au og Ag pad underlag ved deponering av 10 nm tykke metall filmer på FS (Design 1 og 3) og Ni-belagt FS (Design 2) substrater hoppe trinn 2.
4. Bio-funksjonalisering av Underlag
- Forberede Design en prøver:
- Forberede en 1 mM løsning av 11-mercaptodecanoic syre (MUA) i etanol ved RT. Sonikere i 10 min.
- Dyppe riktig nanostrukturerte substrat i oppløsning av MUA i 48 timer. Skyll prøven med etanol tre ganger og tørke i 5 minutter ved RT.
- Tilbered en 75 mM løsning av N-etyl-N '- (3- (dimetylamino) propyl) karbodiimid (EDC) i deionisert vann. Forberede en 15 mM løsning av N hydroksysuccinimid (NHS) i DI vann.
- Ved hjelp av en mikropipette innskudd 100 ul av NHS på Au på underlaget, og umiddelbart tilsett 100 ul av EDC i det samme området. Inkuber i 1 min for å aktivere selvmonterte monosjikt (SAM) av MUA.
- Plasser en 100 ul dråpe av protein A-oppløsning (47 mM) på samme område av substratet og lagre prøven i 24 timer ved 5 ° C i et flerrommet Petri dish med 1 ml DI-vann i et annet kammer, og med et tettsluttende lokk.
- Skyll prøven i DI-vann 3 ganger ved kontinuerlig omrøring av prøvene i separate begerglass i 20 sekunder i hvert begerglass. Ikke la prøvene tørke etter skylling eller under skylling.
- Gå videre til trinn 5.
- Forberede Design to prøver:
- Forberede en 0,9 mM løsning av glukose bindende protein (NOK) i kaliumfosfatbuffer (K 2 HPO 4, 25 mM, pH 7,5). Forberede en 100 mM løsning av D-glukose i bufferen.
- Bland 30 ul av 100 mM D-glukose-løsning og 30 pl av 0,9 mM GBP-løsning ved anvendelse av en 1 ml plast mikrorør beholder og en mikropipette. Inkuber i 30 min.
- Innskudd 20 ul av ligand-fri GBP løsning og av den ligand-bundne GBP-løsning hver av de fremstilte substrater ved hjelp av en mikropipette. Lagring av prøvene ved 5 ° C i 24 timer i en petriskål med et tettsluttende lokk.
- Skyll prøvene tre ganger ikaliumfosfatbufferoppløsning ved romtemperatur.
- Gå videre til trinn 5.
- Forberede Design 3 prøver:
- Fortynn dopamin-bindings aptamer (DBA) oppløsning til en konsentrasjon på 1 pM hjelp av TRIS-EDTA-buffer med en endelig pH på 7,4.
- Tilbered en dopamin-løsning til en 5 pM konsentrasjon ved å måle dopamin pulver på en analytisk vekt, og å blande den i fosfatbufret saltvann (PBS) med en røre vulst i 5 min.
- Avsette et 20 ul dråpe av DBA løsning på overflaten av hvert substrat og la prøvene stå i 1 time ved RT med et deksel over petriskålen.
- Skyll prøvene tre ganger i en kaliumfosfatbuffer (K 2 HPO 4, 25 mm, pH 7,5).
- Plassere prøvene stående på toppen av et renrom karakter tørke til tørke baksiden og samtidig opprettholde en film på forsiden av substratet. Sette et eksempel til side som en kontroll.
- Plasser en 5 mL dråpe av dopamin løsning on overflaten av eksisterende dråpe av PBS-buffer-løsning på de resterende prøver med de ønskede dopamin-konsentrasjoner. Inkuber prøven i 10 min.
- Plassere en dråpe av dopamin løsning på Au puten overflate uten aptamer. Inkuber i 10 min.
- Skyll prøvene i kaliumfosfatbufferoppløsning 3 ganger.
5. Raman spektroskopi
- Plassere hver prøve i et vanntett kammer for å unngå fordampning av laserstråling.
- Fyll en plastsprøyte med kjemisk inert høyt vakuum fett, sted prøver på objektglass og dispensere noen millimeter av fett rundt prøvene uten å berøre prøvene.
- Plassere et mikroskop dekkglass på toppen av substratene og forsiktig trykk ned for å danne en tetning, og skaper en tynn væskegrenseflaten mellom substratene og glassene uten at bufferen for å komme i kontakt med vakuumfett.
- Ved hjelp av enRaman optisk mikroskop systemet, få en vekt på overflaten av metallet nano-mønstrede område som skal avsøkes uten å slå på laser.
- Utføre Raman prøvetaking 18,19 med en laser intensitet mellom 2,4-3,1 mW med en samlet varighet på mindre enn 20 sekunder å hindre skade på prøven med et mål om 10X forstørrelse. Erverve Raman spektra for prøver fra Design 1, 2 og 3 ved hjelp av eksitasjonsbølgelengdene som angitt i tabell 1. Også erverve kontroll Raman spektra for løsninger av protein A, GBP, og D-glukose, og for dopamin pulver ansette glass uten metall nanostrukturer som støtter for sammenligning.
Representative Results
Å samle kontroll Raman-spektrene for de viktigste komponentene, inkludert frie proteiner i oppløsning og frie ligander i løsning eller i pulverform uten anvendelse av metall-inneholdende substrater, er viktig for å muliggjøre en riktig sammenligning så vel som for tolkningsformål. Figur 5A viser et typisk Raman spektrum for gratis protein A i DI vann på et glass lysbilde uten nanostrukturerte overflater. To band med høyest Raman intensitet, bandet på 2931 cm -1 og ved 1091 cm -1, tilsvarer vibrasjoner involverer CH og CS obligasjoner, henholdsvis. Andre bånd med en lavere Raman intensitet som for eksempel 563 cm-1, 1450 cm-1, 1653 cm-1 og 2426 cm -1, kan tilbakeføres til en superposisjon av vibrasjonsmodi 18,32,33,34. Kontroll Raman-spektrene for liganden fri GPB i bufferløsning med tre forskjellige konsentrasjoner, 0,3, 0,9 og 1,3 mm, og er vist i figur 5B. I t han regne, den brede bånd rundt 3400 cm -1 tilsvarer løsemiddel 35, mens bandet på 2935 cm -1 representerer vibrasjoner involverer CH bindinger av proteinet 32,33. figur 5C viser høy bølgelengde Raman spektrum for D-glukose i bufferoppløsning for forskjellige konsentrasjoner: 1, 6, 100, 200 og 400 mM. Når konsentrasjonen av glukose øker, CH bindinger vibrasjonsbånd oppstår ved 2890 cm-1 og 2960 cm -1. Kontroll Raman-spektra av dopamin i krystallform som oppnås med både 532 nm og 780 nm eksitasjon bølgelengder er vist i figur 5D. Mye av den Raman-spektrum kommer fra benzenringen bøying og CH obligasjoner strekninger av molekylet 19,36. Noen av båndene i området rundt 3000 cm -1 kun observert ved 532 nm, men ikke 780 nm eksitasjonsbølgelengde.
pload / 52712 / 52712fig5.jpg "/>
Figur 5. Styre Raman-spektrum av protein A i DI vann erholdt ved 532 nm eksitasjonsbølgelengde 18 (A); Raman-spektrene av ligand-fri glukose bindende protein i buffer-oppløsning erholdt ved 532 nm eksitasjonsbølgelengde (B); Raman-spektrene av D-glukose i bufferoppløsning erholdt ved 532 nm eksitasjonsbølgelengde (C); og spektra av dopamin-pulver oppnådd ved 532 nm og 780 nm eksitasjonsbølgelengdene 19 (D). Alle spektrene er vanlig Raman-spektra av løsninger (a, b, c) og pulver (d) på objektglass uten nanostrukturerte substrater. I (D), ble tildelingen av Raman skift regimer til ulike molekylære vibrasjoner gjøres ved hjelp Generelt Atomic og molekylær Electronic Structure System (GAMESS) 30 og MacMolPlt 31 programvaren som beskrevet andre steder 19. Gjengitt panel (a) med tillatelse fra 18 ameriken Vacuum Society. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
For å få SERS spektra for overflate immobilisert biomolekyler, er underlag bestående metalliske nanostrukturer på smeltet silisiumdioksydbærere fabrikkert som beskrevet i trinn 1-3. Kvaliteten av fabrikkerte substrater blir overvåket ved hjelp av scanning elektronmikroskopi (SEM). Standard SEM prosedyrer er beskrevet andre steder 16,17,18, 19 og ikke inkludert i denne protokoll. Figur 6 viser representative SEM bilder av Au og Ag nano prikker og nano-seks lignende strukturer (paneler annonse), så vel som ikke -structured Au og Ag puter (panelene E og F, respektivt). De neste trinnene skal immobilisering av biologisk materiale på nanostrukturerte underlag ansette tre design oppført i tabell 1, og oppkjøpet av deres SERS spektra. I o rder for å opprettholde et vandig miljø under Raman avbildning, blir hver prøve plassert i den tilsvarende oppløsning (se tabell 1), lukket med en tynn dekkglass, og forseglet som vist på figur 7.
Figur 6. Scanning elektronmikroskop (SEM) bilder av 10 nm tykke Au og Ag overflatenanostrukturer ansatt som Sers underlag: (A, B) matriser av nanodots; (C, D) matriser av nano-sekskanter; (E, F) ustrukturerte pads. Substrater med Au strukturer (venstre) ansette FS støtter, mens substrater med Ag strukturer (til høyre) bruker en 10 nm tykk Ni belegg på FS. Bildene ble oppnådd som beskrevet andre steder 16,17,18.pg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7. Scheme av vanntett kammer for Raman avbildning av bio-funksjon prøver i løsningen.
I design 1, er rekombinant protein A immobilisert på substratene funksjonalisert ved en selv-sammenstilt monolag av 11-mercaptodecanoic syre (MUA) i DI vann 18. Substratene i denne konstruksjon består av tre rekker av Au prikker med en 50 nm pitch og varierende inter-punktavstander på smeltet silisiumdioksyd (se figurene 6A og 8). Prosessen immobilisering av protein begynner med dannelsen av en SAM på substratene. For å oppnå kovalent binding mellom SAM og proteinet, er karboksylsyregrupper Sams omdannet til aminreaktiv NHS-ester ved behandling med en blanding av N em>-etyl-N '- (3- (dimetylamino) propyl) karbodiimid (EDC) og N-hydroksysuccinimid-løsning (NHS) oppløsning i deionisert vann. Immobilisering av protein A skjer ved forskyvning av NHS-gruppen ved lysinrester av proteinet 37. Et eksempel på et avbildnings prøver for design 1 med protein A immobilisert på Au nanostrukturer er vist i figur 9. Fig. 9A viser et optisk mikroskopbilde av prøvene, som omfatter tre rekker av bio-funksjonalisert Au nanodots med forskjellige inter-punkt hull (se også Figurene 3AA og 8), og figur 9B viser Raman-spektral kartlegging over disse matriser. Det kan sees at de høyeste Raman-intensitetene er funnet for Array I hvor de inter-punkt gapene er den smaleste, mens lavere intensiteter blir oppnådd for Array III med de bredeste inter-punkt hull. Dette kan forklares med en sterkere plasmon koblingseffekt produsert av høyere elektrisk fylds i de trange mellomrom mellom prikkene 18. Figur 9C viser den sterkeste SERS spektra for Arrays I og II. Spektrene inneha flere band (1630 cm -1, 1964 cm -1, 2280 cm -1, 2577 cm -1 og 2916 cm -1) i nærhet til Raman moduser av gratis protein A i løsning sett i figur 5A. Tilskrives vibrasjoner av ulike obligasjoner finnes i proteiner, disse bandene enten vises på lignende steder i både immobilisert protein og i løsning, eller er litt forskjøvet til noe høyere bølgetall når immobilisert. I kontrast, SERS spektra av lignende nanostrukturerte underlag funksjonaliseres av MUA SAM uten proteinet viser et helt annet mønster 18, bekrefter at figur 9 representerer SERS kartlegging av overflate immobilisert protein A. Klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 8. SEM bilder av tre matriser av Au nanodots på FS underlaget som brukes i Design en 18. De arrays har samme 50 nm banen og litt annerledes dot radier som resulterer i forskjellige bredder av inter-dot hull. Dette oppnås ved å anvende forskjellige EBL eksponeringsdoser for å frembringe PMMA masker for de tre matriser (se tabell 1). Høyere eksponeringsdoser resultere i større hull i PMMA masker, noe som åpner for større Au punktstørrelser etter metallise og oppskytning. Gjengitt med tillatelse fra 18 amerikanske Vacuum Society. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
les / ftp_upload / 52712 / 52712fig9.jpg "/>
Figur 9. SERS avbildning av substrat-immobilisert protein A i design 1 18. (A) Optisk mikroskopbilde av prøven, som omfatter tre rekker av Au nanodots med 50 nm pitch og forskjellige inter-punkt hull på en sammensmeltet silika-substrat (se også Figur 6), bio-funksjonalisert, som vist i figur 3A. (B) Raman kartlegging av prøven. (C) SERS spektra fra dot Array I og II. I panel (B), representerer den vertikale aksen av avstanden på tvers av substratet, representerer den horisontale aksen Raman-skiftet, og forklaringen linjen viser Raman-intensitetene. Vertikal stiplede linjer i paneler (B) og (C) representerer referanse Raman-bånd av fritt protein A i oppløsning, og (*) i panelet (C) viser SERS band fra Array I. Raman-spektrene ble oppnådd 532 nm eksitasjonbølgelengde. Gjengitt med tillatelse fra 18 amerikanske Vacuum Society. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
I Design 2, er rekombinant, glukose-bindende protein (GBP) 21 kompleksdannet med D-glukose (ligand) immobilisert på de passende substrater i kaliumfosfatbufferoppløsning. Prøver med immobilisert ligand-fri GBP er også forberedt for sammenligning. I denne utformingen, er glukose-bindende protein er festet til overflaten ved hjelp av et histidin-tag, som binder godt til Ni, men ikke til edelmetaller 6. Siden substratene omfatter rekker av Ag nano prikker, nanosekskanter, og ustrukturerte Ag puter på Ni-belagte FS (figurene 6B, 6D og 6F, respektivt), kan man forvente de fleste av immobiliserte proteinmolekyler til å være plassert i gapene mellom Ag nanostruktu- hvor Ni belegget er available. Raman-spektrene ble oppnådd for immobilisert glukose-fri og glukose-bundet GBP er vist i figurene 10A og 10B, respektivt. Alle disse spektra viser en bred-bånd ved ca. 3300 cm-1, som svarer til bufferløsningen 35. Den fås med en ustrukturert Ag pad spektra inneholde bare denne ene bandet og ikke viser noen protein vibrasjonsmodi, som bekrefter at immobilisert protein ikke er funnet på Ag overflaten som forventet. I motsetning til spektrene oppnådd med matriser av Ag nano prikker og nano-sekskanter oppviser bånd rundt 1550 cm -1 og 2900 cm-1, som representerer analytten 32,33. Spesielt de brede bånd rundt 1550 cm-1, kjent som amid II bånd, skyldes peptidbindinger i proteiner vibrasjoner 33,34. I tilfellet betraktes, representerer dette bandet en superposisjon av de vibrasjonsmodi fra GBP immobilisert på Ni flaten mellom Ag-funksjonens, og er en indikasjon på SERS forbedring av disse modusene i nærheten av edelmetallnanostrukturer når de substrater som inneholder nano prikker eller nanosekskanter er brukt. Dette bandet er meget svak for proteinet i oppløsning i fravær av SERS forsterkning (figur 5B) og fraværende på Ag elektrodene uten Ni overflate tilgjengelig for proteinbinding, men det er godt markert for nanostrukturerte substrater med noen Ni overflate tilgjengelig for proteinet å binde. Men enda viktigere for denne studien er de andre, smalere band rundt ca 2900 cm -1 som kan henføres til CH bindingen wibrations 32,33. Spekteret av glukose-fri GBP viser en markant band på 2933 cm -1 med nano-prikker underlaget, og en svak men merkbar bandet på en lignende bølgelengde med nano-sekskanter substrat (figur 10A). Til forskjell fra tilfellet med glukose fritt protein, den SERS spektra av glukose-bundet GBP vist i Figu re 10B utstillings to band som svarer til CH obligasjoner vibrasjoner regimer, på 2850 cm -1 og 2910 cm -1. Båndene er også markert i spekteret for glukose-bundet GBP på nano-heksagoner substrat, og de kan også sees i spekteret for GBP på nano prikker substrat. Båndet ved 2850 cm-1 er rimelig nær de 2890 cm -1 en i styre Raman spekteret fra D-glukose i oppløsning, og det kan derfor tilskrives glukose bundet til proteinet, mens det andre bånd (ved 2910 cm -1) skyldes CH obligasjons vibrasjoner av både protein og glukose. Man kan konkludere med at differansen av SERS signaturer fra glukose-fri og glukose-bundet substrat-immobilisert GBP kan observeres i denne regionen, og CH obligasjoner vibrasjoner av protein-bundet glukose er detekterbar ved anvendelse av den beskrevne konstruksjon.
10.jpg "/>
Figur 10. SERS spektra av ligand-fri (A) og ligand-bundet (B) glukose-bindende protein immobilisert på tre ulike underlag i Design 2. Spektrene ble oppnådd med 780 nm eksitasjon bølgelengde. Klikk her for å se en større versjon av denne figur.
I Design 3 er tilpasset dopaminbinding aptamer (DBA) med tiol terminering 23 immobilisert på substratet i tris (hydroksymetyl) aminometan (TRIS) etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) buffer løsning og dopamin blir deretter bundet til det immobiliserte aptamer 19. De substrater for dette designet som inneholder matriser av Au nanosekskanter på FS (figur 6C). Ustrukturerte Au pads (figur 6E) brukes også til kontrollformål. Siden DNA er egentlig fluorescerende 38, 780 nm eksitasjon waveleng th brukes i Design 3 for å redusere denne faktor. I denne utformingen, blir gjenkjenningselementet (aptamer) ikke Raman aktive i regionen av Raman skift muligens i figur 11, mens dopamin viser en betydelig Raman-aktivitet i denne regionen. Siden signalet fra prøvene eksponert for bare dopamin uten immobilisert aptamer viser ingen resulterende dopaminbånd 19, blir de observerte SERS bånd antas å stamme fra aptamer-bundet dopamin. Figur 11 sammenligner den SERS spektra av immobilisert aptamer på gullnanostrukturer før og etter tilsetning av dopamin. Som forventet, betyr immobilisert dopamin-fri aptamer ikke viser Raman band. I kontrast er en rekke markante Raman band observert for dopamin-bundet immobilisert aptamer. Posisjonene til de fleste bånd i figur 11 er i nærheten av de i krystallinsk dopamin, riktignok med forskjeller i amplituder.
igur 11 "src =" / files / ftp_upload / 52712 / 52712fig11.jpg "/>
Figur 11. SERS spektra av ligand-fri (lilla linje) og ligand-bundet (blå linje) dopamin-bindende aptamer immobilisert på Au nano-sekskant underlag i Design 3 19. Den røde linjen viser en kontroll SERS spekter av dopamin pulver. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
SERS er å få en anerkjennelse som en ekstremt kraftig teknikk av bio-deteksjon tilbyr mange unike fordeler. Forholdet med molekylære vibrasjoner gjør det mulig selektivt å identifisere "fingeravtrykk" av bestemte analytter fra SERS spektra, mens den ekstremt høye følsomhet som gjør det mulig å detektere meget små mengder av analytten 9,10,11,35. Videre er SERS en destruktiv teknikk som også er relativt ufølsom for vann, og dermed er det veldig godt egnet for undersøkelser av biologisk materiale i sitt naturlige vandig miljø 9. Resultatene presenteres understreke disse fordelene samt ytterligere demonstrere stort potensial for SERS som en svært fleksibel etikett-fri teknikk av bio-gjenkjenning. I tre utførelser som anvender monolag av forskjellige substrat-immobiliserte biomolekyler, har Raman modi blitt oppdaget at kunne trygt tilskrives de spesielle analytter. At påvisning av disse biomolekyler, or deres respektive ligander, har blitt demonstrert ved anvendelse av plane overflater av smeltet silisiumdioksyd som støtte for SERS substrater, gjør de utførelser som er kompatible med dagens elektronikk og Microfluidics innstillinger, lovende tallrike anvendelser i forbindelse med nye bio-elektronisk grensesnitt arkitekturer biologiske materialer med overflater av elektroniske og elektrokjemiske enheter 2,3. Viktigere, i to av tre design SERS deteksjon er vist for spesifikk binding av små molekyler, som glukose og dopamin, syssels monolag av overflaten-immobilisert protein og aptamer, henholdsvis som gjenkjennelseselementer.
Imidlertid bør flere aspekter tas vare på for å oppnå en effektiv SERS bio-deteksjon i "on-chip" innstilling. Først av alt, en velkjent utfordring som er vanlig for de fleste biomolekyler er deres tilbøyelighet til å nedbrytes, særlig når de utsettes for ikke-naturlige tilstander slik som tørr omgivmiljø eller intense laserlys. Gjennom protokollen, har vi understreket viktigheten av alltid å holde bio-funksjon prøver nedsenket i hensiktsmessige løsninger under hele forsøket, fra utarbeidelse av prøvene til oppkjøpet av Raman spektra. For den sistnevnte, har en tilpasset vanntette kammer er konstruert (figur 7) for å unngå fordampning av væsken under lasereksponering. Varigheten av eksponeringen og laserintensiteten bør også være begrenset, som beskrevet i trinn 5.3 i protokollen for å unngå skade på prøvene.
Resultatene av SERS deteksjon er funnet følsom for geometrien av substratet som anvendes, og spesielt inter-funksjonen separering av de metalliske nanostrukturer. Som det fremgår av figurene 8 og 9, den SERS intensiteten av Design en prøvene sterkt avhengig av bredden av gapene mellom Au nano prikker på smeltet silisiumdioksyd. Ut av tre matriser av Au nanodots testet jegn denne utforming (figur 8) blir den høyeste Raman intensitet som oppnås med Array I, som har den smaleste mellomrom mellom Au funksjoner og derfor gir en mer effektiv elektromagnetisk feltøkning. Som figur 9 viser, er kontroll av inter-funksjonen separasjoner på nivå med 10 til 20 nm eller mindre nødvendig. Ansette EBL for å fabrikkere Sers underlag, som demonstrert her, gir en effektiv oppløsning spesielt for å kontrollere bredden på inter har hull. Med en positiv-tone EBL motstå slik som PMMA, kan størrelsen på hullene i PMMA masker varieres ved ganske enkelt å endre eksponeringsdoser. Etter avløftingen dette resulterer i forskjellige størrelser av metall prikker, og bredden av spaltene mellom punkter kan innstilles etter ønske ved å velge riktig EBL eksponeringsdoser 18.
Den andre utfordringen er optimalisering av geometri SERS substrat for spesifikke bio-deteksjon søknad. Selv om forbedring effekt increases med en nedgang på mellom har hull, den relativt store størrelsen på biologiske molekyler pålegger begrensninger på hvor smal hullene kan være. Det er tydelig fra resultatene for Design 2, hvor immobiliseringen fremgangsmåte er slik at proteinet effektivt kun bindes til overflaten mellom edelmetall prikker, men ikke til de punkter selv (se figur 3B). Som det følger av figur 10, gjør SERS spektra for ustrukturerte Ag pads ikke vise noen band fra analytten. Selv om pads utviser en nano-krystallinsk struktur med svært tynne inter-øya hull (se figur 6F) disse hullene er for smale til å romme et proteinmolekyl. Enda en annen dimensjon av kompleksitet tilsettes når protein-ligand-binding må bli detektert. I figur 10 er SERS CH band er mer uttalt i spektrene fra ligand-bundet GBP enn i ligand-fri en, som kan være hypotetisk forklares ved en endring i GBP konformasjonved binding av D-glukose 2 7,27, noe som resulterer i en mer stiv konstruksjon med øket Raman-aktivitet. Hvis man sammenligner de to nanostrukturerte underlag, CH band fra ligand-free protein er sterkere i SERS spektra tatt med nano-prikker substrat, mens både protein og glukose CH band fra ligand-bundet protein er mer uttalt med nano-sekskanter substrat. To faktorer forventes å resultere i disse forskjellene, tilgjengeligheten av plass mellom Ag har der GBP kunne binde seg til Ni, og mottakelighet av ligand-bundet og ligand gratis protein til den elektromagnetiske forbedring av Raman spredning i "hot spots" mellom disse funksjonene. På den ene siden, nano prikker mønster gir en relativt større inter-funksjonen område hvor Ni belegget er tilgjengelig for å binde proteinet, noe som kan forklare en mer uttalt CH båndet observert for glukose-fri GBP på Ag nano prikker substrat. På den annen side, på grunn av deres ikke-uniform strukTure (se figur 6D), kan Ag nano-sekskanter være tilbøyelige til å vise en sterkere elektro forbedring i trange åpninger mellom Ag øyene innenfor nanosekskanter som fører til sterkere CH vibrasjons band fra glukose-bundet GBP på nano-sekskanter underlaget. Noen detaljer av denne veksel krever ytterligere verifisering, og optimalisering av SERS substrater for komplekse analytter som involverer store proteiner slik som GBP er fortsatt i rørledningen.
Åpenbart er SERS påvisning av ligand binding anvender immobiliserte biomolekyler som en gjenkjenningselementet lettes når bare liganden er Raman aktiv i et valgt område, mens de andre komponenter er ikke. Dette er tilfellet for oppbygging 3, hvor de forklarte SERS bånd aptamer-bundet dopamin erholdt (figur 11). Den aptamer-dopamin paret viser utmerket spesifisitet og SERS spekteret omfatter uttalt band uten betydelig bakgrunnssignal.
11,12,13, noe som åpner for en bedre kontroll av metall nanostrukturen størrelse og plassering mot en pålitelig identifisering av optimal underlaget design for et bredt spekter av applikasjoner. Skalerbarhet av disse teknikkene kan senere bli bedre ved å kombinere EBL med utfyllende nanolithography metoder som nanoavtrykk litografi 19 mot fremtidig masseproduksjon av nanoskala design optimalisert ansette tunbare EBL teknikker.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 11-Mercaptoundecanoic acid (MUA) |  Sigma Aldrich |
450561 ALDRICH | Used for surface functionalization in Design 1 |
| Conductive polymer | Mitsubishi Rayon |
aquaSAVE-57xs | A 70 nm thick layer is used as anti-charging coating for EBL exposures |
| D-glucose | Collaborator Lab. | Ligand in Design 2 | |
| Dopamine | Collaborator Lab. | Ligand in Design 3 | |
| Dopamine binding aptamer (DBA) | Integrated DNA Technologies Inc. |
5'- /Thiol Modifier C6 S-S/ AAAAAAAAAA GTCTCTGTGT GCGCCAGAGA ACACTGGGGC AGATATGGGC CAGCACAGAA TGAGGCCC-3' | Biopolymer in Design 3 |
| Fused silica wafers | Mark Optics |
||
| Glucose binding protein (GBP) | Collaborator Lab. |
PDB ID 2HPH | Biopolymer in Design 2 |
| High vacuum grease | Dow Corning |
Used to seal water-proof chamber | |
| Hydrogen Peroxide 30%, H2O2 | J.T. Baker | Used for pirahna solution | |
| N-ethyl-N'-(3-(dimethylamino) propyl) carbodiimide (EDC) | Sigma Aldrich |
03450 FLUKA | Used for immobilization of biopolymer in Design 1 |
| N-Hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma Aldrich |
130672 ALDRICH | Used for immobilization of biopolymer in Design 1 |
| Potassium phosphate buffer | Collaborator Lab. | Buffer used in Raman sampling | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Collaborator Lab. | Solvent in Design 3 | |
| Polymethylmethacrylate (PMMA) 950 A2 | MicroChem |
A 90 nm thick layer is used as EBL positive tone resist | |
| Recombinant protein A | Protein Mods Inc |
PDB ID 1BDD | Biopolymer in Design 1 |
| Sulfuric acid 96%, H2SO4 | J.T. Baker | Used for pirahna solution | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (TRIS) and ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) buffer | Sigma Aldrich |
T9285 SIGMA | Buffer in Design 3
|
| |
|||
| Equipment | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dicing saw | Diamond Touch Technology Inc. (17301 W Colfax Ave # 152, Golden, CO) |
Used to cut FS wafer | |
| Electron beam evaporator | Kurt J. Lesker |
Used for Au and Ag evaporation | |
| Electron beam evaporator | Johnsen Ultravac (JUV) |
JuV E-gun | Used for Ni evaporation |
| Microscope cover slips (25 mm) | Fisher Scientific |
12-545-102 | Used in water-proof chamber |
| Microscope slides (3×1 in.) | Fisher Scientific |
Used in water-proof chamber | |
| Raith 150TWO EBL exposure system | Raith Inc. |
Raith 150TWO system | Used for EBL exposures |
| Raman microscope | Thermo Scientific |
Nicolet Almega XR | Used for Raman spectroscopy |
| Sonicator system | Branson |
Used for liftoff and solutions mixing | |
| Spinner | Brewer Spinner and Hotplate |
Cee 200X and Cee 1300X | Used to spin-coat PMMA and conductive polymer |
References
- Sapsford, K. E., Tyner, K. M., Dair, B. J., Deschamps, J. R., Medlintz, I. L. Analyzing Nanomaterial Bioconjugates: A Review of Current and Emerging Purification and Characterization Techniques. Anal. Chem. 83, 4453-4488 (2011).
- Walcarius, A., Minteer, S. hD., Wang, J., Yu, L., Merkoçi, A. Nanomaterials for Bio-Functionalized Electrodes: Recent Trends. J. Mater. Chem. B. 1, 4878-4908 (2013).
- Kim, J., et al. Applications, Techniques, and Microfluidic Interfacing for Nanoscale Biosensing. Microfluid. Nanofluid. 7, 149-167 (2009).
- Rassaei, L., Singh, P. S., Lemay, S. G. Lithography-Based Nanoelectrochemistry. Anal. Chem. 83, 3974-3980 (2011).
- Wong, L. S., Khan, F., Micklefield, J. Selective Covalent Protein Immobilization: Strategies and Applications. Chem. Rev. 109, 4025-4053 (2009).
- Ley, C., Holtmann, D., Mangold, K. -M., Schrader, J. Immobilization of Histidine-Tagged Proteins on Electrodes. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 88, 539-551 (2011).
- Kim, D., Herr, A. E. Protein Immobilization Techniques for Microfluidic Assays. Biomicrofluidics. 7, 041501 (2013).
- Anker, J. N., Hall, W. P., Lyandres, O., Shah, N. C., Xhao, J., Van Duyne, R. P. Biosensing with Plasmonic Nanosensors. Nature Materials. 7, 442-453 (2008).
- Bantz, K. C., et al. Recent Progress in SERS Biosensing. Phys.Chem. 13, 11551-11567 (2011).
- Sharma, B., Frontiera, R. R., Henry, A. -I., Ringe, E., Van Duyne, R. P. SERS: Materials, Applications, and the Future. Mater. Today. 15, 16-25 (2012).
- Kleinman, S. L., Frontiera, R. R., Henry, A. -I., Dieringer, J. A., Van Duyne, R. P. Creating, Characterizing, and Controlling Chemistry with SERS Hot Spots. Phys.Chem.Chem.Phys. 15, 21-36 (2013).
- Fan, M., Andrade, F. S., Brolo, A. G. A Review on the Fabrication of Substrates for Surface Enhanced Raman Spectroscopy and their Applications in Analytical Chemistry. Anal. Chim. Acta. 693, 7-25 (2011).
- Cao, Y., Li, D., Jiang, F., Yang, Y., Zh, H. Engineering Metal Nanostructure for SERS Application. J. Nanomater. 123812, 1-12 (2013).
- Glembocki, O., Rendell, R., Alexson, D., Prokes, S., Fu, A., Mastro, M. Dielectric-Substrate-Induced Surface-Enhanced Raman Scattering. Phys. Rev. B. 80, 085416 (2009).
- Merlen, A., et al. Surface Enhanced Spectroscopy with Gold Nanostructures on Silicon and Glass Substrates. Surf. Sci. 605, 1214-1218 (2011).
- Muhammad, M., Buswell, S. C., Dew, S. K., Stepanova, M. Nanopatterning of PMMA on Insulating Surfaces with Various Anticharging Schemes Using 30 keV Electron Beam Lithography. J. Vac. Sci. Technol. B. 29, 06F304 (2011).
- Peters, R., Fito, T., Gutierrez-Rivera, L., Dew, S. K., Stepanova, M. Study of Multilayer Systems in Electron Beam Lithography. J. Vac. Sci. Technol. B. 31, 06F407 (2013).
- Gutierrez-Rivera, L., Peters, R., Dew, S., Stepanova, M. Application of EBL Fabricated Nanostrucutred Substrates for SERS Detection of Protein A in Aqueous Solution. J. Vac. Sci. Technol.B. 31, (2013).
- Gutierrez-Rivera, L., Peters, R., Dew, S., Stepanova, M. Surface-Enhanced Raman Spectroscopy Detection of Protein-Ligand Binding Using D-glucose and Glucose Binding Protein on Nanostructured Plasmonic Substrates. , (2014).
- Peters, R. Fabrication and Testing of Surface-Enhanced Raman Spectroscopy Substrates for the Detection of Biomolecules [MSc Thesis]. , University of Alberta. (2014).
- Gouda, H., Torigoe, H., Saito, A., Sato, M., Arata, Y., Shimada, I. Three-Dmensional Solution Structure of the B Domain of Staphylococcal Protein A: Comparisons of the Solution and Crystal Structures. Biochemistry. 31, 9665-9672 (1992).
- Cuneo, M. J., Johnson, S. J., Beese, L. S., Hellinga, H. W. High Resolution Structure of E. Coli Glucose/Galactose Binding Protein Bound with Glucose. Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB) Protein Data Bank. , (2009).
- Humphrey, W., Dalke, A., Schulten, K. VMD - Visual Molecular Dynamics. J. Molec. Graphics. 14, 33-38 (1996).
- Walsh, R., DeRosa, M. C. Retention of Function in the DNA Homolog of the RNA Dopamine Aptamer. Biochem. Biophys. Res. Comm. 388, 732-735 (2009).
- Akitomi, J., Kato, S., Yoshida, Y., Horii, K., Furuich, M., Waga, I. ValFold: Program for the Aptamer Truncation Process. Biomed. Inf. 7, 38-40 (2011).
- Han, K., Lee, Y., Kim, W. PseudoViewer: Automatic Visualization of RNA Pseudoknots. Bioinformatics. 18, S321-S327 (2002).
- Dwyer, M. A., Hellinga, H. W. Periplasmic Binding Proteins: a Versatile Superfamily for Protein Engineering. Curr. Opin. Struct. Biol. 14, 495-504 (2004).
- Benson, D. E., Conrad, D. W. Design of Bioelectronic Interfaces by Exploiting Hinge-Bending Motions in Proteins. Science. 293, 1641-1644 (2001).
- Bozic, S., Chorzempa, J. Pirahna Cleaning. , University of Alberta. (2011).
- Mohammad, M. A. Raith 150TWO SOP. , University of Alberta. (2011).
- Schmidt, M. W., et al. General Atomic and Molecular Electronic Structure System. J. Comput. Chem. 14, 1347-1363 (1993).
- Bode, B. M., Gordon, M. S. MacMolPlt: a Graphical User Interface for GAMESS. J. of Mol. Graph. Mod. 16, 133-138 (1998).
- Bright, A., Devi, T. S. R., Gunasekaran, S. Spectroscopical Vibrational Band Assignment and Qualitative Analysis of Biomedical Compounds with Cardiovascular Activity. Int. J. Chem. Tech. Res. 2, 379-388 (2010).
- Bandekar, J. Amide Modes and Protein Conformation. Biochim. Biophys. Acta. 1120, 123-243 (1992).
- Barth, A., Zscherp, C. What Vibrations Tell About Proteins. Quarterly Reviews of Biophysics. 35, 369-340 (2002).
- Chrimes, A. F., Khoshmanesh, K. h, Stoddart, P. R. M. itchellA., Kalantar-Zadeh, K. Microfluidics and Raman Microscopy: Current Applications and Future Challenges. Chem. Soc. Rev. 42, 5880-5906 (2013).
- Park, S. -K., Lee, N. -S., Lee, S. -H. Vibrational Analysis of Dopamine Neutral Base based on Density Functional Force Field. Bull.-Korean Chem. Soc. 21, 959-968 (2000).
- Briand, E., Salmain, M., Compère, C., Pradier, C. M. Immobilization of Protein A on SAMs for the elaboration of immunosensors. Coll. Surf. B: Biointerfaces. 53, 215-224 (2006).
- Lakowicz, L. R., et al. Radiative decay engineering: 2. Effects of Silver Island Films on Fluorescence Intensity, Lifetimes, and Resonance Energy Transfer. Analytical biochemistry. 301, 261-277 (2002).
