Abstract
وتفيد التقارير تصنيع وتوصيف أنظمة نانو البيولوجي المكورات التواصل النانو المعدنية على دعامات متينة مع الجزيئات الحيوية يجمد. يتم وصف تسلسل كامل من الخطوات التجريبية ذات الصلة، التي تنطوي على تلفيق ركائز ذات البنية النانومترية باستخدام شعاع الالكترون الطباعة الحجرية، تجميد الجزيئات الحيوية على ركائز، وتوصيف لها استغلت سطح تعزيز رامان الطيفي (SERS). ويعمل ثلاثة تصاميم مختلفة من أنظمة نانو البيولوجي، بما في ذلك البروتين A، بروتين ملزمة الجلوكوز، وأبتمر DNA الدوبامين ملزمة. في الحالتين الأخيرتين، ربط بروابط منها، D-الجلوكوز والدوبامين، كما يتم تضمين. ويجمد ثلاثة أنواع من الجزيئات الحيوية على ركائز ذات البنية النانومترية بطرق مختلفة، ويتم الإبلاغ عن نتائج التصوير SERS. قدرات SERS للكشف عن وسائط الذبذبات من البروتينات يجمد السطح، وكذلك لالتقاط بروتين يجندوأظهر د أبتمر يجند ملزمة. النتائج أيضا توضيح تأثير هندسة البنية النانوية السطحية، والجزيئات الحيوية استراتيجية تجميد النشاط رامان من الجزيئات وجود أو عدم ويجند ملزمة للأطياف SERS المكتسبة.
Introduction
قدرات لتطوير وتميز أنظمة نانو البيولوجي المكورات التواصل النانو الصلبة والبوليمرات البيولوجية أصبحت ذات أهمية متزايدة لمزيد من التقدم في الجيل القادم والحيوية والاستشعار عن بعد والحيوي يشتغل التقنيات 1،2. وهذا ينطوي على دراسات متعددة التخصصات في عدد من المجالات البحثية، مثل تصنيع المكونات ذات الصلة الحالة الصلبة (الأقطاب الكهربائية الدقيقة أو النانوية، والطلاء الهندسة نانو، أسلاك، أو الجسيمات النانوية) 2،3،4. تجميد الجزيئات الحيوية على السطوح لخلق bioconjugates المرجوة 5،6،7. ومراقبة نانو البيولوجي واجهات 1. في معظم الحالات، واختيار من تلفيق الأمثل، والحيوية functionalization، وأساليب توصيف هي بقوة بين ذات الصلة. بوضوح، واختيار تقنيات nanofabrication سوف تكون مدفوعة من قبل متطلبات المكونات الصلبة للنظام، كونها تعتمد إلى حد كبير على طريقة الكشف، والتي تويتم تحديد آر من طبيعة البوليمرات الحيوية المعنية والغرض من مراقبة واجهة.
من مجموعة واسعة من التقنيات المستخدمة لتوصيف أنظمة bioconjugate 1،3، سطح تعزيز رامان الطيفي (SERS) برز كأسلوب واعد للغاية للكشف عن الأنواع الكيميائية والبيولوجية على الأسطح 8،9،10،11. SERS توظف نثر غير مرن للضوء أحادي اللون بواسطة الجزيئات الحيوية-يجمد السطح (الشكل 1) السماح للأسر التوقيعات فريدة الموافق الاهتزازات الجزيئية. هذه القدرة على التمييز بين جزيئات مختلفة دون إشراك التسميات، والكيمياء المعقدة، أو الخطوات تستغرق وقتا طويلا، يجعل SERS طريقة يحتمل أن تكون فعالة جدا في الكشف عن الحيوية. وثمة ميزة أخرى مهمة من SERS هي الحساسية العالية. الإثارة من البلازمونات السطحية المحلية التي كتبها ضوء التفاعل مع النانو المعادن النبيلة (ركائز SERS) يزيد بشكل كبير من كثافة العملياتensity من رامان نثر من قبل الحليلة، والسماح للكشف عن كميات صغيرة جدا من الجزيئات، من الطبقات الوحيدة وصولا الى حد جزيء واحد 8،9،10،11. وأخيرا، فإن معظم الجزيئات الحيوية تتطلب المحاليل المائية لتكون مستقرة. لأن الماء في كثير من الأحيان والنشاط رامان محدود، والتقليل إشارة الخلفية من عينات المائية 9. وقد عرضت تطبيقات SERS زيادة هائلة خلال العقد الماضي (10). ومع ذلك، فإن التحدي نوقش كثيرا من SERS هو أن تعزيز الكهرومغناطيسي من رامان نثر يعتمد بشكل كبير على الحجم والشكل، والمباعدة بين الولادات النانو المعدنية حيث يتم بفعل موجات plasmonic 11،12،13. من أجل تحقيق قياسات SERS فعالة وقابلة للتكرار، والسيطرة على مطلوب هندسة الركيزة في أبعاد النانو.
الشكل 1. بكالوريوسالهيم من سطح تعزيز رامان الطيفي.
طرق عديدة تستخدم لصنع ركائز SERS 11،12،13 ويمكن تصنيف تقريبا إلى أسفل إلى أعلى ومن أعلى إلى أسفل الأساليب. طرق النوع الأول توظف مختلف عمليات التجميع الذاتي أو التركيب الكيميائي موجهة لإنتاج النانو. تناولت في كثير من الأحيان وتشمل الأمثلة تجميد الجسيمات النانوية monodisperse على دعامات صلبة 11،12،13، الحرارية، تفل، أو ترسب الكهروكيميائية من الأفلام المعادن الخشنة 11،12، ومختلف أساليب التركيب الكيميائي 13. على الرغم من أن هذه التقنيات تميل إلى أن تكون بسيطة وغير مكلفة نسبيا، معظمهم تحدى بسبب عدم وجود السيطرة على موقع الهياكل، ومحدود استنساخ عينة إلى عينة.
في المقابل، وتقنيات الطباعة الحجرية من أعلى إلى أسفل توظف أدوات تلاعب مثل حزم الجسيمات لخلق أنماط المطلوب على السطوح. واحدة من الأكثر استخداماأساليب طباعة حجرية نانوية، شعاع الالكترون الطباعة الحجرية (EBL)، ويوفر سيطرة رائعة على المظاهر تراجعت لأقل من 10 نانومتر، وأيضا المرونة للسماح للتصاميم الركيزة مختلفة على دعامات صلبة 11،12. في EBL، شعاع من الإلكترونات ركز صولا الى بقعة من بضعة نانومتر في بمسح قطر عبر سطح من مادة حساسة الإلكترون (مقاومة) مما تسبب في تغير كيميائي في المناطق المكشوفة. لهجة إيجابية تقاوم مثل polymethylmethacrylate (PMMA)، والإلكترون النتائج التعرض شعاع في انفصال من سلاسل البوليمر يؤلف مقاومة، مما يؤدي إلى زيادة القابلية للذوبان في المذيبات المناسب (المطور). وتشمل عملية شعاع الإلكترون الطباعة الحجرية تدور طلاء طبقة موحدة للمقاومة على ركيزة. التعرض للمواد المستهدفة مقاومة في فراغ الغرفة مع شعاع الالكترون. والتنمية من العينة لإزالة المناطق القابلة للذوبان.
الدعم عازلة تحت النانو المعدنية، مثل السيليكا تنصهر، لها بالتابعين تبين أن زيادة كبيرة في شدة في SERS نظرا لتوطين موجات plasmonic مقارنة مع غيرها من المواد مثل السيليكون 14،15. ومع ذلك الزخرفة EBL على ركائز عازلة، ولا سيما على المقياس النانوي، ينطوي على تحديات كبيرة بسبب تهمة تراكم أثناء التعرض. سابقا، لقد أظهرنا 16،17 أن هذه الصعوبات يمكن التغلب عليها عن طريق وضع طبقات البوليمر الموصلة فوق مقاومة الشكل 2 يوضح التخطيطي لعملية تلفيق الشاملة باستخدام التعرض EBL والتنمية تليها ترسب المعادن والاقلاع لإنتاج النانو المعدنية على تنصهر الدعم السيليكا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. مخطط هlectron شعاع الطباعة الحجرية، ترسب المعادن، وعملية الاقلاع الخطوات المستخدمة لتصنيع النانو المعدنية على ركائز عازلة 16-19. في هذه الورقة، نقدم سلسلة كاملة من الخطوات العملية التي تنطوي على SERS ركائز تلفيق من قبل EBL، الحيوية functionalization من ركائز، و جمع أطياف رامان. وتناول ثلاثة تصاميم استكشافها في أعمالنا الأخيرة 18،19 (انظر أرقام 3 و 4، والجدول 1). في التصميم 1، وثبتوا المؤتلف البروتين وعلى اساس بين functionalized الحيوي النانو الاتحاد الافريقي على دعم 18 من السيليكا تنصهر (FS)، وأظهر الكشف SERS من البروتين. في التصميم 2، المؤتلف ويجمد البروتين 21،26،27 مع وبدون يجند (D-الجلوكوز) ملزم الجلوكوز عن طريق علامات الحامض الاميني في فراغات بين النانو حج على FS ني المغلفة، وملزمة من الجلوكوز للبروتين تم الكشف. في تصميم 3، thiolated DN-ملزمة الدوبامينويجمد وأبتمر 19،23 على النانو الاتحاد الافريقي على FS، والربط الدوبامين التي كتبها أبتمر يجمد ويتجلى. بما في ذلك جميع الخطوات التجريبية ذات الصلة من إعداد الركيزة لاكتساب أطياف رامان، وممثل من الجزيئات الحيوية واستراتيجيات تجميد مختلفة، وهذه الأمثلة هي مفيدة لمجموعة واسعة من التطبيقات، من أبحاث التنقيب استجواب واجهات نانو البيولوجي التي كتبها SERS في تطوير SERS أجهزة الاستشعار من الجزيئات الصغيرة التي توظف بروتين أو ملزمة كوسيلة من وسائل التعرف على أبتمر يجند. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. مخططات ثلاثة تصاميم تمثيلية باستخدام الجزيئات الحيوية المختلفة، وطرق immobilizaنشوئها، والركيزة المواد: (A) البروتين وثبتوا على المعدن النبيل نانو النقاط بين functionalized من قبل أحادي الطبقة الذاتي تجميعها (SAM) من حمض 11 mercaptodecanoic (MUA) في الماء DI. (B) الموسومة الحامض الاميني الجلوكوز البروتين (GBP) ملزمة المعقد مع D-الجلوكوز ثبتوا على سطح الركيزة بين النبيلة المعادن نانو النقاط. (C) ثيول-إنهاء الدوبامين ملزمة أبتمر مع الانتهاء من الدوبامين (DBA) ثبتوا على المعادن النبيلة نانو النقاط. انظر مزيد من التفاصيل في الجدول 1. وفي تصميم 2 يتضح من لوحة (B)، تم إعداد عينة من دون يجند المقابلة أيضا للمقارنة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (4).الجزيئات الحيوية المستخدمة في ثلاثة تصاميم: (A) البروتين A؛ (B) الجلوكوز بروتين ملزمة وD-الجلوكوز. (C) الدوبامين أبتمر DNA والدوبامين ملزمة. الهياكل العالي البروتين في (أ) و (ب) وتتخذ من البروتين بنك المعلومات، PDB ID 1BDD 20 و 2HPH 21، على التوالي، وتعادل مع VMD لLINUXAMD64، الإصدار 1.9.1 22. ومن المتوقع هيكل الثانوي أبتمر في (ج) من تسلسل 23 باستخدام ValFold 24 البرمجيات وتعادل مع PseudoViewer 3.0 25. الرسائل G، A، T، C وتتوافق مع جوانين، الأدينين، الثيمين، والنيوكليوتيدات السيتوزين، على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
| تصميم 1 تصميم 2 | تصميم 3 | ||
| البوليمر الحيوي | البروتين A | الجلوكوز بروتين ملزمة (GBP) | أبتمر ملزم الدوبامين (DBA) |
| غلاف | حمض 11 Mercaptoundecanoic (MUA) أحادي الطبقة الذاتي تجميعها (SAM) | علامات الحامض الاميني | linkers ثيول |
| يجند | لا شيء | D-الجلوكوز | الدوبامين |
| حل | منزوع الأيونات (DI) المياه | عازلة فوسفات البوتاسيوم | تريس (hydroxymethyl) aminomethane (تريس) وحمض ethylenediaminetetraacetic (EDTA) العازلة؛ الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) |
| الركيزة | هياكل الاتحاد الافريقي على FS | هياكل حج على ني المغلفة FS | هياكل الاتحاد الافريقي على FS |
| ع منقوشةعصام | 4 ميكرون × 10 ميكرون | 4 × 8 ميكرون ميكرون | 4 ميكرون × 10 ميكرون |
| نمط | النقاط الاتحاد الافريقي، 50 نانومتر الملعب | النقاط حج و 40 نانومتر الملعب | السداسي الاتحاد الافريقي، 200 نانومتر الملعب |
| السداسي حج و 200 نانومتر الملعب | الاتحاد الافريقي منصات غير منظم | ||
| حج منصات غير منظم | |||
| جرعات التعرض EBL | النقاط: | النقاط: 105 μC / سم 2 | السداسي: 180 μC / سم 2 |
| مجموعة I 120 μC / سم 2 | السداسي: 170 μC / سم 2 | ||
| مجموعة II 96 μC / سم 2 | |||
| مجموعة III 72μC / سم 2 | |||
| الليزر الطول الموجي الإثارة | 532 نانومتر | 532 نانومتر | 780 نانومتر |
الجدول 1. ثلاثة تصاميم أنظمة نانو البيولوجي.
Protocol
1. الركيزة التحضير
- استخدام منشار تقطيع أشباه الموصلات لقطع السيليكا تنصهر (FS) ويفر إلى 1 سم × 1 سم أو النرد أصغر.
- عينات النظيفة في حل سمكة البيرانا (H 2 SO 4: H 2 O 2، 3: 1؛ تنبيه: مؤكسد قوي) حمام 28 لمدة 15 دقيقة، ثم يشطف النرد في الماء منزوع الأيونات وجاف في النيتروجين.
- وضع العينات على موقد مواجهة على حرارة 180 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. تبريد عينات بعد إزالة من موقد لRT.
- للرسوم والنماذج 1 و 3، انتقل إلى الخطوة 2.
- لتصميم 2، ضع عينة في التبخر غرفة شعاع الالكترون ومعطف مع طبقة 10 نانومتر من النيكل.
2. تلفيق أقنعة PMMA نانو نمط باستخدام شعاع الالكترون الطباعة الحجرية (EBL)
- تدور معطف PMMA مقاومة وطبقات الموصلة على ركائز.
- استخدام الدوار رقاقة مع تشاك فراغ والعينات مكان فردي في المركز على تشاك. مكان1 قطرة من polymethylmethacrylate (PMMA) يقاوم على مركز من العينات باستخدام ماصة الزجاج وتدور في 3،500 دورة في الدقيقة لمدة 60 ثانية مع الوقت منحدر 2 ثانية.
- خبز ركائز عند 180 درجة مئوية لمدة 3-5 دقيقة. بعد الخبز ركائز، تبريد عينات لRT.
- مع تبريد ركائز وعاد إلى تشاك الدوار، وانتشار قطرة من البوليمر موصل على الركيزة. تدور الركيزة لمدة 40 ثانية في 3،000 دورة في الدقيقة مع الوقت منحدر 2 ثانية. عينات الخبز في 80 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
- أداء التعرض EBL وفقا للإجراء 16،17،18،29 المعيار.
- باستخدام تعليمات الشركة الصانعة، وإعداد وتصميم التعرض توظيف جرعات الميزة من الجدول رقم 1 مع أصغر حجم ممكن خطوة شعاع.
- تحميل العينة في غرفة الطباعة الحجرية شعاع الالكترون. إذا لم يكن لدى النظام EBL autofocusing، استخدم خدش صغير بعيدا عن حيث هذا النمط غير أن تتعرض وبعيدا عن حافة حبة لالتركيزجي.
- باستخدام تعليمات الشركة الصانعة، نفذ المطلوب التركيز وتصحيح الاستجماتيزم وكذلك الكتابة محاذاة الحقل حسب الاقتضاء، وفضح العينة. للسماح لملف التعريف التعرض السليم وأفضل نوعية نمط، واستخدام 30 كيلو الطاقة شعاع الالكترون و 7.5 ميكرومتر الفتحة التعرض لل.
- إزالة البوليمر موصل وتطوير نماذج عرضة للخطر.
- إعداد كوب مع منزوع الأيونات (DI) الماء لإزالة البوليمر موصل ودورق الثاني مع خليط المطور (IPA: H 2 O، 7: 3)، ويقلب لمدة 5 دقائق على RT. إعداد الأيزوبروبانول (عالية النقاء) في كوب الثالث كعامل شطف.
- باستخدام الملقط، وضع العينات في الماء لمدة 3 ثانية لإزالة فيلم البوليمر موصل، ثم ضع العينة إلى المطور ونقل ملاقط ببطء صعودا وهبوطا لمدة 20 ثانية. نقل على الفور ركائز إلى الأيزوبروبانول وشطف لمدة 10 المزيد من الثواني، ثم تجف العينة مع النيتروجين. </ OL>
3. نوبل المعادن النانوية تلفيق
- تحميل عينات رأسا على عقب في الإلكترون نظام شعاع المبخر للسماح للمعدن تبخرت لتودع على الوجه الأمامي للعينات. إيداع طبقة سميكة الاتحاد الافريقي 10 نانومتر على عينات للرسوم والنماذج 1 و 3، ونانومتر طبقة سميكة 10 حج للتصميم 2 بمعدل حوالي 0.1 نانومتر / ثانية.
- شغل نظام صوتنة إلى الارتفاع الموصى به مع الماء وملء كوب منفصل مع الأسيتون. وضع الوجه عينة تصل في قاع الكأس والسماح للعينة لينقع لمدة 10 دقيقة. عقد الكأس، وضعه في حمام مائي والسماح للارتفاع من الأسيتون، لتتناسب مع ارتفاع المياه وتشغيل نظام صوتنة. السماح صوتنة لتحدث لمدة تصل إلى 60 ثانية.
- باستخدام نفس الإجراء كما هو مفصل في الخطوة 3.1، وإعداد موحدة والاتحاد الافريقي حج سادة ركائز عن ترسب 10 نانومتر الأفلام معدنية سميكة على FS (تصاميم 1 و 3) وFS ني المغلفة (تصميم 2) SUBSTRآتش تخطي الخطوة 2.
4. بيو functionalization من ركائز
- إعداد تصميم 1 العينات:
- يعد حل 1 ملم من 11 mercaptodecanoic حمض (MUA) في الإيثانول في RT. يصوتن لمدة 10 دقيقة.
- تزج الركيزة ذات البنية النانومترية المناسبة في حل MUA لمدة 48 ساعة. شطف العينة مع الإيثانول ثلاث مرات وجافة لمدة 5 دقائق على RT.
- يعد حل 75 ملم من N -ethyl- N '- (3- (dimethylamino) بروبيل) carbodiimide (EDC) في الماء DI. يعد حل 15 ملم من N -hydroxysuccinimide (NHS) في الماء DI.
- باستخدام وديعة ممص مكروى 100 ميكرولتر من NHS على الاتحاد الافريقي على الركيزة، وإضافة على الفور 100 ميكرولتر من EDC على نفس المنطقة. احتضان لمدة 1 دقيقة لتفعيل أحادي الطبقة الذاتي تجميعها (SAM) من MUA.
- وضع قطرة 100 ميكرولتر من البروتين حل (47 ميكرومتر) على نفس المنطقة من الركيزة وتخزين العينة لمدة 24 ساعة عند 5 درجات مئوية في بيتري د متعددة المقصورةإيش مع 1 مل من الماء DI في حجرة أخرى، مع وجود غطاء مغلق.
- شطف العينة في الماء DI 3 مرات من قبل التحريك المستمر العينات في أكواب منفصلة لمدة 20 ثانية في كل كوب. لا تدع عينات تجف بعد الشطف أو أثناء الشطف.
- انتقل إلى الخطوة 5.
- إعداد تصميم 2 عينات:
- يعد حل 0.9 ملي الجلوكوز بروتين ملزمة (GBP) في المخزن فوسفات البوتاسيوم (K 2 هبو 4، 25 مم، ودرجة الحموضة 7.5). يعد حل 100 ملم من D-الجلوكوز في المخزن المؤقت.
- مزيج 30 ميكرولتر من 100 ملي حل D-الجلوكوز و 30 ميكرولتر من 0.9 ملي GBP الحل باستخدام 1 مل البلاستيك microtube الحاويات وممص مكروى. احتضان لمدة 30 دقيقة.
- إيداع 20 ميكرولتر من الحل GBP خالية من يجند وللGBP حل ملزمة يجند كل على ركائز مستعدة باستخدام micropipette. تخزين العينات في 5 درجة مئوية لمدة 24 ساعة في طبق بيتري مع غطاء مغلق.
- شطف العينات 3 مرات فيالبوتاسيوم حل العازلة الفوسفات في RT.
- انتقل إلى الخطوة 5.
- إعداد تصميم 3 عينات:
- تمييع الدوبامين أبتمر ملزمة (DBA) حل لتركيز 1 ميكرومتر باستخدام المخزن المؤقت TRIS EDTA مع الرقم الهيدروجيني النهائية من 7.4.
- يعد حل الدوبامين إلى تركيز 5 ميكرومتر عن طريق قياس مسحوق الدوبامين على توازن التحليلي وخلطها في الفوسفات ومخزنة المالحة (PBS) مع حبة ضجة لمدة 5 دقائق.
- إيداع بنسبة 20 ميكرولتر من الحل DBA على سطح كل ركيزة والسماح للعينات الجلوس لمدة 1 ساعة على RT مع غطاء على طبق بيتري.
- شطف العينات 3 مرات في منطقة عازلة فوسفات البوتاسيوم (K 2 هبو 4، 25 مم، ودرجة الحموضة 7.5).
- وضع العينات في وضع مستقيم على رأس الصف غرف الأبحاث مسح لتجف المؤخر مع الحفاظ على الفيلم على الجانب الأمامي من الركيزة. وضع العينة جانبا كمجموعة تحكم.
- وضع قطرة 5 ميكرولتر من محلول الدوبامين سن سطح قطرة الحالية من حل العازلة PBS على العينات المتبقية مع تركيز الدوبامين المطلوب. احتضان العينة لمدة 10 دقيقة.
- وضع قطرة من حل الدوبامين على لوحة سطح الاتحاد الافريقي دون أبتمر. احتضان لمدة 10 دقيقة.
- شطف العينات في حل العازلة فوسفات البوتاسيوم 3 مرات.
5. رامان الطيفي
- وضع كل عينة في غرفة واقية من الماء لتجنب التبخر عن التعرض ليزر.
- ملء حقنة بلاستيكية مع خامل كيميائيا الشحوم عالية الفراغ، وعينات مكان على الشرائح الزجاجية والاستغناء بضعة ملليمترات من الشحوم المحيطة العينات دون لمس العينات.
- وضع ساترة المجهر على أعلى من ركائز وبلطف اضغط لأسفل على شكل خاتم، وخلق واجهة السائل رقيقة بين ركائز ولل coverslips دون السماح المخزن المؤقت لتأتي في اتصال مع الشحوم فراغ.
- باستخدامبصري نظام المجهر رامان، الحصول على التركيز على سطح المنطقة نقوش نانو معدنية لأخذ عينات دون تحول على الليزر.
- أداء رامان أخذ العينات 18،19 مع كثافة الليزر بين 2،4-3،1 ميغاواط مع المدة الإجمالية أقل من 20 ثانية لمنع الأضرار التي لحقت عينة مع هدف 10X التكبير. الحصول على أطياف رامان لعينات من تصاميم 1، 2، و 3 باستخدام موجات الإثارة كما هو مبين في الجدول 1. اكتساب أيضا السيطرة أطياف رامان عن حلول للبروتين A، GBP، وD-الجلوكوز، ومسحوق الدوبامين توظيف الشرائح الزجاجية دون المعادن النانو كما تدعم للمقارنة.
Representative Results
جمع السيطرة أطياف رامان للمكونات الرئيسية، بما في ذلك البروتينات الحرة في حل وبروابط الحرة في الحل أو في شكل مسحوق دون استخدام ركائز المحتوية على معادن، أمر مهم لتمكين المقارنة السليمة وكذلك لأغراض التفسير. الشكل 5A يقدم رامان نموذجي الطيف مجانا البروتين (أ) في المياه DI على شريحة زجاجية دون ركائز ذات البنية النانومترية. شريطين وفقا لأعلى كثافة رامان، والفرقة في 2،931 سم -1 و في 1،091 سم -1، تتوافق مع الاهتزازات التي تنطوي على السندات CH وCS، على التوالي. العصابات الأخرى مع انخفاض كثافة رامان مثل 563 سم -1، 1،450 سم -1، 1،653 سم -1 و 2،426 سم -1، ويمكن أن يعزى إلى تراكب من وسائط الاهتزاز 18،32،33،34. السيطرة أطياف رامان للGPB مجانا يجند في حل العازلة مع ثلاثة تركيزات مختلفة، 0.3، 0.9 و 1.3 ملم، وتظهر في الشكل 5B. في تي انه الرقم واسع النطاق حول 3،400 سم -1 يتوافق مع المذيبات 35، في حين أن الفرقة في 2،935 سم -1 يمثل الاهتزازات التي تنطوي على السندات CH من البروتين 32،33. ويبين الشكل 5C الطول الموجي عالية رامان الطيف لD-الجلوكوز في حل العازلة لتركيزات مختلفة: 1، 6، 100، 200، و 400 ملم. عندما تركيز الجلوكوز وزيادة، تنشأ العصابات السندات CH الاهتزاز في 2،890 سم -1 و 2،960 سم -1. وتظهر سيطرة أطياف رامان الدوبامين في شكل الكريستال التي تم الحصول عليها مع كل من 532 نانومتر و 780 نانومتر موجات الإثارة في الشكل 5D. بكثير من الطيف رامان يأتي من حلقة البنزين الانحناء وتمتد CH السندات للجزيء 19،36. لوحظ بعض العصابات في حوالي 3،000 سم -1 فقط في نانومتر 532 ولكن ليس 780 نانومتر الإثارة الطول الموجي.
pload / 52712 / 52712fig5.jpg "/>
الشكل 5. مراقبة الطيف رامان من البروتين في الماء DI الحصول على 532 نانومتر الإثارة الطول الموجي 18 (A)؛ أطياف رامان من الجلوكوز بروتين ملزمة خالية من يجند في حل العازلة الحصول على 532 نانومتر الإثارة الطول الموجي (باء)؛ أطياف رامان من D-الجلوكوز في حل العازلة الحصول على 532 نانومتر الإثارة الطول الموجي (C)؛ والأطياف من مسحوق الدوبامين الحصول على 532 نانومتر و 780 نانومتر موجات الإثارة 19 (D). جميع أطياف أطياف رامان والمنتظم للحلول (أ، ب، ج) ومسحوق (د) على الشرائح الزجاجية دون ركائز ذات البنية النانومترية. في (D)، وقد تم إسناد الأنظمة التحول رامان لمختلف الاهتزازات الجزيئية باستخدام عامة الذرية والجزيئية النظام الإلكتروني لهيكل (GAMESS) 30 و 31 MacMolPlt البرنامج كما هو مفصل في أماكن أخرى 19. لوحة أعيد طبعه (أ) بإذن من 18 أميريكمجتمع فراغ. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
من أجل الحصول على SERS أطياف الجزيئات الحيوية ل-يجمد السطح، هي ملفقة ركائز تضم النانو المعدنية على الدعم السيليكا تنصهر فيها كما هو موضح في الخطوات 1-3. ويتم رصد نوعية ركائز ملفقة باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح (SEM). ووصف الإجراءات SEM القياسية في أي مكان آخر 16،17،18 و 19 و غير المدرجة في هذا البروتوكول. الشكل 6 معارض الصور SEM تمثيلية من الاتحاد الافريقي وحج نانو نانو النقاط ومسدس مثل الهياكل (لوحات إعلانية)، وكذلك غير -structured الاتحاد الافريقي وحج منصات (لوحات هاء وواو، على التوالي). وتشمل الخطوات المقبلة تجميد المواد البيولوجية على ركائز منظم نانو توظيف ثلاثة تصاميم المدرجة في الجدول 1، والحصول على أطياف SERS بهم. في س rder للحفاظ على بيئة مائية خلال رامان التصوير، ويتم وضع كل عينة في حل المناظر له (انظر الجدول 1)، وتوج مع غطاء زجاجي رقيق، ومختومة كما هو موضح في الشكل (7).
الشكل 6. الضوئي الإلكترون المجهر (SEM) الصور من 10 نانومتر سميكة الاتحاد الافريقي وحج النانو سطح يعملون بمثابة ركائز SERS: (A، B) صفائف nanodots. (C، D) صفائف نانو السداسي. (E، F) منصات غير منظم. ركائز مع هياكل الاتحاد الافريقي (يسار) توظف الدعم FS، في حين ركائز مع الهياكل حج (يمين) تستخدم 10 نانومتر ني طبقة سميكة على FS. تم الحصول على الصور كما هو موضح في أي مكان آخر 16،17،18.خريج "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 7. مخطط غرفة واقية من الماء لرامان التصوير العينات بين functionalized الحيوي في الحل.
في التصميم 1، وثبتوا المؤتلف البروتين (أ) على ركائز بين functionalized من قبل أحادي الطبقة الذاتي تجميعها من 11 mercaptodecanoic حمض (MUA) في المياه DI 18. وتتألف ركائز في هذا التصميم ثلاثة صفائف من النقاط الاتحاد الافريقي مع نانومتر الملعب 50 ومتفاوتة المسافات بين نقطة على السيليكا تنصهر فيها (انظر الأرقام 6A و 8). عملية البروتين تجميد تبدأ مع تشكيل SAM على ركائز. للحصول على التساهمية ملزم بين SAM والبروتين، يتم تحويل مجموعات حمض الكربوكسيلية من صواريخ سام إلى أمين رد الفعل NHS استر عن طريق العلاج مع خليط من N N '- (3- (dimethylamino) بروبيل) carbodiimide (EDC) حل وN -hydroxysuccinimide (NHS) حل في الماء DI. تجميد من البروتين يحدث من النزوح من مجموعة NHS التي كتبها بقايا يسين البروتين 37. ويرد مثال على عينات التصوير للتصميم 1 مع البروتين وثبتوا على النانو الاتحاد الافريقي في الشكل 9. الشكل 9A يقدم صورة المجهر الضوئي من العينات، التي تضم ثلاثة صفوف من-بين functionalized الحيوي nanodots الاتحاد الافريقي مع مختلف الفجوات بين نقطة (انظر أرقام أيضا 3AA و 8)، ويبين الشكل 9B تعيين الطيفية رامان على هذه المصفوفات. ويمكن ملاحظة أن أعلى كثافة رامان تم العثور على لصفيف I حيث الفجوات بين نقطة هي أضيق، في حين يتم الحصول على كثافة أقل للصفيف III مع أوسع الفجوات بين نقطة. ويمكن تفسير ذلك من قبل مأكل تأثير أقوى اقتران التي تنتجها العالي التعبير عن عدم الرضا الكهربائيةLDS في المساحات الضيقة بين النقاط (18). ويبين الشكل 9C أقوى أطياف SERS الحصول عليها لصفائف الأول والثاني. أطياف تظهر عدة فرق (1،630 سم -1، 1،964 سم -1، 2،280 سم -1، 2،577 سم -1، و2،916 سم -1) في القرب من وسائط رامان حرية البروتين (أ) في حل رأينا في الشكل 5A. تعزى إلى الاهتزازات من السندات المختلفة الموجودة في البروتينات، هذه المجموعات إما تظهر في مواقع مماثلة في كل من البروتين وثبتوا في الحل، أو تحول قليلا إلى wavenumbers أعلى إلى حد ما عندما يجمد. في المقابل، SERS أطياف من ركائز ذات البنية النانومترية مماثلة بين functionalized من قبل MUA SAM دون البروتين تظهر نمطا مختلفا تماما 18، مؤكدا أن الشكل 9 يمثل رسم الخرائط SERS من-يجمد سطح البروتين A. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8. الصور SEM من ثلاثة صفوف من nanodots الاتحاد الافريقي على FS الركيزة المستخدمة في التصميم 1 18. صفائف لديهم نفس الملعب 50 نانومتر، وقليلا مختلفة أنصاف أقطار نقطة مما أدى إلى العروض المختلفة من الفجوات بين نقطة. ويتحقق ذلك من خلال تطبيق مختلف جرعات التعرض EBL لإنتاج الأقنعة PMMA لصفائف ثلاثة (انظر الجدول 1). جرعات التعرض أعلى نتيجة في ثقوب أوسع في أقنعة PMMA، والسماح لأكبر الأحجام الاتحاد الافريقي نقطة بعد معدنة والاقلاع. أعيد طبعها بإذن من 18 جمعية فراغ الأميركية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
ليه / ftp_upload / 52712 / 52712fig9.jpg "/>
الرقم 9. SERS تصوير-يجمد الركيزة البروتين (أ) في التصميم 1 18. (A) صورة المجهر الضوئي من العينة، تضم ثلاثة صفوف من nanodots الاتحاد الافريقي مع الملعب 50 نانومتر، ومختلف الفجوات بين نقطة على ركيزة السيليكا تنصهر (انظر أيضا الشكل 6)، كما هو مبين في الشكل 3A-بين functionalized الحيوي. (B) رسم الخرائط رامان من العينة. (C) SERS أطياف من صفيف دوت الأول والثاني. في لوحة (B)، ويمثل المحور الرأسي المسافة بين الركيزة، ويمثل المحور الأفقي التحول رامان، ويشير شريط أسطورة شدة رامان. متقطع عمودي خطوط في لوحات (B) و (C) تمثل عصابات رامان القياسي الخالي من البروتين (أ) في حل و(*) في لوحة (C) إلى العصابات SERS من صفيف أولا أطياف رامان تم الحصول على 532 نانومتر الإثارةالطول الموجي. أعيد طبعها بإذن من 18 جمعية فراغ الأميركية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
في التصميم 2، ويجمد البروتين الجلوكوز المؤتلف ملزمة (GBP) 21 المعقد مع D-الجلوكوز (يجند) على ركائز المناسبة في حل العازلة فوسفات البوتاسيوم. يتم إعداد العينات مع يجمد خالية من يجند GBP أيضا للمقارنة. في هذا التصميم، ويرد بروتين ملزمة الجلوكوز إلى السطح عن طريق علامة الحامض الاميني الذي يربط بشكل جيد لني ولكن ليس إلى المعادن النبيلة 6. منذ تشكل ركائز صفائف حج نانو النقاط، نانو السداسي، ومنصات حج غير منظم على FS ني المغلفة (أرقام 6B، 6D، و6F، على التوالي)، يمكن للمرء أن يتوقع معظم جزيئات البروتين يجمد أن يكون موجودا في الفجوات بين حج النانو حيث ني طلاء للمركباتailable. من أطياف رامان التي تم الحصول عليها عن يجمد خالية من الجلوكوز ويتم إظهار GBP محددة الجلوكوز في أرقام 10A 10B و، على التوالي. كل هذه الأطياف المعرض واسع النطاق في حوالي 3،300 سم -1، والتي تتطابق مع حل العازلة 35. أطياف تم الحصول عليها مع وسادة حج غير منظم تحتوي فقط على هذه الفرقة واحدة ولا تظهر أي وسائط البروتين الاهتزاز، مؤكدا أن البروتين يجمد لم يتم العثور على سطح حج كما هو متوقع. في المقابل، فإن أطياف الحصول مع المصفوفات من حج نانو النقاط وشرائح معرض النانو السداسي حول 1،550 سم -1 و 2،900 سم -1، والتي تمثل الحليلة 32،33. على وجه الخصوص، والفرقة واسعة في جميع أنحاء 1،550 سم -1، والمعروفة باسم الفرقة أميد II، يعزى إلى الببتيد الاهتزازات السندات في البروتينات 33،34. في القضية المنظورة، هذه الفرقة تمثل تراكب وسائط الاهتزاز من GBP ثبتوا على سطح ني بين ميزة حجالصورة، ويدل على تعزيز SERS من هذه الأوضاع في محيط النانو المعادن النبيلة عند استخدام ركائز تحتوي نانو نانو النقاط أو السداسي. هذه الفرقة هي ضعيفة جدا للبروتين في حل في غياب تعزيز SERS (الشكل 5B) وغاب عن منصات حج دون سطح ني المتاحة للبروتين ملزمة، لكنه هو واضح تماما لركائز ذات البنية النانومترية مع بعض سطح ني الوصول للبروتين الربط. ومع ذلك، وحتى أكثر أهمية لهذه الدراسة هي الأخرى، والعصابات أضيق حول ما يقرب من 2،900 سم -1 التي يمكن أن تعزى إلى CH السندات wibrations 32،33. الطيف الخالي من الجلوكوز GBP يظهر الفرقة وضوحا في 2،933 سم -1 مع الركيزة نانو النقاط، وضعف ولكن يمكن تمييز الفرقة في طول موجة مماثلة مع الركيزة نانو السداسي (الشكل 10A). تختلف عن حالة من البروتين مجانا الجلوكوز، أطياف SERS من GBP محددة الجلوكوز هو مبين في فيقو إعادة 10B معرض شريطين المقابلة لصفلا الأنظمة السندات الاهتزازات، في 2،850 سم -1 و 2،910 سم -1. وضوحا العصابات جيدا في طيف GBP محددة الجلوكوز على النانو السداسي الركيزة، وأنها أيضا يمكن أن ينظر إليه في طيف GBP على النانو النقاط الركيزة. الفرقة في 2،850 سم -1 بالقرب معقول إلى 2،890 سم -1 واحد في الطيف السيطرة رامان من D-الجلوكوز في الحل، وبالتالي فإنه يمكن أن يعزى إلى الجلوكوز، منضما إلى البروتين، في حين أن الفرقة الأخرى (في 2،910 سم -1) الذي يعزى إلى الاهتزازات السندات CH من كل من البروتين والجلوكوز. يمكن للمرء أن يستنتج أن الفرق التوقيعات SERS من متجهة الى الجلوكوز خالية من الجلوكوز ويجمد الركيزة GBP هو ملاحظتها في هذه المنطقة، والاهتزازات السندات CH من بروتين محدد الجلوكوز وكشفها توظيف تصميم وصفها.
10.JPG "/>
الشكل 10. SERS أطياف (A) خالية من يجند و (ب) بروتين ملزمة الجلوكوز محددة يجند ثبتوا على ثلاثة ركائز مختلفة في التصميم 2. وقد تم الحصول على أطياف مع 780 نانومتر الإثارة الطول الموجي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
في تصميم 3، وثبتوا على أبتمر الدوبامين مخصصة ملزمة (DBA) مع إنهاء ثيول 23 على الركيزة في تريس (hydroxymethyl) aminomethane (تريس) حمض ethylenediaminetetraacetic (EDTA) حل العازلة، والدوبامين ثم منضما إلى أبتمر يجمد 19. ركائز لهذا التصميم تحتوي على صفائف من الاتحاد الافريقي نانو السداسي على FS (الشكل 6C). كما تستخدم منصات الاتحاد الافريقي غير منظم (الشكل 6E) لأغراض المراقبة. منذ الحمض النووي هو فلوري في جوهرها 38، 780 نانومتر الإثارة waveleng يستخدم عشر في تصميم 3 للحد من هذه العوامل. في هذا التصميم، وعنصر الاعتراف (أبتمر) لا رامان نشاطا في المنطقة من تحولات رامان يعتبر في الشكل 11، بينما يظهر الدوبامين نشاط رامان كبير في هذه المنطقة. منذ إشارة من عينات تتعرض لالدوبامين فقط دون أبتمر يجمد معارض شرائح لا الدوبامين الناتجة 19، ومن المتوقع أن SERS العصابات لوحظ أن تنشأ من محددة أبتمر الدوبامين الشكل 11 يقارن أطياف SERS من أبتمر ثبتوا على النانو الذهب قبل وبعد إضافة الدوبامين. كما هو متوقع، يجمد خالية من الدوبامين أبتمر لا يحمل عصابات رامان. في المقابل، لوحظ عدد من عصابات رامان وضوحا لمحددة الدوبامين أبتمر يجمد. مواقف معظم العصابات في الشكل 11 هي قريبة من تلك الموجودة في الدوبامين البلورية، ولكن مع اختلاف في سعة.
igure 11 "SRC =" / الملفات / ftp_upload / 52712 / 52712fig11.jpg "/>
الرقم 11. SERS أطياف خالية من يجند (الخط البنفسجي) ومحددة يجند (الخط الأزرق) أبتمر ثبتوا على الاتحاد الافريقي ركائز نانو مسدس في تصميم ملزم الدوبامين 3 19. الخط الأحمر يظهر الطيف السيطرة SERS من مسحوق الدوبامين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
تكتسب SERS اعتراف باعتبارها تقنية قوية للغاية في الكشف عن الحيوية التي تقدم العديد من المزايا الفريدة. العلاقة مع الاهتزازات الجزيئية تسمح بتحديد انتقائي "بصمات الأصابع" في التحاليل محددة من SERS الأطياف، في حين أن حساسية عالية للغاية يجعل من الممكن الكشف عن كميات صغيرة جدا من الحليلة 9،10،11،35. وعلاوة على ذلك، SERS هو أسلوب غير تدميري وهذا هو أيضا غير حساس نسبيا على المياه، وبالتالي هي مناسبة بشكل جيد للغاية لأنها تحقق المواد البيولوجية في بيئتها الطبيعية المائية 9. النتائج المقدمة تؤكد هذه المزايا فضلا عن مزيد من تثبت إمكانات قوية من SERS باعتباره مرنة جدا تقنية خالية من التسمية من الكشف الحيوي. في ثلاثة تصاميم توظيف الطبقات الوحيدة من مختلف الجزيئات الحيوية-يجمد الركيزة، تم الكشف عن وسائط رامان يمكن أن تعزى بثقة إلى التحاليل معينة. أن الكشف عن هذه الجزيئات الحيوية، سص بروابط كل منها، وقد أثبتت توظيف الأسطح المستوية من السيليكا تنصهر مثل دعم ركائز SERS، ويجعل من التصاميم متوافقة مع الالكترونيات الحالية والإعدادات على microfluidics، واعدا العديد من التطبيقات في العلاقة مع البنى الحيوية الإلكترونية تفاعل المواد البيولوجية مع أسطح الإلكترونية الناشئة وأجهزة كهربائية 2،3. الأهم من ذلك، في اثنين من ثلاثة تصاميم وقد تجلى الكشف عن SERS ملزمة محددة من جزيئات صغيرة مثل الجلوكوز والدوبامين، وتوظيف الطبقات الوحيدة من البروتين يجمد السطح وأبتمر، على التوالي، حيث أن عناصر الاعتراف.
ومع ذلك، ينبغي أن تؤخذ عدة جوانب رعاية من أجل تحقيق كفاءة SERS الحيوي الكشف في الإعداد "على رقاقة". أولا وقبل كل شيء، تحديا المعروفة التي هو شائع لمعظم الجزيئات الحيوية هو ميلها أن تتحلل، خاصة عندما تتعرض لظروف غير طبيعية مثل ENVI الجافةاجلنوبية أو ضوء الليزر مكثفة. في جميع أنحاء بروتوكول، أكدنا على أهمية دائما الحفاظ على العينات البيولوجية بين functionalized منغمسين في الحلول المناسبة أثناء التجربة بأكملها، من إعداد العينات إلى اقتناء أطياف رامان. لهذا الأخير، وقد تم تصميم غرفة واقية من المياه المخصصة (الشكل 7) لتجنب التبخر من السائل خلال التعرض ليزر. مدة التعرض وكثافة الليزر وينبغي أيضا أن يقتصر كما هو موضح في الخطوة 5.3 من البروتوكول لتجنب الضرر من العينات.
تم العثور على نتائج الكشف SERS حساسية للهندسة الركيزة العاملين، وخاصة الفصل بين سمة من سمات النانو المعدنية. كما يستنتج من أرقام 8 و 9، وشدة SERS من تصميم 1 عينات تعتمد بقوة على عرض الفجوات بين الاتحاد الافريقي نانو النقاط على السيليكا تنصهر فيها. من أصل ثلاثة صفائف nanodots الاتحاد الافريقي اختبار طن هذا التصميم (الشكل 8)، ويتحقق أعلى كثافة رامان مع صفيف الأول، الذي لديه أضيق الفجوات بين ملامح الاتحاد الافريقي وبالتالي فإنه يوفر أكثر كفاءة تعزيز المجال الكهرومغناطيسي. كما يوضح الشكل 9، مطلوب السيطرة على فصل بين ميزة على مستوى 10-20 نانومتر أو أقل. توظيف EBL لافتعال ركائز SERS، كما هو موضح هنا، يوفر قرار كفاءة خصيصا للسيطرة على الاعراض من الفجوات بين الميزة. مع EBL إيجابية لهجة مقاومة مثل PMMA، وحجم الثقوب في أقنعة PMMA يمكن أن تختلف ببساطة عن طريق تغيير جرعات التعرض. بعد الإقلاع هذه النتائج في أحجام مختلفة من النقاط المعدنية المصنعة، ويمكن ضبطها عرض الفجوات بين النقاط على النحو المرغوب فيه عن طريق تحديد التعرض EBL السليم جرعات 18.
التحدي الآخر هو الأمثل للهندسة SERS الركيزة لتطبيق محدد للكشف الحيوي. على الرغم من أن تأثير ط تعزيزncreases مع انخفاض الفجوات بين ميزة، وحجم كبير نسبيا من الجزيئات البيولوجية يفرض قيودا على مدى ضيق قد تكون الثغرات. وهذا واضح من نتائج لتصميم 2، حيث طريقة تجميد هو من النوع الذي يربط البروتين بكفاءة إلا إلى السطح بين النقاط المعادن النبيلة، ولكن ليس على النقاط نفسها (انظر الشكل 3B). كما يستنتج من الشكل 10، أطياف SERS لمنصات حج غير منظم لا تظهر أي فرق من الحليلة. على الرغم من أن منصات المعرض بنية النانو بلورية مع وجود ثغرات بين الجزر رقيقة جدا (انظر الشكل 6F) هذه الفجوات ضيقة جدا لاستيعاب جزيء البروتين. بعدا آخر من التعقيد يضاف عندما يكون البروتين يجند ملزم ليتم الكشف. في الشكل 10، والعصابات SERS CH هي أكثر وضوحا في أطياف محددة من يجند GBP مما كانت عليه في واحدة خالية من يجند، الذي قد يفسر نظريا عن تغيير في التشكل GBPعلى ربط D-الجلوكوز 2 7،27، مما أدى إلى هيكل أكثر جامدة مع زيادة النشاط رامان. إذا كان أحد يقارن بين ركائز ذات البنية النانومترية، والفرقة CH من البروتين الخالية من يجند هو أقوى في أطياف SERS تم الحصول عليها مع الركيزة نانو النقاط، في حين أن كل من البروتين والجلوكوز CH العصابات من البروتين ملزمة يجند أكثر وضوحا مع نانو السداسي الركيزة. ويتوقع أن تؤدي هذه الاختلافات في اثنين من العوامل، وتوافر الفضاء بين حج يتميز حيث يمكن للGBP ربط ني، وقابلية البروتين الخالية من ملزمة يجند ويجند في تعزيز الكهرومغناطيسي للرامان نثر في "النقاط الساخنة" بين هذه الميزات. من جهة، ونمط نانو النقاط يوفر مساحة أكبر نسبيا بين ميزة حيث ني الطلاء هو متاح للبروتين لربط، وهو ما قد يفسر أكثر وضوحا CH الفرقة لاحظ لGBP خالية من الجلوكوز في حج نانو النقاط الركيزة. من ناحية أخرى، وذلك بسبب struc من غير موحدة البنية (انظر الشكل 6D)، حج نانو السداسي قد تكون عرضة لإظهار تعزيز الكهرومغناطيسي أقوى في تضييق الفجوات بين الجزر داخل حج نانو السداسي مما أدى إلى العصابات أقوى CH الاهتزاز من GBP محددة الجلوكوز على الركيزة نانو السداسي. بعض تفاصيل هذا التفاعل تتطلب مزيدا من التحقق، والاستفادة المثلى من ركائز SERS للالتحاليل المعقدة التي تنطوي على البروتينات الكبيرة مثل GBP لا يزال في طور الإعداد.
بوضوح، والكشف عن SERS من يجند ملزمة بتوظيف الجزيئات الحيوية يجمد كعنصر الاعتراف ومما يسهل فقط عندما يجند هو رامان نشط في المنطقة المحددة، في حين أن المكونات الأخرى ليست كذلك. هذا هو الحال بالنسبة للتصميم 3، حيث يتم الحصول على SERS وضوحا عصابات محددة أبتمر الدوبامين (الشكل 11). الزوج أبتمر-الدوبامين المعارض خصوصية ممتازة ويضم الطيف SERS العصابات وضوحا دون أي إشارة الخلفية كبيرة.
> مسبقا المستقبل للتكنولوجيا SERS التسمية رسوم ستشمل الاختبارات واسعة من SERS تعزيز إشارة الجزيئات الحيوية 'مع مجموعة واسعة من مختلف التصاميم البنية النانوية السطحية. استخدام الكتابة المباشر شعاع الالكترون الطباعة الحجرية إلى افتعال مختلف النانو مع مستوى رائع من السيطرة على الحجم والشكل، وبين ميزة الفصل، جنبا إلى جنب مع بروتوكولات إعداد العينات المعروضة هنا، من شأنه أن يسهل المقارنة وعبر المصادقة على النتائج التي تم الحصول عليها من قبل مجموعات بحثية مختلفة. وهذا من شأنه مواجهة التحدي الرئيسي لاستنساخ عندما يتم ملفقة SERS ركائز توظيف بديل "أسفل إلى أعلى" أساليب 11،12،13، والسماح لتحسين السيطرة على حجم البنية النانوية المعدنية وموقفها تجاه تحديد موثوق للتصميم الأمثل الركيزة لمجموعة متنوعة واسعة من التطبيقات. قابلية هذه التقنيات قد تحسنت لاحقا من خلال الجمع بين EBL مع أساليب طباعة حجرية نانوية التكميلية مثل نانوالطباعة الحجرية بصمة نحو 19 في المستقبل الانتاج الكبير للتصاميم النانومترية الحجم الأمثل توظيف التقنيات EBL الانضباطي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 11-Mercaptoundecanoic acid (MUA) |  Sigma Aldrich |
450561 ALDRICH | Used for surface functionalization in Design 1 |
| Conductive polymer | Mitsubishi Rayon |
aquaSAVE-57xs | A 70 nm thick layer is used as anti-charging coating for EBL exposures |
| D-glucose | Collaborator Lab. | Ligand in Design 2 | |
| Dopamine | Collaborator Lab. | Ligand in Design 3 | |
| Dopamine binding aptamer (DBA) | Integrated DNA Technologies Inc. |
5'- /Thiol Modifier C6 S-S/ AAAAAAAAAA GTCTCTGTGT GCGCCAGAGA ACACTGGGGC AGATATGGGC CAGCACAGAA TGAGGCCC-3' | Biopolymer in Design 3 |
| Fused silica wafers | Mark Optics |
||
| Glucose binding protein (GBP) | Collaborator Lab. |
PDB ID 2HPH | Biopolymer in Design 2 |
| High vacuum grease | Dow Corning |
Used to seal water-proof chamber | |
| Hydrogen Peroxide 30%, H2O2 | J.T. Baker | Used for pirahna solution | |
| N-ethyl-N'-(3-(dimethylamino) propyl) carbodiimide (EDC) | Sigma Aldrich |
03450 FLUKA | Used for immobilization of biopolymer in Design 1 |
| N-Hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma Aldrich |
130672 ALDRICH | Used for immobilization of biopolymer in Design 1 |
| Potassium phosphate buffer | Collaborator Lab. | Buffer used in Raman sampling | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Collaborator Lab. | Solvent in Design 3 | |
| Polymethylmethacrylate (PMMA) 950 A2 | MicroChem |
A 90 nm thick layer is used as EBL positive tone resist | |
| Recombinant protein A | Protein Mods Inc |
PDB ID 1BDD | Biopolymer in Design 1 |
| Sulfuric acid 96%, H2SO4 | J.T. Baker | Used for pirahna solution | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (TRIS) and ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) buffer | Sigma Aldrich |
T9285 SIGMA | Buffer in Design 3
|
| |
|||
| Equipment | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dicing saw | Diamond Touch Technology Inc. (17301 W Colfax Ave # 152, Golden, CO) |
Used to cut FS wafer | |
| Electron beam evaporator | Kurt J. Lesker |
Used for Au and Ag evaporation | |
| Electron beam evaporator | Johnsen Ultravac (JUV) |
JuV E-gun | Used for Ni evaporation |
| Microscope cover slips (25 mm) | Fisher Scientific |
12-545-102 | Used in water-proof chamber |
| Microscope slides (3×1 in.) | Fisher Scientific |
Used in water-proof chamber | |
| Raith 150TWO EBL exposure system | Raith Inc. |
Raith 150TWO system | Used for EBL exposures |
| Raman microscope | Thermo Scientific |
Nicolet Almega XR | Used for Raman spectroscopy |
| Sonicator system | Branson |
Used for liftoff and solutions mixing | |
| Spinner | Brewer Spinner and Hotplate |
Cee 200X and Cee 1300X | Used to spin-coat PMMA and conductive polymer |
References
- Sapsford, K. E., Tyner, K. M., Dair, B. J., Deschamps, J. R., Medlintz, I. L. Analyzing Nanomaterial Bioconjugates: A Review of Current and Emerging Purification and Characterization Techniques. Anal. Chem. 83, 4453-4488 (2011).
- Walcarius, A., Minteer, S. hD., Wang, J., Yu, L., Merkoçi, A. Nanomaterials for Bio-Functionalized Electrodes: Recent Trends. J. Mater. Chem. B. 1, 4878-4908 (2013).
- Kim, J., et al. Applications, Techniques, and Microfluidic Interfacing for Nanoscale Biosensing. Microfluid. Nanofluid. 7, 149-167 (2009).
- Rassaei, L., Singh, P. S., Lemay, S. G. Lithography-Based Nanoelectrochemistry. Anal. Chem. 83, 3974-3980 (2011).
- Wong, L. S., Khan, F., Micklefield, J. Selective Covalent Protein Immobilization: Strategies and Applications. Chem. Rev. 109, 4025-4053 (2009).
- Ley, C., Holtmann, D., Mangold, K. -M., Schrader, J. Immobilization of Histidine-Tagged Proteins on Electrodes. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 88, 539-551 (2011).
- Kim, D., Herr, A. E. Protein Immobilization Techniques for Microfluidic Assays. Biomicrofluidics. 7, 041501 (2013).
- Anker, J. N., Hall, W. P., Lyandres, O., Shah, N. C., Xhao, J., Van Duyne, R. P. Biosensing with Plasmonic Nanosensors. Nature Materials. 7, 442-453 (2008).
- Bantz, K. C., et al. Recent Progress in SERS Biosensing. Phys.Chem. 13, 11551-11567 (2011).
- Sharma, B., Frontiera, R. R., Henry, A. -I., Ringe, E., Van Duyne, R. P. SERS: Materials, Applications, and the Future. Mater. Today. 15, 16-25 (2012).
- Kleinman, S. L., Frontiera, R. R., Henry, A. -I., Dieringer, J. A., Van Duyne, R. P. Creating, Characterizing, and Controlling Chemistry with SERS Hot Spots. Phys.Chem.Chem.Phys. 15, 21-36 (2013).
- Fan, M., Andrade, F. S., Brolo, A. G. A Review on the Fabrication of Substrates for Surface Enhanced Raman Spectroscopy and their Applications in Analytical Chemistry. Anal. Chim. Acta. 693, 7-25 (2011).
- Cao, Y., Li, D., Jiang, F., Yang, Y., Zh, H. Engineering Metal Nanostructure for SERS Application. J. Nanomater. 123812, 1-12 (2013).
- Glembocki, O., Rendell, R., Alexson, D., Prokes, S., Fu, A., Mastro, M. Dielectric-Substrate-Induced Surface-Enhanced Raman Scattering. Phys. Rev. B. 80, 085416 (2009).
- Merlen, A., et al. Surface Enhanced Spectroscopy with Gold Nanostructures on Silicon and Glass Substrates. Surf. Sci. 605, 1214-1218 (2011).
- Muhammad, M., Buswell, S. C., Dew, S. K., Stepanova, M. Nanopatterning of PMMA on Insulating Surfaces with Various Anticharging Schemes Using 30 keV Electron Beam Lithography. J. Vac. Sci. Technol. B. 29, 06F304 (2011).
- Peters, R., Fito, T., Gutierrez-Rivera, L., Dew, S. K., Stepanova, M. Study of Multilayer Systems in Electron Beam Lithography. J. Vac. Sci. Technol. B. 31, 06F407 (2013).
- Gutierrez-Rivera, L., Peters, R., Dew, S., Stepanova, M. Application of EBL Fabricated Nanostrucutred Substrates for SERS Detection of Protein A in Aqueous Solution. J. Vac. Sci. Technol.B. 31, (2013).
- Gutierrez-Rivera, L., Peters, R., Dew, S., Stepanova, M. Surface-Enhanced Raman Spectroscopy Detection of Protein-Ligand Binding Using D-glucose and Glucose Binding Protein on Nanostructured Plasmonic Substrates. , (2014).
- Peters, R. Fabrication and Testing of Surface-Enhanced Raman Spectroscopy Substrates for the Detection of Biomolecules [MSc Thesis]. , University of Alberta. (2014).
- Gouda, H., Torigoe, H., Saito, A., Sato, M., Arata, Y., Shimada, I. Three-Dmensional Solution Structure of the B Domain of Staphylococcal Protein A: Comparisons of the Solution and Crystal Structures. Biochemistry. 31, 9665-9672 (1992).
- Cuneo, M. J., Johnson, S. J., Beese, L. S., Hellinga, H. W. High Resolution Structure of E. Coli Glucose/Galactose Binding Protein Bound with Glucose. Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB) Protein Data Bank. , (2009).
- Humphrey, W., Dalke, A., Schulten, K. VMD - Visual Molecular Dynamics. J. Molec. Graphics. 14, 33-38 (1996).
- Walsh, R., DeRosa, M. C. Retention of Function in the DNA Homolog of the RNA Dopamine Aptamer. Biochem. Biophys. Res. Comm. 388, 732-735 (2009).
- Akitomi, J., Kato, S., Yoshida, Y., Horii, K., Furuich, M., Waga, I. ValFold: Program for the Aptamer Truncation Process. Biomed. Inf. 7, 38-40 (2011).
- Han, K., Lee, Y., Kim, W. PseudoViewer: Automatic Visualization of RNA Pseudoknots. Bioinformatics. 18, S321-S327 (2002).
- Dwyer, M. A., Hellinga, H. W. Periplasmic Binding Proteins: a Versatile Superfamily for Protein Engineering. Curr. Opin. Struct. Biol. 14, 495-504 (2004).
- Benson, D. E., Conrad, D. W. Design of Bioelectronic Interfaces by Exploiting Hinge-Bending Motions in Proteins. Science. 293, 1641-1644 (2001).
- Bozic, S., Chorzempa, J. Pirahna Cleaning. , University of Alberta. (2011).
- Mohammad, M. A. Raith 150TWO SOP. , University of Alberta. (2011).
- Schmidt, M. W., et al. General Atomic and Molecular Electronic Structure System. J. Comput. Chem. 14, 1347-1363 (1993).
- Bode, B. M., Gordon, M. S. MacMolPlt: a Graphical User Interface for GAMESS. J. of Mol. Graph. Mod. 16, 133-138 (1998).
- Bright, A., Devi, T. S. R., Gunasekaran, S. Spectroscopical Vibrational Band Assignment and Qualitative Analysis of Biomedical Compounds with Cardiovascular Activity. Int. J. Chem. Tech. Res. 2, 379-388 (2010).
- Bandekar, J. Amide Modes and Protein Conformation. Biochim. Biophys. Acta. 1120, 123-243 (1992).
- Barth, A., Zscherp, C. What Vibrations Tell About Proteins. Quarterly Reviews of Biophysics. 35, 369-340 (2002).
- Chrimes, A. F., Khoshmanesh, K. h, Stoddart, P. R. M. itchellA., Kalantar-Zadeh, K. Microfluidics and Raman Microscopy: Current Applications and Future Challenges. Chem. Soc. Rev. 42, 5880-5906 (2013).
- Park, S. -K., Lee, N. -S., Lee, S. -H. Vibrational Analysis of Dopamine Neutral Base based on Density Functional Force Field. Bull.-Korean Chem. Soc. 21, 959-968 (2000).
- Briand, E., Salmain, M., Compère, C., Pradier, C. M. Immobilization of Protein A on SAMs for the elaboration of immunosensors. Coll. Surf. B: Biointerfaces. 53, 215-224 (2006).
- Lakowicz, L. R., et al. Radiative decay engineering: 2. Effects of Silver Island Films on Fluorescence Intensity, Lifetimes, and Resonance Energy Transfer. Analytical biochemistry. 301, 261-277 (2002).
