Abstract
Fremstilling og karakterisering af konjugerede nano-biologiske systemer grænseflade metalliske nanostrukturer på faste bærere med immobiliserede biomolekyler rapporteres. Hele sekvensen af relevante eksperimentelle trin er beskrevet, som omfatter fremstilling af nanostrukturerede substrater under anvendelse af elektronstrålelitografi, immobilisering af biomolekyler på substraterne, og deres karakterisering udnytte overflade Raman spektroskopi (SERS). Tre forskellige designs af nano-biologiske systemer anvendes, herunder protein A, glucose bindende protein, og en dopamin bindende DNA aptamer. I de to sidstnævnte tilfælde bindingen af respektive ligander, D-glucose og dopamin, er også inkluderet. De tre typer af biomolekyler immobiliseres på nanostrukturerede substrater ved forskellige metoder, og resultaterne af SERS imaging rapporteres. Funktionerne i SERS at detektere vibrationsformer fra overflade-immobiliserede proteiner, såvel som at fange protein-ligand-end aptamer-ligand binding påvises. Resultaterne illustrerer også indflydelse af overfladen nanostruktur geometri, biomolekyler immobilisering strategi, Raman aktivitet af molekyler og tilstedeværelsen eller fraværet af ligandbinding på SERS-spektre opnået.
Introduction
Kapacitet til at udvikle og karakterisere konjugerede nano-biologiske systemer grænseflade solide nanostrukturer og biologiske polymerer bliver stadig vigtigere for yderligere fremskridt i næste generations bio-sensing og bio-aktivering teknologier 1,2. Dette indebærer tværfaglige studier på tværs af en række forskningsområder, såsom fremstilling af relevante solid state-komponenter (mikro-eller nano- elektroder, nano-manipuleret belægninger, nanotråde, eller nanopartikler) 2,3,4; immobilisering af biomolekyler på overfladerne for at skabe ønskede biokonjugater 5,6,7; og overvågning nano-biologiske grænseflader 1. I de fleste tilfælde, udvælgelse af optimale fabrikation, bio-funktionalisering og karakteriseringsmetoder er stærkt indbyrdes forbundne. Det er klart, ville valget af nanoproduktionsanlæg teknikker drevet af kravene i solid state komponenter i systemet, afhænger i vid udstrækning af påvisningsmetoden, der i tuRN er bestemt af arten af de involverede biopolymerer og formålet med at overvåge interface.
Ud af en bred vifte af teknikker, der anvendes til at karakterisere Bioconjugate systemer 1,3, overflade forstærket Raman spektroskopi (SERS) har vist sig som en meget lovende metode til påvisning af kemiske og biologiske arter på overflader 8,9,10,11. SERS beskæftiger uelastisk spredning af monokromatisk lys ved overfladeaktive immobiliserede biomolekyler (figur 1), gør det muligt at fange af unikke signaturer, der svarer til molekylære vibrationer. Denne evne til at skelne mellem forskellige molekyler uden at involvere etiketter, kompleks kemi eller tidskrævende trin, gør SERS en potentielt meget effektiv metode til bio-detektion. En anden vigtig fordel af SERS er dens høje følsomhed. Den excitation af lokaliserede overfladeplasmoner ved let interagere med ædle metal nanostrukturer (SERS substrater) stiger dramatisk intensity af Raman-spredning af analytten, hvilket tillader påvisning af meget små mængder af molekyler, fra monolag ned til single-molekyle grænse 8,9,10,11. Endelig fleste biomolekyler kræver vandige opløsninger at være stabil. Fordi vand har ofte begrænset Raman aktivitet er baggrund signal fra vandige prøver minimeres 9. Anvendelser af SERS har udvist en eksponentiel stigning i det seneste årti 10. , En meget omtalt udfordring SERS er imidlertid, at den elektromagnetiske forøgelse af Raman spredning afhænger kritisk af størrelse, form, og afstanden mellem metal nanostrukturer hvor plasmoniske bølger induceres 11,12,13. For at opnå effektive og reproducerbare SERS målinger, kontrol over underlaget geometri er nødvendig på nanoskala dimensioner.
Figur 1. Schæm overfladeaktivt Raman spektroskopi.
Talrige metoder til at fabrikere SERS substrater 11,12,13 kan groft inddeles i bottom-up og top-down metoder. Metoder til den første type anvender forskellige processer i selv-samling eller styret kemisk syntese til fremstilling af nanostrukturer. Ofte behandles eksempler omfatter immobilisering af monodisperse nanopartikler på faste bærere 11,12,13, termiske, sputter eller elektrokemisk aflejring af ru metalfilm 11,12, og forskellige kemiske syntesemetoder 13. Selv om sådanne teknikker tendens til at være relativt enkel og billig, er de fleste af dem udfordret af en manglende kontrol over placeringen af de strukturer, og begrænset prøve-til-prøve reproducerbarhed.
I modsætning hertil topstyrede litografiteknikker ansætte manipulerbare instrumenter såsom partikelstråler at skabe ønskede mønstre på overflader. En af de oftest anvendtenanolithography metoder, elektronstråle litografi (EBL), tilbyder fantastisk kontrol over funktioner ned til under 10 nm og også en fleksibilitet, således at forskellige substrat design på faste bærere 11,12. I EBL, en stråle af elektroner fokuseret ned til en plet af nogle få nanometer i scanninger diameter over en overflade af en elektron følsomt materiale (modstå) forårsager en kemisk ændring i udsatte områder. For positiv tone modstår såsom polymethylmethacrylat (PMMA), elektron resulterer stråle eksponering i opdeling af polymerkæderne tilsammen udgør modstå, hvilket fører til en øget opløselighed i et passende opløsningsmiddel (bygherre). Processen med elektron-litografi omfatter spin-coating af et ensartet lag af modstå på et substrat; eksponering af det målrettede modstå materiale i et vakuumkammer med en elektronstråle; og udvikling af prøven for at fjerne de opløselige regioner.
Dielektriske understøtninger nedenunder metalliske nanostrukturer, såsom kvartsglas, har been vist at øge intensiteten i SERS grund lokalisering af plasmoniske bølger i forhold til andre materialer, såsom silicium 14,15. Men EBL mønster på dielektriske substrater, især på nanoskala, indebærer betydelige udfordringer på grund af ophobning under eksponeringen. Tidligere har vi vist 16,17, at disse vanskeligheder kan overvindes ved at placere ledende polymerlag over modstå. Figur 2 viser en skematisk afbildning af den samlede fremstillingsproces ved hjælp af EBL eksponering og udvikling efterfulgt af metal deposition og liftoff at fremstille metalliske nanostrukturer på fusioneret silica understøtter. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2. Skema til eLectron litografi, metal deposition, og liftoff proces trin anvendes til at fabrikere metalliske nanostrukturer på dielektriske substrater 16-19. I dette papir præsenterer vi hele sekvensen af procestrin involverer SERS substrater fabrikation af EBL, bio-funktionalisering af substraterne, og indsamling af Raman spektre. Tre designs udforsket i vores seneste værker 18,19 behandles (se figur 3 og 4, og tabel 1). I Design 1 er rekombinant protein A immobiliseret på bio-funktionaliserede Au nanostrukturer på et fusioneret silica (FS) understøtning 18, og SERS påvisning af proteinet er påvist. I Design 2, rekombinant glucose-bindende protein 21,26,27 med og uden ligand (D-glucose) immobiliseres ved hjælp af histidinmærker i mellemrum mellem Ag nanostrukturer på Ni-belagte FS, og bindingen af glucose til proteinet detekteres. I Design 3 thioleret dopamin-bindende DNEn aptamer 19,23 immobiliseres på Au nanostrukturer på FS, og bindingen af dopamin ved immobiliseret aptameren demonstreres. Inklusive alle relevante eksperimentelle trin fra forberedelse substrat til Raman spektre erhvervelse, og repræsentant for forskellige biomolekyler og strategier immobilisering, disse eksempler er nyttige for en bred vifte af applikationer, fra udforskning forskning afhøre nano-biologiske grænseflader som SERS til udviklingen af SERS biosensorer af små molekyler, der beskæftiger protein- eller aptamer-ligand binding som en anerkendelse metode. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3. Ordninger af tre repræsentative designs ved hjælp af forskellige biomolekyler, metoder til immobilization, og substrat materialer: (A) protein A immobiliseret på ædelmetallet nano-prikker funktionaliseret af en selv-samlet monolag (SAM) den 11.-mercaptodekansyre (MUA) i DI vand; (B) histidin-mærket glucose bindende protein (GBP) kompleksbundet med D-glucose immobiliseret på substratoverfladen mellem ædle metal nano-prikker; (C) thiol-terminerede dopamin bindende aptamer afsluttes med dopamin (DBA) immobiliseret på ædle metal nano-prikker. Se yderligere detaljer i tabel 1. I Design 2 illustreret ved panel (B) blev en prøve uden den tilsvarende ligand også forberedt til sammenligning. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 4.Biomolekyler ansat i tre udførelser: (A) protein A; (B) glucose bindende protein og D-glucose; (C) dopamin bindende DNA aptamer og dopamin. Protein- tertiære strukturer i (a) og (b), er taget fra Protein Data Bank, FBF ID 1BDD 20 og 2HPH 21 henholdsvis og tegnet med VMD for LINUXAMD64 version 1.9.1 22. Aptameren sekundære struktur i (c) er forudsagt fra sekvensen 23 ved hjælp ValFold 24 software og tegnet med PseudoViewer 3.0 25. Bogstaverne G, A, T og C svarer til guanin, adenin, thymin, og cytosin nukleotider, henholdsvis. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
| Design 1 Design 2 | Design 3 | ||
| Biopolymer | Protein A | Glucose protein (DKK) | Dopamin binding aptamer (DBA) |
| Binder | 11-Mercaptoundecanoic acid (MUA) selv-samlet monolag (SAM) | Histidinmærker | Thiol linkere |
| Ligand | Ingen | D-glucose | Dopamin |
| Opløsning | Deioniseret (DI) vand | Kaliumphosphatpuffer | Tris (hydroxymethyl) aminomethan (TRIS) og ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) buffer; Phosphatbufret saltvand (PBS) |
| Substrat | Au strukturer på FS | Ag strukturer på Ni-overtrukket FS | Au strukturer på FS |
| Mønstret area | 4 um x 10 um | 4 um x 8 um | 4 um x 10 um |
| Mønster | Au prikker, 50 nm beg | Ag prikker, 40 nm beg | Au sekskanter, 200 nm banen |
| Ag sekskanter, 200 nm banen | Au ustrukturerede puder | ||
| Ag ustrukturerede puder | |||
| Doser EBL eksponering | Dots: | Dots: 105 pC / cm2 | Sekskanter: 180 pC / cm2 |
| Array I 120 pC / cm2 | Sekskanter: 170 pC / cm2 | ||
| Array II 96 pC / cm2 | |||
| Array III 72pC / cm2 | |||
| Laser excitationsbølgelængde | 532 nm | 532 nm | 780 nm |
Tabel 1. Tre design af nano-biologiske systemer.
Protocol
1. Forberedelse af underlag
- Brug en halvleder terninger sav til at skære en smeltet silica (FS) wafer i 1 cm × 1 cm eller mindre terninger.
- Rene prøver i en Piranha-opløsning (H 2 SO 4: H 2 O 2, 3: 1; ADVARSEL: stærk iltningsmiddel) bad 28 i 15 minutter, derefter skylles terningerne i deioniseret vand og tør i nitrogen.
- Anbring prøverne på en varmeplade opad ved 180 ° C i 15 min. Cool prøverne efter fjernelse fra kogepladen til RT.
- For design 1 og 3, skal du fortsætte til trin 2.
- For Design 2, anbringes prøven i en elektronstråle fordampning kammer og pels med en 10 nm lag af Ni.
2. Fremstilling af Nano-mønstrede PMMA Masker Brug elektronstråle litografi (EBL)
- Spin-pels PMMA modstå og ledende lag på substrater.
- Brug en wafer spinner med et vakuum borepatron og sted prøver individuelt i centrum på patronen. Sted1 dråbe af polymethylmethacrylat (PMMA) modstå på midten af prøverne under anvendelse af en glaspipette og centrifugering ved 3.500 rpm i 60 sek med en 2 sek rampetid.
- Bag substrater ved 180 ° C i 3-5 min. Efter bagning substraterne, afkøles prøverne til stuetemperatur.
- Med substraterne afkøles og returneres til spinner chuck, spredes en dråbe af ledende polymer på substratet. Spin substrat for 40 sekunder ved 3000 rpm med en 2 sek rampetid. Bake prøver ved 80 ° C i 1 min.
- Udfør EBL eksponering i henhold til den normale procedure 16,17,18,29.
- Brug af fabrikantens anvisninger, udarbejde en eksponering design anvender funktionen doser af tabel 1 med den mindst mulige stråle skridt størrelse.
- Indlæs prøven i elektronstrålelitografi kammer. Hvis EBL systemet ikke har autofokus, skal du bruge en lille ridse væk fra hvor det mønster er at blive eksponeret og væk fra perlen kant til fokusIng.
- Brug af producentens anvisninger, udføre den nødvendige fokusering og bygningsfejl korrektion samt skrive felt tilpasning efter behov, og udsætte prøven. For at give mulighed for korrekt eksponering profil og bedste mønster kvalitet, skal du bruge et 30 keV elektronstråle energi og 7,5 um blænde for engagementerne.
- Fjern den ledende polymer og udvikle udsatte prøver.
- Forbered et bægerglas med deioniseret (DI) vand til fjernelse af ledende polymer og et andet bægerglas med en udvikler blanding (IPA: H2O 7: 3), og der omrøres i 5 minutter ved stuetemperatur. Forbered isopropanol (høj renhed) i et tredje bægerglas som afspændingsmiddel.
- Hjælp af en pincet, placere prøver i vand til 3 sek for at fjerne den ledende polymerfilm, så prøven i udvikleren placere og flytte pincet langsomt op og ned for 20 sek. Umiddelbart overføre substrater til isopropanol og skyl i 10 sekunder mere, så tør prøven med kvælstof. </ Ol>
3. Noble Metal Nanostrukturer Fabrication
- Læg prøverne hovedet i elektronstrålen fordamper til at muliggøre for fordampet metal, der skal deponeres på forsiden af prøverne. Depositum en 10 nm tykt Au lag på prøverne for design 1 og 3, og 10 nm tykt Ag lag for Designforskning 2 med en hastighed på ca. 0,1 nm / sek.
- Fyld en lydbehandling system til det anbefalede højde med vand og fylde en separat bæger med acetone. Anbring en prøve opad i bunden af bægerglasset og lade prøven i blød i 10 minutter. Hold bægeret, anbring den i vandbadet, så højden af acetone svarer til højden af vand og tænd sonication system. Tillad sonikering at forekomme i op til 60 sek.
- Brug den samme fremgangsmåde som beskrevet i trin 3.1, forberede ensartede Au og Ag pad substrater ved udfældning af 10 nm tykke metalfilm på FS (Designs 1 og 3) og Ni-belagte FS (Design 2) SUBSTRAtes springer trin 2.
4. Bio-funktionalisering af substrater
- Forbered design 1 prøver:
- Forbered en 1 mM opløsning af 11-mercaptodekansyre (MUA) i ethanol ved stuetemperatur. Sonikeres i 10 minutter.
- Nedsænk korrekt nanostruktureret substrat i opløsning af MUA i 48 timer. Skyl prøven med ethanol tre gange og tørre i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Der fremstilles en 75 mM opløsning af N-ethyl-N '- (3- (dimethylamino) propyl) carbodiimid (EDC) i DI vand. Forbered en 15 mM opløsning af N-hydroxysuccinimid (NHS) i DI vand.
- Med en mikropipette depositum 100 pi NHS på Au på underlaget, og straks tilføje 100 pi EDC på samme areal. Der inkuberes i 1 min for at aktivere selv-samlet monolag (SAM) af MUA.
- Placer en 100 ul dråbe protein A opløsning (47 uM) på det samme område af substratet, og prøven opbevares i 24 timer ved 5 ° C i en multi-rum Petri dish med 1 ml DI-vand i en anden rum, og med et forseglet låg.
- Skyl prøven i DI vand 3 gange med vedvarende omrøring prøverne i separate bægre til 20 sekunder i hvert bægerglas. Lad ikke prøverne tørre efter skylning eller under skylning.
- Fortsæt til trin 5.
- Forbered Design 2 prøver:
- Der fremstilles en 0,9 mM opløsning af glucose bindende protein (GBP) i kaliumphosphatpuffer (K 2 HPO 4, 25 mM, pH 7,5). Der fremstilles en 100 mM opløsning af D-glucose i bufferen.
- Bland 30 pi 100 mM D-glucoseopløsning og 30 pi 0,9 mM GBP opløsning under anvendelse af en 1 ml plastik mikrorør beholder og en mikropipette. Inkuber i 30 minutter.
- Deposit 20 pi ligand-fri GBP opløsning og den ligand-bundne GBP løsning hver på den forberedte substrater under anvendelse af en mikropipette. Opbevare prøverne ved 5 ° C i 24 timer i en petriskål med en forseglet dæksel.
- Skyl prøverne 3 gange ikaliumphosphatpuffer opløsning ved stuetemperatur.
- Fortsæt til trin 5.
- Forbered Design 3 prøver:
- Dopamin bindende aptamer (DBA) opløsning til en koncentration på 1 um ved hjælp af TRIS EDTA buffer med en endelig pH på 7,4 fortyndes.
- Forbered en dopamin opløsning til en 5 uM koncentration ved at måle dopamin pulver på en analytisk vægt og blande det i phosphatbufret saltvand (PBS) med en omrører vulst for 5 min.
- Deponere en 20 pi dråbe af DBA opløsning på overfladen af hvert substrat og lade prøverne henstå i 1 time ved stuetemperatur med et dække over petriskålen.
- Skyl prøverne 3 gange i en kaliumphosphatbuffer (K 2 HPO 4, 25 mM, pH 7,5).
- Anbring prøverne oprejst på toppen af en renrum klasse tørre tørre bagsiden samtidig opretholde en film på forsiden af substratet. Sæt en prøve side som en kontrol.
- Placer en 5 pi dråbe af dopamin løsning on overfladen af eksisterende dråbe af PBS-buffer løsning på de resterende prøver med de ønskede dopamin koncentrationer. Prøven inkuberes i 10 min.
- Placer en dråbe af dopamin løsning på Au pad overflade uden aptamer. Inkuber i 10 minutter.
- Skyl prøverne i kaliumphosphatpuffer løsning 3 gange.
5. Raman spektroskopi
- Placer hver prøve i en vandtæt kammer for at undgå fordampning af laserstråling.
- Fyld en plastik sprøjte med kemisk inaktivt højvakuum fedt, sted prøver på objektglas og dispensere et par millimeter fedt omkring prøverne uden at røre prøverne.
- Placer et mikroskop dækglas på toppen af substraterne og tryk forsigtigt ned for at danne en forsegling, hvilket skaber en tynd væske-grænseflade mellem substraterne og dækglassene uden at bufferen til at komme i kontakt med vakuum fedt.
- Brug af enoptisk Raman mikroskop system få fokus på overfladen af metallet nano-mønstrede region kan udtages uden at tænde for laseren.
- Udfør Raman sampling 18,19 med en laser intensitet mellem 2,4-3,1 mW med en samlet varighed på mindre end 20 sek for at forhindre skader på stikprøven med en målsætning om 10X forstørrelse. Acquire Raman spektre for prøver fra Design 1, 2 og 3 under anvendelse af excitationsbølgelængder som angivet i tabel 1. Også opnå kontrol Raman spektre for opløsninger af protein A, GBP og D-glucose, og for dopamin pulver anvender objektglas uden metal nanostrukturer som støtter til sammenligning.
Representative Results
Indsamling kontrol Raman spektre for de vigtigste komponenter, herunder frie proteiner i opløsning og frie ligander i opløsning eller i pulverform uden brug af metal-holdige substrater, er vigtigt for at muliggøre en korrekt sammenligning samt tolkning formål. Figur 5A viser et typisk Raman frekvenser til gratis protein A i DI vand på en glasplade uden nanostrukturerede substrater. To bands med den højeste Raman intensitet, båndet ved 2931 cm-1 og på 1,091 cm -1, svarer til vibrationer, der involverer CH og CS obligationer hhv. Andre bands med en lavere Raman intensitet såsom 563 cm -1, 1.450 cm-1, 1653 cm-1 og 2426 cm-1, kan henføres til en superposition af vibrationsindstillinger 18,32,33,34. Kontrol Raman spektre for liganden fri GBP i bufferopløsning med tre forskellige koncentrationer, 0,3, 0,9 og 1,3 mM, er vist i figur 5B. I t han regne, det brede bånd omkring 3.400 cm -1 svarer til opløsningsmidlet 35, mens bandet på 2935 cm -1 repræsenterer vibrationer involverer CH bindinger af proteinet 32,33. figur 5C viser den høje bølgelængde Raman spektrum for D-glucose i bufferopløsning for forskellige koncentrationer: 1, 6, 100, 200 og 400 mM. Når koncentrationen af glucose stiger, opstår CH obligationer vibrationer bånd ved 2.890 cm-1 og 2.960 cm -1. Kontrol Raman spektre af dopamin i krystalform opnået med både 532 nm og 780 nm excitationsbølgelængder er vist i figur 5D. Meget af Raman-spektret kommer fra benzenringen bøjning og CH bond strækninger af molekylet 19,36. Nogle af de bands på omkring 3.000 cm-1 er kun observeret ved 532 nm, men ikke 780 nm excitationsbølgelængde.
pload / 52712 / 52712fig5.jpg "/>
Figur 5. Kontrol Raman spektrum af protein A i DI vand opnået ved 532 nm excitationsbølgelængde 18 (A); Raman spektre af ligand-fri glucose bindende protein i buffer opløsning opnået ved 532 nm excitationsbølgelængde (B); Raman spektre af D-glucose i buffer opløsning opnået ved 532 nm excitationsbølgelængde (C); og spektre af dopamin pulver opnået ved 532 nm og 780 nm excitationsbølgelængder 19 (D). Alle spektre er regelmæssige Raman spektre af opløsninger (a, b, c) og pulver (d) på objektglas uden nanostrukturerede substrater. I (D), blev tildelingen af Raman skift regimer til forskellige molekylære vibrationer gøres ved hjælp af General Atomic og Molekylær Electronic Structure System (gamess) 30 og MacMolPlt 31 software som beskrevet andetsteds 19. Genoptrykt panel (a) med tilladelse fra den 18. Americen Vacuum Society. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
For at opnå SERS-spektre for overfladeaktive immobiliserede biomolekyler, er substrater, der omfatter metalliske nanostrukturer på kvartsglas understøtninger fremstillet som beskrevet i trin 1-3. Kvaliteten af jern- substrater overvåges ved hjælp af scanning elektronmikroskopi (SEM). Standard SEM procedurer er beskrevet andetsteds 16,17,18, 19 og ikke medtaget i denne protokol. Figur 6 viser repræsentative SEM billeder af Au og Ag nano-prikker og nano-sekskant lignende strukturer (paneler AD) samt ikke -structured Au og Ag pads (paneler E og F, henholdsvis). De næste skridt indebærer immobilisering af biologisk materiale på nanostrukturerede substrater beskæftiger tre designs, der er anført i tabel 1, og erhvervelse af deres SERS spektre. I o rder at opretholde et vandigt miljø under Raman billedbehandling, er hver prøve placeres i sin tilsvarende opløsning (se tabel 1), lukket med et tyndt glasdæksel og forseglet som illustreret i figur 7.
Figur 6. scanningselektronmikroskop (SEM) billeder af 10 nm tyk Au og Ag overflade nanostrukturer anvendes som SERS substrater: (A, B) arrays af nanodots; (C, D) arrays af nano-sekskanter; (E, F) ustrukturerede pads. Substrater med Au strukturer (venstre) ansætte FS understøtter, mens substrater med Ag strukturer (højre) bruger en 10 nm tyk Ni belægning på FS. Billederne blev opnået som beskrevet andetsteds 16,17,18.pg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 7. Arrangement med vandtæt kammer til Raman billeddannelse af biologisk funktionaliserede prøver i opløsning.
I Design 1 er rekombinant protein A immobiliseret på substraterne funktionaliseres ved en selv-samlet monolag af 11-mercaptodekansyre (MUA) i DI vand 18. Substraterne i dette motiv omfatter tre arrays af Au prikker med en 50 nm banen og varierende inter-dot afstande på smeltet silica (se figur 6A og 8). Processen med protein immobilisering begynder med dannelsen af et SAM på substrater. For at opnå kovalent binding mellem SAM og proteinet er carboxylsyregrupperne af SAM omdannet til aminreaktive NHS-ester ved behandling med en blanding af N ethyl-N '- (3- (dimethylamino) propyl) carbodiimid (EDC) opløsning og N-hydroxysuccinimid (NHS) opløsning i deioniseret vand. Immobilisering af protein A sker ved forskydning af NHS gruppen ved lysinrester i proteinet 37. Et eksempel på billeddannende prøver til Design 1 med protein A immobiliseret på Au nanostrukturer er vist i figur 9. Figur 9A viser et optisk mikroskop billede af prøverne, som omfatter tre arrays af bio-funktionaliserede Au nanodots med forskellige inter-dot huller (se også fig 3aa og 8), og figur 9B viser Raman spektrale kortlægning i disse arrays. Det kan ses, at de højeste Raman intensiteter findes for Array I, når de inter-dot huller er den smalleste, mens der opnås lavere intensiteter for Array III med de bredeste inter-dot huller. Dette kan forklares med en stærkere plasmon kobling effekt produceret af højere el-fieLDS i de smalle mellemrum mellem prikkerne 18. Figur 9C viser den stærkeste SERS-spektre blev opnået for Arrays I og II. Spektrene udviser flere bånd (1.630 cm-1, 1.964 cm-1, 2.280 cm-1, 2,577 cm -1 og 2.916 cm-1) i nærheden af den Raman former for frit protein A i opløsning ses i figur 5A. Fordelt til vibrationer af forskellige obligationer findes i proteiner, disse bånd enten møde på lignende steder i både immobiliserede protein og i opløsning, eller er lidt forskudt til noget højere bølgetal når immobiliseret. I modsætning hertil SERS spektre af lignende nanostrukturerede substrater funktionaliseres ved MUA SAM uden proteinet viser en helt anden mønster 18, der bekræfter, at Figur 9 viser SERS kortlægning af overfladeimmobiliseret protein A. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8. SEM billeder af tre rækker af Au nanodots på FS substrat, der anvendes i design 1 18. De arrays har samme 50 nm banen og lidt anderledes dot radier resulterer i forskellige bredder af inter-dot huller. Dette opnås ved at anvende doser forskellige EBL eksponering at producere PMMA masker til de tre arrays (se tabel 1). Doser højere eksponering resulterer i bredere huller i PMMA masker, der giver mulighed for større Au dot størrelser efter metallisering og liftoff. Genoptrykt med tilladelse fra 18 amerikanske Vacuum Society. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
les / ftp_upload / 52712 / 52712fig9.jpg "/>
Figur 9. SERS billeddannelse af substrat-immobiliseret protein A i Design 1 18. (A) Optisk mikroskop billede af prøven, der omfatter tre rækker af Au nanodots med 50 nm banen og forskellige inter-dot huller på en smeltet silica substrat (se også figur 6), bio-funktionaliseret som vist i figur 3A. (B) Raman kortlægning af prøven. (C) SERS-spektre fra prik Array I og II. I panel (B), den lodrette akse repræsenterer afstanden over substratet, den vandrette akse repræsenterer Raman shift, og legenden bar viser Raman intensiteter. Lodret punkterede linier i paneler (B) og (C) repræsenterer benchmark Raman-bånd af frit protein A i opløsning og (*) i panelet (C) viser SERS bands fra Array I. Raman spektre blev opnået 532 nm excitationbølgelængde. Genoptrykt med tilladelse fra 18 amerikanske Vacuum Society. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
I Design 2, rekombinant glucose bindende protein (GBP) 21 kompleksbundet med D-glucose (ligand) immobiliseret på passende substrater i kaliumphosphatpuffer opløsning. Prøver med immobiliserede ligand-fri GBP fremstilles også til sammenligning. I denne udformning er glucose-bindende protein bundet til overfladen ved hjælp af et histidin-tag, som binder godt til Ni men ikke til ædelmetaller 6. Da substraterne omfatter arrays af Ag nano-prikker, nano-sekskanter og ustrukturerede Ag pads på Ni-belagte FS (figur 6B, 6D og 6F, henholdsvis), kan man forvente fleste af immobiliserede proteinmolekyler til at være placeret i mellemrummene mellem Ag nanostrukturer hvor Ni belægning er available. Raman spektre opnået for immobiliseret glucose-fri og glucose-bundne GBP er vist i figurerne 10A og 10B, henholdsvis. Alle disse spektre udviser et bredt bånd ved ca. 3.300 cm -1, hvilket svarer til bufferopløsningen 35. Den opnåede spektre med en ustruktureret Ag pad kun indeholde denne enkelt bånd og viser ikke noget protein vibrationstilstande, bekræfter, at immobiliseret protein ikke findes på Ag overflade som forventet. I modsætning hertil spektre opnået med arrays af Ag nano-prikker og nano-sekskanter udviser bånd omkring 1.550 cm -1 og 2.900 cm -1, som repræsenterer analyt 32,33. Især den brede bånd omkring 1.550 cm-1, kendt som amid II båndet skyldes peptidbindinger vibrationer i proteiner 33,34. I den betragtede tilfælde, dette bånd er en superposition af vibrationsindstillinger fra GBP immobiliseret på Ni overflade mellem Ag funktions, og er vejledende for SERS forøgelse af disse tilstande i nærheden af ædle metal nanostrukturer, når substrater, der indeholder nano-prikker eller nano-sekskanter anvendes. Dette band er meget svag for proteinet i opløsning i fravær af SERS ekstraudstyr (figur 5B) og fraværende på Ag pads uden Ni overflade rådighed for proteinbinding, men det er godt udtalt for nanostrukturerede substrater med nogle Ni overflade tilgængelige for proteinet til at binde. Men endnu vigtigere for denne undersøgelse er de andre, de snævrere udsvingsbånd omkring ca. 2.900 cm-1, der kan henføres til CH bond wibrations 32,33. Spektret af glucose-fri GBP viser en udtalt bånd ved 2933 cm-1 med nano-prikker substrat, og en svag, men mærkbar band på et tilsvarende bølgelængde med nano-sekskanter substrat (figur 10A). Adskiller sig fra de for glucose fri protein, den SERS-spektre af glucose-bundne GBP vist i Figu re 10B udviser to bånd svarende til CH obligationer vibrationer regimer, på 2.850 cm -1 og 2,910 cm -1. Båndene er godt udtales i spektret af glucose-bundne GBP på nano-sekskanter substrat, og de kan også ses i spektret af GBP på nano-prikker substrat. Båndet på 2.850 cm -1 er rimeligt tæt på 2.890 cm -1 én i kontrolgruppen Raman spektret fra D-glucose i opløsning, og det kan derfor henføres til glucose er bundet til proteinet, mens det andet bånd (på 2,910 cm -1) kan henføres til CH bond vibrationer både proteinet og glucose. Man kan konkludere, at forskellen på SERS underskrifter fra glucose-fri og glucose-bundne substrat-immobiliserede GBP kan observeres i denne region, og CH bond vibrationer proteinbundet glucose er påviselige ansætte den beskrevne design.
10.jpg "/>
Figur 10. SERS spektre af ligand-fri (A) og ligand-bundet (B) glukose-bindende protein immobiliseret på tre forskellige substrater i Design 2. Den spektre blev opnået med 780 nm excitationsbølgelængde. Klik her for at se en større version af dette tal.
I Design 3 er tilpasset dopamin bindende aptamer (DBA) med thiol afslutning 23 immobiliseret på substratet i tris (hydroxymethyl) aminomethan (TRIS) ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) bufferopløsning, og dopamin derefter bundet til den immobiliserede aptamer 19. De substrater for dette motiv indeholder arrays af Au nano-sekskanter på FS (figur 6c). Ustrukturerede Au pads (figur 6E) bruges også til kontrolformål. Da DNA er uløseligt fluorescerende 38, excitation 780 nm waveleng th anvendes i Design 3 for at reducere denne faktor. I dette design, er anerkendelsen element (aptamer) ikke Ramanaktive i regionen Raman forskydninger betragtes i figur 11, mens dopamin viser en markant Raman aktivitet i denne region. Da signalet fra prøver udsat for kun dopamin uden immobiliseret aptamer viser ingen resulterende dopamin bånd 19, er de observerede SERS bands forventes at stamme fra aptamer bundet dopamin. Figur 11 sammenligner SERS-spektre af immobiliseret aptamer på guld nanostrukturer før og efter tilsætning af dopamin. Som forventet, er immobiliseret dopamin-free aptamer ikke udviser Raman-bånd. I modsætning hertil er observeret en række markante Raman-bånd for dopamin-bundne immobiliseret aptamer. Positionerne af de fleste bånd i figur 11 er tæt på dem i krystallinsk dopamin, dog med forskelle i amplituder.
igur 11 "src =" / files / ftp_upload / 52712 / 52712fig11.jpg "/>
Figur 11. SERS spektre af ligand-fri (lilla linje) og ligand-bundne (blå linje) dopamin-bindende aptamer immobiliseret på Au nano-sekskant substrater i Design 3 19. Den røde linje viser en kontrol SERS spektrum af dopamin pulver. Venligst klik her for en større version af dette tal.
Discussion
SERS vinder en anerkendelse som en ekstremt kraftfuld teknik af bio-afsløring tilbyder mange unikke fordele. I forhold til molekylære vibrationer tillader selektivt at identificere "fingeraftryk" af specifikke analytter fra SERS spektre, mens den ekstremt høje følsomhed gør det muligt at detektere meget små mængder af analysanden 9,10,11,35. Endvidere SERS er en destruktiv teknik, er også relativt ufølsom over for vand, og derved er det meget velegnet til sondering af biologiske materialer i deres naturlige vandige miljø 9. Resultaterne præsenteret understrege disse fordele samt yderligere at demonstrere stort potentiale for SERS som en meget fleksibel etiket-fri teknik med bio-detektion. I tre designs beskæftiger monolag af forskellige substrat-immobiliserede biomolekyler, er blevet registreret, kan trygt tilskrives de særlige analytter Raman tilstande. At detektion af disse biomolekyler, or deres ligander, er blevet påvist at anvende plane overflader af kvartsglas som støtte til SERS substrater, gør de design, der er kompatible med de aktuelle elektronik og mikrostrømning indstillinger, lovende talrige anvendelser i forbindelse med nye bioelektronisk arkitekturer interfacing biologiske materialer med overflader af elektronisk og elektrokemiske indretninger 2,3. Vigtigere er det, i to af tre motiver SERS afsløring er påvist specifik binding af små molekyler, såsom glucose og dopamin, der anvender monolag af overfladen-immobiliserede protein og aptamer henholdsvis som genkendelseselementer.
Dog bør flere aspekter tages hånd om for at opnå en effektiv SERS bio-detektion i indstillingen "on-chip". Først og fremmest en velkendt udfordring, som er fælles for de fleste biomolekyler er deres tilbøjelighed til at nedbrydes, især når de udsættes for ikke-naturlige forhold såsom tør miljøet eller intens laserlys. I hele protokollen har vi understreget betydningen af altid at holde bio-funktionaliserede prøver nedsænket i passende løsninger under hele forsøget, fra forberedelse af prøverne til erhvervelse af Raman spektre. For sidstnævnte har en brugerdefineret vandtæt kammer konstrueret (figur 7) for at undgå fordampning af væsken under laser eksponeringer. Varigheden af eksponering og laser intensitet bør også begrænses som beskrevet i trin 5.3 i protokollen for at undgå skader af prøverne.
Resultaterne af SERS påvisning findes følsomme geometri af substratet anvendes, og især inter-feature separation af de metalliske nanostrukturer. Som det fremgår af figur 8 og 9, at SERS intensiteten af design 1 prøver afhænger meget af bredden af mellemrummene mellem Au nano-prikker på kvartsglas. Ud af tre rækker af Au nanodots testede jegn dette design (figur 8), er den højeste Raman intensitet opnås med Array I, som har de smalleste huller mellem AU funktioner, og derfor giver en mere effektiv elektromagnetisk ekstraudstyr felt. Som figur 9 viser, er styring af inter-feature separationer på niveau med 10-20 nm eller mindre påkrævet. Anvender EBL til fremstilling SERS substrater, som påvist her, giver en effektiv opløsning specielt til styring af bredder af inter-feature huller. Med en positiv tone EBL modstå såsom PMMA, kan størrelsen af huller i PMMA masker varieres ved blot at ændre de eksponeringsdoser. Efter lift-off resulterer dette i forskellige størrelser af jern- og metalvarer prikker, og bredden af mellemrum mellem prikkerne kan indstilles efter ønske ved at vælge ordentlig EBL eksponering doser 18.
Den anden udfordring er optimering af SERS substrat geometri til specifik bio-afsløring ansøgning. Selvom ekstraudstyr effekt increases med et fald på de inter-feature huller, den relativt store størrelse af biologiske molekyler pålægger begrænsninger på, hvor snævert de huller kan være. Dette er tydeligt ud fra resultaterne af Design 2, hvor immobilisering metode er sådan, at proteinet effektivt kun binder til overfladen mellem ædelmetal prikker, men ikke til de prikker selv (se figur 3B). Som det fremgår af figur 10, må det SERS spektre for ustrukturerede Ag pads ikke vise bands fra analysanden. Selvom puderne udviser en nano-krystallinsk struktur med meget tynde huller mellem øerne (se figur 6F) disse huller er for snævre til at rumme et protein molekyle. Endnu en anden dimension af kompleksitet tilsættes når protein-ligand-binding skal detekteres. I figur 10 SERS CH bånd er mere udtalt i spektrene fra ligand-bundne GBP end i ligand-fri én, som kan hypotetisk forklares ved en ændring i GBP konformationved binding af D-glucose 2 7,27, hvilket resulterer i en mere stiv struktur med forøget Raman aktivitet. Hvis man sammenligner de to nanostrukturerede substrater, CH band fra ligand-fri protein er stærkere i SERS spektre opnået med nano-prikker substrat, mens både protein og glukose CH bands fra ligand-bundet protein er mere udtalt med nano-sekskanter substrat. To faktorer forventes at føre til disse forskelle, tilgængeligheden af plads mellem Ag funktioner, hvor GBP kunne binde til Ni, og modtagelighed for ligand-bundne og ligand fri protein til den elektromagnetiske forbedring af Raman spredning i "hot spots" mellem disse funktioner. På den ene side, nano-prikker mønster giver en relativt større inter-feature, hvor Ni belægning er tilgængelig for proteinet til at binde, hvilket kan forklare en mere udtalt CH bånd observeret for glucose-free GBP på Ag nano-prikker substrat. På den anden side, på grund af deres ikke-ensartet strukturen (se figur 6D), kan Ag nano-sekskanter være tilbøjelige til at vise en stærkere elektromagnetisk forbedring i smalle mellemrum mellem Ag øer inden nano-sekskanter resulterer i stærkere CH vibrationer bands fra glucose-bundne GBP på nano-sekskanter substrat. Nogle detaljer om dette samspil kræver yderligere kontrol, og optimering af SERS substrater for komplekse analytter involverer store proteiner såsom GBP er stadig i støbeskeen.
Det er klart, er SERS detektion af ligandbinding ansætte immobiliserede biomolekyler som genkendelseselement lettere, når kun liganden er Raman aktiv i et udvalgt område, mens de øvrige komponenter ikke. Dette er tilfældet for Design 3, hvor udtalte SERS bånd af aptamer-bundne dopamin opnås (figur 11). Aptameren-dopamin par udviser fremragende specificitet og SERS spektrum omfatter markante bands uden nogen signifikant baggrund signal.
11,12,13, der giver mulighed for en bedre styring af metal nanostruktur størrelse og placering mod en pålidelig identifikation af optimal substrat design til en bred vifte af anvendelser. Skalerbarhed af disse teknikker kan derefter forbedres ved at kombinere EBL med komplementære nanolithography metoder såsom nanoaftryk litografi 19 mod fremtidig masseproduktion af nanoskala design optimerede ansætte de afstemmelige EBL teknikker.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 11-Mercaptoundecanoic acid (MUA) |  Sigma Aldrich |
450561 ALDRICH | Used for surface functionalization in Design 1 |
| Conductive polymer | Mitsubishi Rayon |
aquaSAVE-57xs | A 70 nm thick layer is used as anti-charging coating for EBL exposures |
| D-glucose | Collaborator Lab. | Ligand in Design 2 | |
| Dopamine | Collaborator Lab. | Ligand in Design 3 | |
| Dopamine binding aptamer (DBA) | Integrated DNA Technologies Inc. |
5'- /Thiol Modifier C6 S-S/ AAAAAAAAAA GTCTCTGTGT GCGCCAGAGA ACACTGGGGC AGATATGGGC CAGCACAGAA TGAGGCCC-3' | Biopolymer in Design 3 |
| Fused silica wafers | Mark Optics |
||
| Glucose binding protein (GBP) | Collaborator Lab. |
PDB ID 2HPH | Biopolymer in Design 2 |
| High vacuum grease | Dow Corning |
Used to seal water-proof chamber | |
| Hydrogen Peroxide 30%, H2O2 | J.T. Baker | Used for pirahna solution | |
| N-ethyl-N'-(3-(dimethylamino) propyl) carbodiimide (EDC) | Sigma Aldrich |
03450 FLUKA | Used for immobilization of biopolymer in Design 1 |
| N-Hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma Aldrich |
130672 ALDRICH | Used for immobilization of biopolymer in Design 1 |
| Potassium phosphate buffer | Collaborator Lab. | Buffer used in Raman sampling | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Collaborator Lab. | Solvent in Design 3 | |
| Polymethylmethacrylate (PMMA) 950 A2 | MicroChem |
A 90 nm thick layer is used as EBL positive tone resist | |
| Recombinant protein A | Protein Mods Inc |
PDB ID 1BDD | Biopolymer in Design 1 |
| Sulfuric acid 96%, H2SO4 | J.T. Baker | Used for pirahna solution | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (TRIS) and ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) buffer | Sigma Aldrich |
T9285 SIGMA | Buffer in Design 3
|
| |
|||
| Equipment | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dicing saw | Diamond Touch Technology Inc. (17301 W Colfax Ave # 152, Golden, CO) |
Used to cut FS wafer | |
| Electron beam evaporator | Kurt J. Lesker |
Used for Au and Ag evaporation | |
| Electron beam evaporator | Johnsen Ultravac (JUV) |
JuV E-gun | Used for Ni evaporation |
| Microscope cover slips (25 mm) | Fisher Scientific |
12-545-102 | Used in water-proof chamber |
| Microscope slides (3×1 in.) | Fisher Scientific |
Used in water-proof chamber | |
| Raith 150TWO EBL exposure system | Raith Inc. |
Raith 150TWO system | Used for EBL exposures |
| Raman microscope | Thermo Scientific |
Nicolet Almega XR | Used for Raman spectroscopy |
| Sonicator system | Branson |
Used for liftoff and solutions mixing | |
| Spinner | Brewer Spinner and Hotplate |
Cee 200X and Cee 1300X | Used to spin-coat PMMA and conductive polymer |
References
- Sapsford, K. E., Tyner, K. M., Dair, B. J., Deschamps, J. R., Medlintz, I. L. Analyzing Nanomaterial Bioconjugates: A Review of Current and Emerging Purification and Characterization Techniques. Anal. Chem. 83, 4453-4488 (2011).
- Walcarius, A., Minteer, S. hD., Wang, J., Yu, L., Merkoçi, A. Nanomaterials for Bio-Functionalized Electrodes: Recent Trends. J. Mater. Chem. B. 1, 4878-4908 (2013).
- Kim, J., et al. Applications, Techniques, and Microfluidic Interfacing for Nanoscale Biosensing. Microfluid. Nanofluid. 7, 149-167 (2009).
- Rassaei, L., Singh, P. S., Lemay, S. G. Lithography-Based Nanoelectrochemistry. Anal. Chem. 83, 3974-3980 (2011).
- Wong, L. S., Khan, F., Micklefield, J. Selective Covalent Protein Immobilization: Strategies and Applications. Chem. Rev. 109, 4025-4053 (2009).
- Ley, C., Holtmann, D., Mangold, K. -M., Schrader, J. Immobilization of Histidine-Tagged Proteins on Electrodes. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 88, 539-551 (2011).
- Kim, D., Herr, A. E. Protein Immobilization Techniques for Microfluidic Assays. Biomicrofluidics. 7, 041501 (2013).
- Anker, J. N., Hall, W. P., Lyandres, O., Shah, N. C., Xhao, J., Van Duyne, R. P. Biosensing with Plasmonic Nanosensors. Nature Materials. 7, 442-453 (2008).
- Bantz, K. C., et al. Recent Progress in SERS Biosensing. Phys.Chem. 13, 11551-11567 (2011).
- Sharma, B., Frontiera, R. R., Henry, A. -I., Ringe, E., Van Duyne, R. P. SERS: Materials, Applications, and the Future. Mater. Today. 15, 16-25 (2012).
- Kleinman, S. L., Frontiera, R. R., Henry, A. -I., Dieringer, J. A., Van Duyne, R. P. Creating, Characterizing, and Controlling Chemistry with SERS Hot Spots. Phys.Chem.Chem.Phys. 15, 21-36 (2013).
- Fan, M., Andrade, F. S., Brolo, A. G. A Review on the Fabrication of Substrates for Surface Enhanced Raman Spectroscopy and their Applications in Analytical Chemistry. Anal. Chim. Acta. 693, 7-25 (2011).
- Cao, Y., Li, D., Jiang, F., Yang, Y., Zh, H. Engineering Metal Nanostructure for SERS Application. J. Nanomater. 123812, 1-12 (2013).
- Glembocki, O., Rendell, R., Alexson, D., Prokes, S., Fu, A., Mastro, M. Dielectric-Substrate-Induced Surface-Enhanced Raman Scattering. Phys. Rev. B. 80, 085416 (2009).
- Merlen, A., et al. Surface Enhanced Spectroscopy with Gold Nanostructures on Silicon and Glass Substrates. Surf. Sci. 605, 1214-1218 (2011).
- Muhammad, M., Buswell, S. C., Dew, S. K., Stepanova, M. Nanopatterning of PMMA on Insulating Surfaces with Various Anticharging Schemes Using 30 keV Electron Beam Lithography. J. Vac. Sci. Technol. B. 29, 06F304 (2011).
- Peters, R., Fito, T., Gutierrez-Rivera, L., Dew, S. K., Stepanova, M. Study of Multilayer Systems in Electron Beam Lithography. J. Vac. Sci. Technol. B. 31, 06F407 (2013).
- Gutierrez-Rivera, L., Peters, R., Dew, S., Stepanova, M. Application of EBL Fabricated Nanostrucutred Substrates for SERS Detection of Protein A in Aqueous Solution. J. Vac. Sci. Technol.B. 31, (2013).
- Gutierrez-Rivera, L., Peters, R., Dew, S., Stepanova, M. Surface-Enhanced Raman Spectroscopy Detection of Protein-Ligand Binding Using D-glucose and Glucose Binding Protein on Nanostructured Plasmonic Substrates. , (2014).
- Peters, R. Fabrication and Testing of Surface-Enhanced Raman Spectroscopy Substrates for the Detection of Biomolecules [MSc Thesis]. , University of Alberta. (2014).
- Gouda, H., Torigoe, H., Saito, A., Sato, M., Arata, Y., Shimada, I. Three-Dmensional Solution Structure of the B Domain of Staphylococcal Protein A: Comparisons of the Solution and Crystal Structures. Biochemistry. 31, 9665-9672 (1992).
- Cuneo, M. J., Johnson, S. J., Beese, L. S., Hellinga, H. W. High Resolution Structure of E. Coli Glucose/Galactose Binding Protein Bound with Glucose. Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB) Protein Data Bank. , (2009).
- Humphrey, W., Dalke, A., Schulten, K. VMD - Visual Molecular Dynamics. J. Molec. Graphics. 14, 33-38 (1996).
- Walsh, R., DeRosa, M. C. Retention of Function in the DNA Homolog of the RNA Dopamine Aptamer. Biochem. Biophys. Res. Comm. 388, 732-735 (2009).
- Akitomi, J., Kato, S., Yoshida, Y., Horii, K., Furuich, M., Waga, I. ValFold: Program for the Aptamer Truncation Process. Biomed. Inf. 7, 38-40 (2011).
- Han, K., Lee, Y., Kim, W. PseudoViewer: Automatic Visualization of RNA Pseudoknots. Bioinformatics. 18, S321-S327 (2002).
- Dwyer, M. A., Hellinga, H. W. Periplasmic Binding Proteins: a Versatile Superfamily for Protein Engineering. Curr. Opin. Struct. Biol. 14, 495-504 (2004).
- Benson, D. E., Conrad, D. W. Design of Bioelectronic Interfaces by Exploiting Hinge-Bending Motions in Proteins. Science. 293, 1641-1644 (2001).
- Bozic, S., Chorzempa, J. Pirahna Cleaning. , University of Alberta. (2011).
- Mohammad, M. A. Raith 150TWO SOP. , University of Alberta. (2011).
- Schmidt, M. W., et al. General Atomic and Molecular Electronic Structure System. J. Comput. Chem. 14, 1347-1363 (1993).
- Bode, B. M., Gordon, M. S. MacMolPlt: a Graphical User Interface for GAMESS. J. of Mol. Graph. Mod. 16, 133-138 (1998).
- Bright, A., Devi, T. S. R., Gunasekaran, S. Spectroscopical Vibrational Band Assignment and Qualitative Analysis of Biomedical Compounds with Cardiovascular Activity. Int. J. Chem. Tech. Res. 2, 379-388 (2010).
- Bandekar, J. Amide Modes and Protein Conformation. Biochim. Biophys. Acta. 1120, 123-243 (1992).
- Barth, A., Zscherp, C. What Vibrations Tell About Proteins. Quarterly Reviews of Biophysics. 35, 369-340 (2002).
- Chrimes, A. F., Khoshmanesh, K. h, Stoddart, P. R. M. itchellA., Kalantar-Zadeh, K. Microfluidics and Raman Microscopy: Current Applications and Future Challenges. Chem. Soc. Rev. 42, 5880-5906 (2013).
- Park, S. -K., Lee, N. -S., Lee, S. -H. Vibrational Analysis of Dopamine Neutral Base based on Density Functional Force Field. Bull.-Korean Chem. Soc. 21, 959-968 (2000).
- Briand, E., Salmain, M., Compère, C., Pradier, C. M. Immobilization of Protein A on SAMs for the elaboration of immunosensors. Coll. Surf. B: Biointerfaces. 53, 215-224 (2006).
- Lakowicz, L. R., et al. Radiative decay engineering: 2. Effects of Silver Island Films on Fluorescence Intensity, Lifetimes, and Resonance Energy Transfer. Analytical biochemistry. 301, 261-277 (2002).
