Abstract
현장 복구에 (ISR)는 미국에서 우라늄 추출의 주된 방법이다. ISR 동안 우라늄 광석 본체로부터 침출 및 이온 교환을 통해 추출 하였다. 결과 생산 블리드 물 (PBW)은 비소 및 기타 중금속과 같은 오염 물질이 포함되어 있습니다. 활성 ISR 우라늄 PBW 시설에서의 시료는 구리 산화물 나노 입자 (NP에의 CuO-)으로 처리 하였다. 비소, 셀레늄, 우라늄, 바나듐을 포함 PBW 감소 우선 순위 오염 물질의 CuO를-NP 처리. 미처리의 CuO-NP는 PBW는 MTT (3- (4,5- 디메틸 티아 졸 -2- 일) -2,5- 디 페닐 테트라 졸륨 브로마이드)에 의해 결정 하였다 세포 성장과 생존 미디어 변화 액체 성분으로서 사용 하였다 처리 분석법 인간 배아 신장 (HEK 293)과 인간의 간세포 암 (간염의 G2) 세포에서. NP-CuO를 치료 및 개선 HEP HEK 세포 생존율과 연관이 있었다. 이 방법의 제한은 성장 미디어 구성 요소에 의해 osmol 동안 PBW의 희석을 포함품 질 조정뿐만 아니라 필요한 pH 조정. 이 방법은 희석에 의한 효과와 그러나 전통적 약산성이다 PBW의 pH 변화에 그 넓은 문맥으로 제한된다; 이 방법은 중립 해역에서의 CuO-NP 치료를 평가하는 폭 넓은 사용을 가질 수있다.
Introduction
약 US 전기 공급의 20 %가 에너지 자립을 높이기 위해 전국 인센티브에 부분적으로 기초하여 핵 에너지가 제공되고, US 원자력 용량이 1 증가 할 것으로 예상된다. 핵 에너지의 세계적인 성장은 미국이 외부에 발생하는 성장의 많은으로 계속 될 것으로 예상된다. 2013 년으로, 미국 우라늄의 83 %를 수입했지만, 준비금의 952,544 톤은 미국 3,4에 존재합니다. 2013 년 7 새로운 시설 응용 프로그램 및 와이오밍, 뉴 멕시코, 네브라스카 5 ~ 14 재시작 / 확장 응용 프로그램이 있었다. 미국에서는 우라늄은 주로 현장 복구 (ISR) (6) 처리에 통해 추출된다. ISR은 적은 토지 지장을하고 환경 오염 물질 (7)을 해제 할 수 있습니다 미행 더미를 만드는 방지 할 수 있습니다. ISR는 우라늄 통해 침출수로부터 추출 된 후 지하 광석 본체로부터 우라늄 침출 수계 산화제 용액을 사용하여이온 교환 과정 (8). 광석 본체 네거티브 물 균형을 유지하기 위해, 침출수의 일부라는 생산 물 (PBW)를 출혈 빠졌을. PBW의 일부가 역삼 투 (RO)과 사용 정화된다 마이닝 프로세스에 재 도입하지만 독성 오염물이 허용되는 표면 상태를 관리 기관에 의해 결정된 레벨로 감소 될 수 있다면 PBW 또한 유익한 산업용 또는 농업 용도를 가질 수있다 지하수 9. 현재, 대부분의 ISR 우라늄 시설 PBW에서 오염 물질을 제거하는 RO를 사용합니다. 그러나, RO 처리는 에너지 집약적이며, 규제 처분을 필요로 유독성 폐기물에 소금물을 생산하고 있습니다.
많은 물 제염 방법은 흡착제, 막, 및 이온 교환을 포함하여 존재한다. 이들 중, 흡착 가장 흔히 사용되며, 합성 된 나노 입자의 최근 발전은 흡착 계 물 제염의 기능 (10)을 처리를 개선하고있다. 구리 OXI이전 광범위 우라늄 ISR PBW에 조사되지 않았던 데 나노 입자 (CuO를-NP에), 지하수의 오염 물질 제거에 대한 최근 연구에서의 CuO-된 NP는 전후 수처리 단계를 필요로하지 않는 포함한 독특한 특성을, (이 밝혀졌다 예를 들어, pH와 산화 환원 전위)을 조정하고 다른 pH 값, 염분 농도, 또는 경쟁 이온) (11), 예 (다른 물 조성물에 실적. 또한, CuO를-NP에 쉽게 재생의 CuO-NP에 재사용 할 수있는 후 수산화 나트륨 (NaOH)으로 침출에 의해 재생된다. 자연수에서의 CuO-NP 미량 금속 필터링 기능의 세부 사항은 이전에 11 ~ 14을 발표했다.
수처리에 유용하지만, 금속 산화물 나노 입자는 살아있는 유기체에 독성이있을 수 있지만, 독성의 정도는 나노 입자의 특성과 성분 10,15,16에 부분적으로 의존한다. 따라서 simult을 연구하는 것이 중요하다필드 애플리케이션 전에 aneous 오염 물질 제거 및 나노 입자 독성. 현재의 연구는 (비소, 셀레늄, 바나듐 및 우라늄 포함) PBW 우선 오염물을 제거의 CuO-NP에의 능력을 결정하고, 세포 독성에 PBW의 CuO-NP 치료의 효과를 평가 하였다.
PBW 활성 ISR 우라늄 시설에서 수거하고, 우선 순위에 오염물 제거의 CuO-NP 치료의 효능을 결정하기 위해 이용 하였다. 의 CuO-NP 치료 전후 PBW 세포 독성도 평가 하였다. PBW는 환경 관련 혼합물을 포함하는 혼합물의 독성 연구에 중점을 배치하는 유해 물질 및 질병 레지스트리 (ASTDR)에 대한 복잡한 지질 학적 (환경 / 산업) 혼합물 모두 환경 보건 과학 (NIEHS)의 국립 연구소 및 기관입니다 그들이 자연 또는 산업 환경뿐만 아니라 시험 관내 시험에서 촉진 존재하는 추가 생체 내 실험을위한 화학 물질의 우선 순위17-19. 저용량 혼합물 만성 노출은 적어도 대부분의 실험 연구의 짧은 기간 내에 명백한 효과를 생산하지 만성 때문에, 저용량 혼합물 노광들의 연구에 도전한다. 유사하게, 화학 혼합물의 시험 관내 연구에서 대부분은 2 이상의 금속 (20, 21)의 정의 연구소에서 만든 혼합물에 셀을 노출. 이러한 연구는 기준 정보를 제공하지만, 단순화 된 혼합물은 혼합물의 성분들의 전체 범위가 존재하는 고유의 환경 샘플에서 발생할 수있는 복잡한 길항제와 상승 작용을 복제하지 않는다.
본 연구의 목표는 PBW에 대한 대체 오염물 제거 공정을 검사 및 배양 된 세포를 사용하여 세포 독성에 PBW (CuO를-NP)의 치료 효과를 평가했다. 결과는 오염 제거를 위해보다 효율적으로 또는 환경 친화적 인 방법의 개발을 통해 우라늄 산업 유익 할 수있다. 이 연구는 제공첫 번째 증거의 CuO-NPS에서 PBW의 우선 순위 오염 물질의 감소는 포유 동물 세포 (22)에 세포 독성을 줄일 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
모든 샘플은 와이오밍 우라늄 ISR 시설의 우라늄 액체 처리 건물에서 수집 하였다.
1. 생산 블리드 물 (PBW)
- ISR 우라늄 시설에서 물 샘플의 두 가지 유형의 수집 : PBW과 삼투압 (RO) 물을 역. 이온 교환 처리 후 모니터링 탭에서하지만 역삼 투 오염 제거하기 전에 PBW를 수집합니다. PBW가 역삼 투 처리에 의해 오염 제거 후 소유주 샘플을 수집합니다.
주 : Lixiviant는이 칼럼에서 수거하고, 이온 교환을 위해 준비된다 우라늄 액체 처리 건물, 여러 분야에서 잘 파이프 라인으로 반송된다. 약 이온 교환 후 lixiviant 1-3 %가 회로에서 제거 되나 생산 블리드 물 (PBW)입니다. PBW 마이닝 프로세스에서 재사용 또는 RO 여과하여 탈회 / 오염 제거된다. - 제로 헤드 공간이있어서 물과 고밀도 폴리에틸렌의 샘플 (HDPE) 병을 수집샘플 수집 및 환경 품질의 와이오밍 부 (WYDEQ) (23)의 분석을위한 표준 운영 절차에.
- 멋진을 유지하기 위해 현장 얼음 및 전송 샘플 온도와 산도를 측정한다.
- 4 ℃에서 저장 PBW. 다음과 같은 프로토콜의 지침에 따라 미디어 제조시 첨가되는 농축 이글의 최소 필수 매체 (EMEM-10 배)이 끝날 때까지 멋진 PBW 솔루션을 유지합니다.
참고 : PBW 동결 할 수 또는 실온으로 가온하면 침전 것이다 산화 솔루션입니다. 희석 한 후 PBW 솔루션은 충분히있다가 세포 배양시 적용하기 전에 온수에 37 ℃를 침전되지 않습니다 희석.
의 CuO 나노 입자 2. 준비 (CuO를-NP에)
- (P의 CuCl를 2 • 2H 2 O, 0.4 M 수산화 나트륨 (NaOH) 및 5g의 폴리에틸렌 글리콜 250 ㎖의 0.2 M의 250 mL를 함유하는 순수 에탄올 용액 수확기육mm 붕규산 유리 공 둥근 바닥 플라스크에 EG).
- 변성 전자 레인지 용액을 배치하고 20 % 전력 (6 초 간격, 24 초 OFF)에서 10 분 동안 주변 공기 압력으로 환류하에 반응 할 수있다.
- 유리 볼을 이탈 한 후 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 기울여 상온 (20 ° C) 용액에 쿨.
- 원심 분리기 경사 30 분, 1,000 XG에 50 ML 원뿔 튜브에서 솔루션, 다음은 300 ml의 뜨거운 물 (60 ~ 65 ° C의), 100 ml의 에탄올의 순서로의 CuO-NPS를 세척하고, 100 mL의 아세톤.
- 50 ML 원뿔 튜브의 상온 (20 ℃에서)에의 CuO-NPS를 건조.
- 박격포로 자신의 튜브에서의 CuO-NPS를 쳤어요. 주석 호일의 CuO-NPS를 덮고 남은 액체를 제거하기 위해 오븐에서 110 ° C까지의 CuO-NPS를 가열한다. 하나의 배치로의 CuO-NPS를 결합하고의 CuO-NPS를 단다.
참고 : CuO를-NP에와 PBW의의 CuO-NP 처리의 제조는 물 Qual의에서 수행되었다생태계 과학 및 관리, 와이오밍 대학의 성만 연구소. 의 CuO-순이익은 합성 마틴과 레디 (2009 년) (11)의 절차를 따랐다.
의 CuO-NP에와 PBW 3. 치료
- PBW 50 ㎖에 이어 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 50 mg의 CuO를-NP (1 ㎎ / ㎖)을 추가한다. 튜브를 밀봉하고 250 rpm에서 벤치 정상 궤도 진탕 기에서 30 분간 반응시켰다.
- 샘플을 원심 분리기 튜브에서 30 분 동안 250 XG에 다음 0.45 μm의 주사기 필터를 사용하여 상청액을 필터. 원심 분리 속도를 변화시키고 시간의 CuO-NPS에서 원심 분리 튜브에 콤팩트하게되도록하여 나노 입자에 의존 할 수있다.
4. 원소 분석
- 다음과 같이 원소 분석에 대한 처리되지 않은 (제어)과의 CuO-NP 처리 된 PBW 샘플을 준비합니다.
- 2.0의 pH로 트레이스 금속 등급 질산과의 CuO-NP 처리 및 미처리 PBW의 분취 량 (40 ml)로 산성화. 유도 COUPL에 의해 양이온 산성화 된 PBW 씩 분석ED 플라즈마 - 질량 레디와 로스 (2012) (13)에 설명 된대로 분광법 (ICP-MS).
- 의 CuO-NP-처리 및 치료 PBW의 unacidified 분취 (20 ㎖)를 준비하고 레디와 로스 (2012) 13에 기술 된 바와 같이 이온 크로마토 그래피 (IC)에 의해 음이온의 unacidified 분취 량을 분석 할 수 있습니다.
참고 : 분취 량은 농업 및 분석 서비스의 와이오밍 부, 라라 미 와이오밍 82070. IC와 ICPMS 절차에 대한 설명은 레디와 로스 (2012) (13)에서 찾을 수 있습니다에 의해 분석 하였다.
PBW를 사용하여 세포 배양 미디어 5. 준비
- 두 제어 (EMEM-1X 및 RO + 미디어)과 팔 PBW 테스트 미디어 솔루션 가능성 연구에서 (각 치료 PBW과의 CuO-NP 처리 된 미디어의 네 농도)를 사용합니다. 다음과 같이 솔루션의 개요는 다음과 같습니다
- EMEM-1X 제어를 위해, L- 글루타민 및 중탄산 나트륨이 이미 추가로 이글의 최소 필수 매체 (EMEM-1X)를 구입. (FBS를 소 태아 혈청을 추가) 및 제조업체의 지침에 따라 항생제.
주 : EMEM-1X는 세포 성장 및 L- 글루타민 및 중탄산 나트륨을 함유위한 적절한 농도로 희석 구입. EMEM-1X는 소 태아 혈청 (FBS) 및 페니실린 및 스트렙토 마이신 (50 IU / ㎖ 페니실린, 50 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신)의 항생제 혼합물의 첨가를 필요로한다. 이 본 연구에 사용 된 두 종류의 세포에 대한 제조자의 권장 성장 배지이므로 EMEM-1X는 제어 매체로서 사용된다. 고농도 EMEM-10 배는 시험 용액을 제조 시설 또는 또는 미처리의 CuO-NP 처리 PBW에서 RO로 희석된다. 10 배 농축 된 EMEM-그래서 이들 소 태아 혈청 (FBS) 및 페니실린 및 스트렙토 마이신 항생제 믹스 이외에 추가 L 글루타민 또는 중탄산 나트륨을 함유하지 않는 경우 구입. - RO 제어 솔루션의 ISR 시설에서 수집 소유주 물을 사용합니다. PBW 테스트 미디어는 소유주 와트 100 % 대체와 같은 프로토콜을 사용하여PBW 대신에 ISR 시설에서 어. 실험실에서 치료와의 CuO-NP-처리 액을 사용 소유주 또는 초순수 물을 희석합니다.
- 세포 배양 배지의 성분과 혼합하기 전에 4 개의 테스트 농도로 희석 미처리 PBW. 다음의 조합 (실험실에서) RO와 미처리 PBW 혼합하여 미처리 PBW 솔루션의 네 개의 다른 농도를 준비한다 : 100 % (순수 PBW +없는 RO 물), 75 % (PBW + 62.5 ml의 RO 물 187.5 ㎖) 50 % 또는 25 % (PBW RO 물 + 187.5 mL로 62.5 ㎖) (PBW RO + 물 125 ㎖를 125 ㎖).
- 희석하여 세포 배양 배지의 성분과 혼합하기 전에 4 개의 테스트 농도에 PBW를 CuO를-NP는 처리. PBW를 혼합의 CuO-NP 처리 PBW 솔루션의 네 가지 상이한 농도를 준비 아래 조합 (1 mg의 사전 처리 된 / ㎖의 CuO-NP 30 분) (실험실에서) RO와 : 100 % (순수 CuO- NP 처리 된 PBW + NO RO 물), 75 % (CuO를-NP 처리 된 PBW + 62.5 ㎖의 RO 물 187.5 ㎖), 50 % (125ml의 소유주 물 PBW + 125 ㎖) 또는 25 % (CuO를-NP 처리 된 PBW RO 물 + 187.5 ㎖)의 62.5 mL로의 CuO-순이익은 처리.
- EMEM-1X 제어를 위해, L- 글루타민 및 중탄산 나트륨이 이미 추가로 이글의 최소 필수 매체 (EMEM-1X)를 구입. (FBS를 소 태아 혈청을 추가) 및 제조업체의 지침에 따라 항생제.
- 100 % RO 190 ml의 100 %, 75 %, 50 %로 농축 EMEM-10 배의 25 ㎖를 첨가하여 RO + 미디어 미처리 PBW + 미디어와의 CuO-NP 처리 PBW + 미디어 농도 250㎖를 준비 단계 6.1.3과 6.1.4에서 만든 들어 찬 치료 또는 CuO를-NP 처리 된 PBW 농도의 25 %.
- 수산화 나트륨 또는 염산 7.4 각 용액의 pH를 조정합니다.
- 25 ㎖ (10 %) 소 태아 혈청 (FBS), 2.5 mL의 L- 글루타민, 0.55 g의 NaHCO3를 1.25 mL의 펜 각각 미처리의 CuO-NP 처리 PBW의 농도뿐만 아니라, RO + 미디어 다음의 표준 요소와 보충 / 연쇄상 구균 (50 IU / ml의 페니실린 및 / ml의 스트렙토 마이신 50 μg의).
- 치료 PBW + 미디어의 각 농도의 삼투압을 조절, RO 물을 추가하고 측정 삼투압을 이용하여 290-310 mOSM / ㎏에 PBW + 미디어와 RO + 미디어의 CuO-순이익은 처리.
- 사용하여 각 솔루션을 필터4 ℃에서 0.22 ㎛의 진공 필터 유닛, 및 저장.
주 : 미처리 PBW + 미디어 농도 56 %, 44 %로, 29 % 및 16.5 %, CuO 등-NP-와 5 %의 범위 내의 최종 미디어 농도가 달라, 삼투압을 조절하기 위해 사용 RO 물의 양에 약간의 차이로 인해 53 %, 45 %, 30 % 및 17 %에서 + PBW 미디어 농도를 처리 하였다.
6. 세포 생존
참고 : 신장과 간 중금속 독성의 표적 기관임을 감안할는 배양 된 인간 배아 신장 (HEK293) 세포 (HEK)과 인간의 간세포 암 (인 HepG2) 세포 (HEP) 시험 방법 24 ~ 26를 사용합니다.
- 2-3일 제조업체의 지침에 따라 실험에 사용 된 96 웰 플레이트 도금 전에 HEK 및 HEP 세포의 문화를 준비합니다.
- 3- [4,5- 디메틸 티아 졸 -2- 일] -2,5- 디 페닐 테트라 졸륨 브로마이드 (MTT) 분석을 이용하여 세포 생존율을 측정한다.
참고 : MTT 분석 프로토콜을 미는에서 수정rloo 외. (2011) 27.- 분말 형태로 MTT를 얻습니다. 50 ㎎ / ㎖의 재고 농도를 만들기 위해 인산염 완충 식염수 (PBS)를 추가합니다. 2 시간 동안 교반하여 용액을 1.5 ml의 후 안전한 냉동고 튜브에 0.45 ㎛의 주사기 필터로 필터링 및 분취. 4 ° C에서 빛과 가게에서 튜브를 보호합니다.
- 5 분 1,000 XG에서 트립신, 원심 분리기를 사용하여 배양 접시에서 HEK 및 HEP 세포를 제거하고 트립신을 가만히 따르다. PBS 5 mL를 첨가하고 용액을 단일 세포를 얻기 위해 세포를 섞는다. 이어서, 용액의 밀리리터 당 세포 수를 얻었다 혈구에 단일 세포 용액 20 μL를 적용. 5 분 동안 1,000 XG에 다시 세포를 원심 분리기와 PBS가 세포를 헹구어 사용 가만히 따르다. 500 세포로 세포의 농도를 조정하는 EMEM-1X의 적당량을 추가 / 100 μL (100 μL / 웰).
- 증발 제어하기 위해 200 μL PBS로 판의 경계 우물을 입력합니다.
- 종자 세포500 세포의 밀도에서의 잘 (세포 도금되지 않음) 둘레 웰을 제외한 각각의 웰에 100 μL를 추가 /.
주 : HEK 및 HEP 세포 파종 밀도는 성장의 피크가 4-5 일 주위 발생할 수 있도록 실험 성장 곡선에 기초한다. 모든 세포주는 파종 밀도를 추정하기 위해 성장 곡선을 준비한다. - 그들 세포 밀도의 기준 MTT 판독을 수행하기 전에 (판 형태 꽉 유착)를 복구 할 수 있도록 37 ℃에서 24 시간 동안 세포를 품어.
- (경계 포함하지 않음) 첫 번째 열에서 시딩 배지를 제거하고, 1 시간 동안 웰에 MTT 100 ㎕ (배지에서 5 ㎎ / ㎖)을 첨가하여 세포 밀도의 MTT 기준선 판독을 수행한다.
- 1 시간 후, MTT를 분리하고 생존 세포 (20 분)에 의해 생산 된 MTT-포르 마잔을 용해 디메틸 설폭 사이드 (DMSO) 100 ㎕를 추가한다.
- 베이스를 얻었다 570 nm 인 흡수 파장에서 첫 번째 열의 광학 밀도 (OD)를 읽라인 읽기.
- 모든 플레이트가 제대로 시드와 세포가 판 사이 지속적으로 성장하고 있음을했다 확인하기 위해 기본 측정 값을 사용합니다. 열에서 DMSO를 제거 다음 24 시간 동안 배양하기 전에 테스트되고.
주 : DMSO가 플레이트에 밤새 방치하면 그것은 매체 볼륨의 감소를 일으키는 인접 열로부터 수분을 당긴다.
- 모든 플레이트가 제대로 시드와 세포가 판 사이 지속적으로 성장하고 있음을했다 확인하기 위해 기본 측정 값을 사용합니다. 열에서 DMSO를 제거 다음 24 시간 동안 배양하기 전에 테스트되고.
- 테스트 솔루션을 따뜻하게 (즉, EMEM-1X, RO, 치료 PBW과의 CuO-NP 처리 된 PBW 미디어 솔루션) 수욕에서 37 ° C까지.
- 및 EMEM-1X, RO + 미디어, 치료 PBW + 미디어 농도 또는 CuO를-순이익 100 ㎕로 대체 (경계 또는베이스 라인 읽기에 사용 된 첫 번째 열 제외) 판의 나머지 부분에서 시드 용지를 제거 처리 된 PBW + 미디어 농도 (접시 당 하나의 솔루션). 칠일 (일 2-8)의 총 자신의 시험 농도 또는 제어 솔루션에서 세포를 품어.
참고 : 총이 10 판 : 1 EMEM-1X, 1 RO + 미디어, 각각의 치료 PBW + 미디어 농도의 1 (56 %, 44 %, 29 % 및 16.5 %)과 각각의 CuO-NP 처리 된 PBW + 미디어 농도의 한 판 (53 %, 45 % 셀 라인 당 실험 당 30 % 및 17 %). - 기준 MTT 읽기 다음 매일은, 각각의 플레이트의 다음 열에서 (6.11 아래에 노트에 나열된) 제어 및 테스트 솔루션을 제거합니다 (예 : 2 일 테스트 및 제어 미디어, 우물 BG 행 3에서 제거되고, 주 3 : 행 4 웰 BG 등) 및 상기 단계 6.7-6.9에 기재된 MTT 프로토콜을 반복한다.
- 칠일의 프로토콜 매일 반복합니다. 각 행 (6 웰)에 대한 OD 결과를 평균 칠일 성장 곡선을 생성하기 위해 시간에 대하여보고 하였다.
- 세포 생존 능력에 구리 킬레이트의 효과를 평가하기 PBW를 CuO를-NP를 처리 + 각 플레이트 용액을 첨가하기 전에 테스트 솔루션을 제어하는 D 페니 100 μM을 추가 및 제외 매체는, 상기와 동일한 절차를 따른다. 데이터 항문을 수행이 Analysis 과학 그래프 소프트웨어를 사용하여.
7. 지구 화학적 모델링
- 다음 웹 사이트에서 비주얼 MINTEQ 버전 3.0 / 3.1 프리웨어 다운로드 http://www2.lwr.kth.se/English/Oursoftware/vminteq/ .
참고 : 시각 MINTEQ 금속 분화, 용해도 평형, 자연수에 대한 흡착 등의 계산을위한 프리웨어 화학 평형 모델이다. 또한 그것은 이온 분화, 이온 활동, 이온 착체 및 소자 분리 (28)의 가능한 메커니즘을 조사하는 처리 (질량 분석 결과) 전후 원소의 농도와 비교된다 포화 인덱스를 예측하는데 사용된다. - 프로그램 및 입력 산도, 알칼리도 및 프로그램에 다른 원소의 농도를 포함한 4 단계에서 질량 분석 데이터를 연다.
참고 : 지하수가 현장 urani에있는 동안 산화되는 것을 감안할 때UM 추출 처리는, 입력 비소, 바나듐, 및 우라늄의 산화 종을 사용한다.
8. 억제 농도 50 (IC 50)
- 처음 세 개의 별도의 실행의 5 일에 생존 (외경 평균) 평균하여 치료와의 CuO-NP 처리 된 PBW + 미디어 농도의 IC (50)을 계산합니다.
- EMEM-1X의 5 일째 생존 평균의 치료와의 CuO-NP 처리 된 PBW + 미디어 농도 빼기 5 일째 생존의 평균은 생존 능력의 차이를 계산합니다. 그런 다음 EMEM에서 5 일의 평균 생존 능력에 의해 생존의 차이를 분할, 그리고 %의 억제를 얻을 수 (100)에 의해 곱합니다.
- 각각의 치료와의 CuO-NP 처리 된 PBW + 미디어 농도 %의 생존 능력을 얻기 위해 100 (EMEM-1X 생존)에서 %의 억제를 뺍니다.
- 하나의 농도와 100 %의 생존 능력에 EMEM-1X을 설정하여 과학적 그래프 소프트웨어에 입력; 로그에 모든 농도 변환규모 (X = 로그 (X)) 및 최소 자승법 분석과 비선형 회귀 분석을 수행합니다.
9. 데이터 분석
- 두 개의 꼬리, 쌍, 학생 T-test로 치료와의 CuO-NP 처리 된 PBW의 요소 농도를 비교.
- 칠일 동안 수집 성장 곡선 데이터를 이용하여 곡선 (AUC) 아래의 면적을 계산하고 분산의 반복 측정 분석 (ANOVA)과 분산을 분석하고, 모든 그룹 간의 Tukey에의 사후 비교 하였다 (N = 3).
- . 미처리의 CuO-NP 처리 + PBW (전술) 미디어 솔루션 모두 성장 곡선의 5 일째의 데이터를 사용하여 IC (50)를 계산 0.05 중요한 고려 <P의 값.
주 : 통계 분석의 목적을 위해, 반 검출 한계 질량 분광법 값이 29 이하로 제한 이온 농도 레벨에 할당 하였다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
치료와의 CuO-NP 처리 된 PBW에 PBW 구성 요소의 농도와 pH를 표 1에보고됩니다. 마틴과 레디 (2009)의 CuO-NP의 영전 점은 9.4 ± 0.4로 추정되는 것을보고했다. 이러한 조건에서, PBW의 pH가 7.2-7.4임을 감안할 때, 물은 나노 입자 표면이 양으로 음전하 종의 흡착을 가능하게 청구되어 일으키는의 CuO-NP에 양성자를 기부. 비소, 셀레늄, 우라늄 및 바나듐 (표 1)을 포함 PBW에서의 CuO-NP 처리 제거 우선 순위 오염 물질. 평균 비소 농도는 [0.002 ㎎ / ℓ (양측 쌍 t-test를, P <0.0001)에 0.0175에서 87 % 감소했다. CuO가-NP의 처리도 상당히 감소 셀레늄 (30 %), 우라늄 (78 %), 바나듐 (92 %) 및 인산 (85 %) (p <0.05).
분화 산정 결과, 표 2에보고 된 분석 결과를 지원 중 99 %서 4 2-로 존재하고 PBW의 총 용존 셀레늄의 94 % - PBW에 탈 용존 비소는 HAsO 4 2와 H 2 아소 4로 존재한다. 이 종은 음의 CuO-NP에에 흡착 때문에 할 수있는, 청구됩니다. 분화 모델링은 PBW에서 바나듐 종의 99 %가 부정적으로도의 CuO-NP에에 흡착을 촉진 청구됩니다 것으로 전망했다. 그러나 분화 모델링의 CuO-NP에에 흡착을 제한 할 종은 음으로 대전 된 우라늄의 35.5 %를 예측했다. 포화 지수의 분석은 비소, 셀레늄, 우라늄 또는 바나듐 함유 광물의 어떤 종은 포화 근처 (즉, 광물의 침전) 수준의 CuO-NP에에 지원 흡착, 대 침전 없었다 것으로 전망했다.
우선 오염 물질의 예상 농도는 치료와의 CuO-NP 처리 된 PBW, 희석 제어 미디어의 샘플 (EMEM-1X), 56 %에서 만든 미디어에있는 경우 평가하기치료 PBW + 미디어와 53 %의 CuO-NP 처리 된 PBW + 미디어는 ICP-MS로 분석 하였다. 원액 제어 매체 (EMEM-1X)를 L- 글루타민 및 중탄산 나트륨으로 공급되는 상용 제품 (프리가 부가). 제어 EMEM-1X 구리 셀레늄 농도는 약간들은 세포의 성장에 필수적이기 때문에 예상대로 증가하지만, 비소, 우라늄 및 바나듐은 표 3에보고 된, 무시할 수 있었다 하였다. 예비 연구는, 비소, 셀레늄 및 바나듐 농도가 감소 된 것으로 나타났다 의 CuO-NP 처리하고 그 감소가의 CuO-NP 처리 된 PBW + 미디어의 농도로 표현되었다. 의 CuO-NP 처리 된 PBW + 미디어에서 우라늄의 측정 농도는 치료 PBW에 비해 감소하고,이 감소 비주얼 MINTEC의 3 절 모델링에 의해 예측보다 더 뚜렷했다. 예상대로 구리 수준의 CuO-NP 처리 된 미디어에 상승했다.
포유 동물에서 세포 독성 PBW를 개선하기의 CuO-NP 처리 능력을 확인하려면세포 생존력 전에 + PBW 미디어 솔루션에 노출 셀과의 CuO-NP 처리 후에 평가 하였다. 두 HEK (그림 1A) 및 HEP (그림 1B) 세포는 최대 7 일 동안 치료 또는 치료 PBW + 미디어의 다른 농도에 노출되었다. NP-CuO를 치료 양쪽 세포주에서 세포의 생존 능력을 향상하는 반면 미처리 PBW + 배지에서 자란 세포 생존 능력은, 농도 의존적으로 손상시켰다. 그림 1C의 통합 AUC는 성장 HEK 세포 PBW을의 CuO-순이익은 처리 + 미디어가 치료 PBW + 미디어 세 가지 가장 높은 농도 (29 %, 44 %, 56 %)에 비해 더 실용적이라고 보여줍니다. 치료 PBW + 미디어 (44 %, 56 %)의 두 가장 높은 농도의 CuO-NP 처리 된 PBW + 미디어 (그림 1D)에 비해 손상 가능성을 보여 주었다 : HEP 세포는 약간 다른 가능성을 보여 주었다. PBW의 더 묽은 농도 HEP 세포 독성이 덜했고, 세포 생존율이 적은 처리에 의해 영향.16.5 % 치료 PBW + 미디어에서 재배 모두 HEK 및 HEP 세포의 생존율은 53 %의 CuO-NP 처리 된 PBW + 미디어 (P <0.05)에서 자란 세포에서 유의 한 차이가 있었다. 따라서,의 CuO-NP 처리 제어 수준에 가까운 가능성과, PBW의 세포 독성을 개선 나타났다. 상술 한 바와 같이, PBW의 CuO-NP의 처리 구리 농도의 증가와 연관된다. 증가는 레디와 로스 (2012)에 의해 이전의 결과에 기초하여, 예상, 여기서 이들은 지하수로부터 비소를 제거의 CuO-NPS를 사용했다. 구리의 증가는 PBW의 특정 화학 물에 의존하지만, 1.3 ㎎ / ℓ의 EPA MCL 밑돌았다. 그러나, 구리 농도의 증가가 향상된 생존에 기여 것을 배제하는 것이 중요하다고 (예, 또는 그 대신에 우선 오염물의 감소의 이외에). 따라서, 구리 킬레이트 D 페니는 EMEM-1X 제어, RO + 미디어 제어, 및 미처리의 CuO-NP 처리 + PBW 미디어 솔루션 및 제 가하고전술 한 바와 같이 실내 MTT 생존력 성장 곡선을 생성 하였다. 구리 킬레이트는 중요하지 않았다 RO + 미디어 제어, 치료 및 CuO를-NP 처리 된 PBW + 미디어에서 배양 된 HEK 또는 HEP 세포 중 하나의 생존에 영향을 미치는 (결과는 도시하지 않음).
반 최대한 억제 농도 (IC 50) HEK의 하루 다섯 성장과 치료 PBW + 미디어 (표 4A)과의 CuO-NP 처리 된 PBW + 미디어 (표 4B)에서 재배 형 간염 세포로부터 계산 하였다. 미처리 PBW + 배지에서 성장한 HEK 세포를 들어, IC 50 값은 1.264 (PBW 로그 %)이었다. 따라서, 미처리 + PBW 매체는 생존율이 50 % 감소를 가져 18.38 %로 희석되어야 할 것이다. NP-CuO를 처리 + PBW 매체에서 성장 HEK 세포를 들어, IC 50 값은 2.744 (% PBW 로그)이었다. 이 결과는 이론적으로 용액의 세포 독성이 + PBW 미디어 유사한 50 %를 생산하는 데 (%의 PBW = 2.744 로그) 500% 의해 농축 될 필요가 치료 범위로 감소되었음을 시사생존에 주름. 미처리 PBW + 배지에서 성장 HEP 전지, IC 50 (%의 PBW 로그) 1.243이었다. 이것은 생존율이 50 % 감소를 생성하기 위하여 17.5 %로 + PBW 미디어 희석을 필요로한다. 대조적으로, NP-CuO를 처리 + PBW 매체에서 성장 HEP 전지용, IC 50 (%의 PBW 로그) 5.327이었다. 의 CuO-NP 처리 된 PBW + 미디어에서 세포의 생존 능력이 EMEM-1X (제어)에서 자란 세포에서 유의 한 차이가 있었기 때문에이 값은 가능성이 매우 크다. 5 일째에 모두 HEK 및 HEP 세포 성장, 그림 2 명 시야 이미징,. 의 CuO-NP 처리 된 PBW + 미디어 (그림 2E, F)의 세포 수 및 첨부 치료 PBW + 미디어 (그림 2C, D)에 비해 호전되었다.
그림 1 : 성장 곡선. 성장 곡선은 생존 및 g을 평가하기 위해 사용되었다치료 동안 배양 rowth. HEK (A) 및 HEP 성장 곡선 (B) 세포는 53 %의 CuO-NP + PBW 처리 매체 (상부 패널)에 비해 + PBW 미디어 네 희석 재배. EMEM-1X 제어 (EMEM) 
, RO 
, 53 %는 CuO를-순이익 처리 
, 16.5 % 치료 PBW 
, 29 % 치료 PBW 
, 44 % 치료 PBW 
, 56 % 치료 PBW 
. HEK (C) 및 HEP (D) 7 일간 성장 곡선 데이터 (하부 패널)의 곡선 (AUC) 아래의 면적 분석. * p <0.05 RO 제어에 비해 EMEM 제어 #p를 <0.05 비교 §p <0.05 53 %의 CuO NP 처리 PBW 매체에 비해. (양측 분산 분석과를 사용하여 비교Tukey에의 사후 분석, N = 3)
그림 2 :. EMEM-1X 제어 (EMEM) (A, B : 이전과의 CuO-NP 처리 후 세포 형태 밝은 필드 현미경 HEK (왼쪽 열) 및 HEP (오른쪽 열) 5 일에서 세포의 (20X)은 성장 ), 56 % 미처리 + PBW 매체 (C, D)와 53 %의 CuO-NP 처리 + PBW 미디어 (E, F)의 세포 형태를 조사 하였다. EMEM-1X 제어 (EMEM)에서 재배 된 HEK 및 HEP 세포 (A, B) 건강에 가까운 합류 성장을 보여줍니다. 치료 PBW + 미디어에서 재배 된 HEK 및 HEP 세포 수를 감소하고 (C, D) 분리 나타납니다. 의 CuO-NP 처리 된 PBW + 미디어에서 재배 된 HEK 및 HEP 세포는 더 첨부하고 건강한, 더 합류 세포 (E 표시 F).
| 요소 (㎎ / ℓ) | 평균, 세인트 데브. 및 의의 | ||
| 치료 전 | 치료 후 | ||
| 비소 | 0.018 ± 0.001 | 0.002 ± 0.0 | *** |
| 셀렌 | 1.8 ± 0.07 | 1.3 ± 0.05 | ** |
| 구리 | 0.0015 ± 0.001 | 0.93 ± 0.43 | * |
| 칼슘 | 102 ± 82 | 106 ± 15 | |
| 스트론튬 | 3.3 ± 1.1 | 1.5 ± 0.4 | * |
| 마그네슘 | 44 ± 2.1 | 47 ± 1.7 | |
| 나트륨 | 610 ±; 0.0 | 627 ± 27 | |
| 우라늄 | 0.98 ± 0.03 | 0.21 ± 0.03 | *** |
| 바륨 | 0.037 ± 0.02 | 0.019 ± 0.01 | |
| 칼륨 | 12 ± 0.0 | 12 ± 0.8 | |
| 규소 | 12 ± 0.7 | 12 ± 0.5 | |
| 바나듐 | 1.3 ± 0.07 | 0.1 ± 0.02 | *** |
| 인산염 | 0.35 ± 0.07 | 0.05 ± 0.0 | *** |
| 황산염 | 805 ± 21 | 807 ± 15 | |
| 전도성 | 3125 ± 143 | 3190 ± 62 | |
| pH를 | 7.31 ± 0.09 | 7.36 ± 0.05 | |
표 1. 전과의 CuO-NP 처리 후의 양이온과 음이온의 분석 평균 요소 농도 전후의 CuO-NP로 처리 후. 의 CuO-NP-처리 및 치료 PBW의 농도 사이의 의의는, * = P <0.05로 지정되어 ** = P <0.01 *** = P <0.001. 빈 셀은 유의 한 차이를 나타냅니다. 염화물 농도는 8.180 ± 0.707 ± 46.5 사이 55.25을이었다. 알루미늄, 붕소, 몰리브덴 농도는 낮았다 인해의 CuO-NP 치료에 유의 한 변화를 보이지 않았다. 망간 농도는 일치하지 않았다.
| 구성 요소들 | 합계 농도의 % | 종 |
| 비소 | 58.7 | HAsO 4 2 |
| (41).2 | H 2 아소 4 - | |
| 우라늄 | 64.1 | 칼슘 UO 2 (CO) 3 (수성) |
| 32.2 | CaUO 2 (CO) 3 2 | |
| 0.03 | UO 2 (CO 3) 2 2- | |
| 3.5 | UO 2 (CO) 3 4- | |
| 0.09 | 칼슘 UO 2 (CO) 3 (수성) | |
| 0.02 | CaUO 2 (CO) 3 2 | |
| 셀렌 | 94.3 | 서 4 2 |
| 5.6 | CaSeO 4 (AQ) | |
| 바나듐 | 2.1 | HVO 4 2 |
| 95.7 | H 2 VO 4 - | |
| 2.1 | H 2 V 2 O 7 2- | |
| 0.01 | HV 2 O (7) 3 | |
| 0.01 | V 4 O (12) 4- |
표 2 : 생물 종 비주얼 MINTEQ의 버전을 사용하여 모델링. 3.0 소프트웨어. 비주얼 MINTEQ의 버전. 3.0 소프트웨어 (로얄 KTH 기술 연구소 Valhallavägen, 스웨덴)을 표 1에 PBW 성분의 금속 종 분화를 계산하는데 사용 하였다. (수성) = 수성 그 종의 고체 형태는 반대로.
| EMEM 제어 | 처리되지 않은 | ||
| PBW | PBW는 + 미디어 | ||
| 비소 | 0.003 ± 0.0 | 0.017 ± 0.0 | 0.010 ± 0.001 |
| 구리 | 0.01 ± 0.0 | 0.0015 ± 0.001 | 0.018 ± 0.0 |
| Selinium | 0.013 ± 0.002 | 1.75 ± 0.07 | 1.15 ± 0.06 |
| 우라늄 | 0.00015 ± 0.0 | 0.975 ± 0.03 | 0.71 ± 0.01 |
| 바나듐 | 0.0015 ± 0.0 | 1.25 ± 0.07 | 0.785 ± 0.007 |
| 의 CuO 순이익은 처리 | |||
| PBW | PBW는 + 미디어 | ||
| 비소 | 0.0022 ± 0.001 | 0.0015 ± 0.0 | |
| 구리 | 0.926 ± 0.4 | 0.81 ± 0.0 | |
| Selinium | 1.25 ± 0.05 | 0.855 ± 0.0.02 | |
| 우라늄 | 0.208 ± 0.03 | 0.45 ± 0.01 | |
| 바나듐 | 0.102 ± 0.02 | 0.0795 ± 0.01 | |
표 3. 미디어에서 오염 물질의 농도 EMEM-1X 제어에 우선 순위 오염 물질 (㎎ / ℓ) (EMEM), 치료 PBW의 농도, CuO를-NP 처리 된 PBW, 치료 PBW + 미디어와의 CuO-NP 처리 된 PBW + 미디어 미디어 구성 요소를 추가 한 후 (N = 3) + PBW 미처리 미디어에 표현 된 처리에 의한 오염 물질의 농도 변화를 확인하기 위해 평가되었다 PBW의 CuO-NP를 처리 + 미디어 CEL인가LS.
| 처리되지 않은 PBW + 미디어 | ||
| 처리되지 않은 PBW의 농도는 (X 로그) | % 생존력 (HEK 세포) | %의 생존 (HEP 세포) |
| EMEM | (100) | (100) |
| 16.5 % (1.217) | 51.4 | 50.8 |
| 29 % (1.462) | (39) | 33.3 |
| 44 % (1.643) | 19.3 | 14.7 |
| 56 % (1.748) | 14.5 | 9.4 |
| IC (50) 로그 [PBW] | 1.264 | 1.243 |
| B PBW + 미디어의 CuO-NP-처리 | ||
| 의 CuO-NP-처리 된 PBW (로그 X)의 농도 | % 생존력 (HEK 세포) | %의 생존 (HEP 세포) |
| EMEM | (100) | (100) |
| 17 % (1.230) | 86.7 | 119.8 |
| 30 % (1.477) | 75.8 | 86.7 |
| 45 % (1.653) | (81) | 92.4 |
| 53 % (1.724) | 70.3 | 97.5 |
| IC (50) 로그 [PBW] | 2.744 | 5.327 |
표 4 : IC (50) IC (50)의 계산은 생존력을 50 % 억제에 필요한 치료 + PBW 미디어 또는 CuO를-NP + PBW 처리 매체의 농도를 나타낸다. 미처리 PBW + 미디어 (A) 또는 CuO를-NP 처리 PBW + 매체 (B)의 희석에 노출 HEK 및 HEP 세포 일 5 %의 생존율이 절반 최대한 억제 농도 (IC 50)을 계산하는데 사용되었다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이전의 연구의 CuO-NPS에서 지하수 11,13,30,31에서 비소를 제거 보도했다. 본 연구는 이러한 이전의 연구 결과를 지원하며 CuO를 - 국민 연금 PBW에서 추가 오염 물질을 제거하는 것이보고합니다. 이 연구는 또한의 CuO-NP에 다른 오염 물질과 잠재적 경쟁 이온 (11)의 존재에도 불구하고, 비소 제거에 효과적이라는 이전의 보고서를 확인합니다. 분화 모델링의 CuO-NP에에 흡착을 허용, PBW에서 바나듐 종의 97 %가 부정적으로 청구됩니다 것으로 예측하고 일괄 처리는 바나듐의 92 %를 제거했습니다.
이것의 CuO-NP를 사용 PBW으로부터 특정 오염 물질을 제거하는 효과를 조사하고 제거와 관련된 독성의 변화를 평가하는 제 연구이다. 결과는 시험 관내 접근법을 사용하여 복잡한 혼합물의 세포 독성의 변화를 조사하는 것이 가능하다는 사실을 증명하지만, 이들 방법은 제한이없는 것은 아니다. PBW는 f를 사용 할 수 없습니다생존하기 때문에 세포 ULL 강도는, 배양 된 세포는 한정된 성장 배지와 특정 삼투압을 필요로한다. PBW + 미디어는 pH 조정없이 셀에 사용할 수 없습니다. PBW의 pH는 전 7.31 및 그러나 치료 후 7.36이었다; 성장 배지 성분의 추가는 희석에 따라 약 6.8의 pH를 감소시켰다. pH 조정하지만 세포 배양 배지의 제조에서 정상 단계; + PBW 매체의 pH를 조정하는 미디어 구성 요소와 요소 종의 분자의 상호 작용을 변경할 수도있다. 미처리의 CuO-NP 처리 PBW는 시험 용액 (+ PBW 매체)를 수득하기 위해 다양한 비율로 농축 EMEM-10X의 성장 배지와 혼합 하였다. ICP-MS 분석은 크게의 CuO-NP-처리 (비소, 구리, 셀레늄, 우라늄, 바나듐)에 의해 영향을받는 금속의 농도가 미디어 구성 요소 및 삼투압 조절에 의한 희석 후 예상 농도되었는지 확인하기 위해 테스트 미디어에서 수행되었다. 감소의 CuO-NP-치료 후 비소, 셀레늄, 바나듐에서 치료 PBW + 미디어와의 CuO-NP 처리 된 PBW + 미디어 사이의 농도 차이에 반영됩니다. 우라늄 농도는 예상보다의 CuO-NP 처리 된 PBW + 미디어에서 더 높다. ICP-MS 데이터 (표 1)의 모델링에 의해 예측 된 것보다 더 많은 우라늄의 CuO-NP 처리시 PBW에서 제거되었음을 암시한다. 분화 모델링 (표 2)의 pH 7.3에서, 우라늄 종의 35.5 %가 부정적으로 청구됩니다 것으로 전망했다. 모델은 주요 우라늄 종 칼슘 우라 닐 카보네이트 (칼슘 UO 2 (CO) 3), 중립이라고 예측한다.
우라늄 관찰 78 %의 제거로 인해 (우라 닐 칼슘 카보네이트 미네랄 등) 우라늄 흡착 및 침전의 조합 가능성이 있었다. 화학적 모델링에 기초하여, 흡착에 의해 제거 우라늄의 비율의 CuO-NP의 높은 농도를 허용 계산보다 작은처리 된 PBW + 미디어. 의 CuO-NP-처리하여 우라늄 제거의 메커니즘은 명확하지 않다 자세한 조사가 필요합니다. 그러나이 PBW EMEM-10 배에 첨가 할 때, 칼슘, 칼륨 및 마그네슘의 농도 증가가 예상되었다; 이 차이의 CuO-NP + PBW 처리 대 비 처리 된 미디어에 나타나지 않았다되도록 CuO를-NP-치료는 이들 요소에서의 큰 변화가 발생하지 않았다. 미디어 구성 요소와 실제 환경을 조합의 기술 요소에 의한 처리 농도에서 본 변화를 나타내는 성공적이었다; 그러나 PBW의 자연 산화가 + PBW 매체가 제조 될 수있는 방법을 한정. 시험 배지의 원소의 최대 농도를 증가시키기위한 시도에서 가루 세포 배양 배지는 원래 + PBW 미디어 있도록 미처리의 CuO-NP 처리 PBW과 혼합 하였다. 분말 미디어는 종종 칼슘 염 침전 결과와는 concen 생산, RO 물 더 희석이 필요 PBW + 미디어의 삼투압을 증가액체 10 배 매체를 얻을에 가까운 trations. 이러한 문제는 인해 산화 상태로 PBW 고유의 가능성이 가장 높은 및 기타 덜 민감한 혼합물에 문제가되지 않을 수 있습니다.
MTT 분석법은 미토콘드리아 활성을 측정함으로써 세포의 전반적인 건강을 평가 인정 표준 높은 처리량 분석 때문에 세포 독성을 평가하기 위해 선택되었다. 이 방법은 장점과 단점이 있습니다. 96 웰 형식으로 그러나 여러 개의 데이터 포인트를 획득하는데 유용하다; 5 일째 세포의 대다수가보고되었다 해로운 반올림 더 이상 플레이트에 부착. 미디어가 진공을 이용하여 제거되기 전에 그림 2의 사진을 찍은; 미디어를 흡입 한 후 MTT 용액을 미처리 PBW 함께 볼 일 후에 MTT 두 신호의 전체적인 고원에 기여 잘못 부착 세포를 비 부착 세포를 제거하거나 분리 모른다 첨가. 가정은 O 떠있는 세포가 죽었거나 죽어 있다는 것입니다할수 있답니다 부착 된 세포는이 방법을 사용하여 평가됩니다. 이는 나노 입자를 이용한 연구에 대한 MTT 분석의 한계를 고려하는 것도 중요하다.
이전의 연구는 직접 배양 된 세포에 적용 할 때, 나노 입자 크기와 같은 독특한 물리적 특성에 따라, 그 기재의 화학적 특성을 넘어, 본래 독성을 가지고있다 (32, 33)를 형성하는 것으로보고있다. 이 현재 연구에서는 세포에 직접의 CuO-NPS를 적용하지 않았다. 대신, 세포는 이전의 CuO-NP에의 대부분을 제거하는 원심의 CuO-NP에 처리 한 다음 PBW가 PBW + 매체를 제조하는데 사용되기 전에 더의 CuO-NP에 제거 회 여과되었다 PBW 노출시켰다. MS 결과 처리 후의 구리의 증가를 보였다. 이것은 처리 PBW U에 남아 원심 / 여과 단계를 통과 한 처리 수 또는 CuO를-NP에 나노 입자 중에 용해시켰다로부터 구리 이온 수PBW + 미디어를 만들기 위해 나오지. CuO를-NPS는 85 ± 1 ㎡ / g (11)의 BET 측정 표면적 12-18 nm 내지 크기가 다양하지만, 구리의 대부분에 관계없이 처리 PBW 구리 농도의 증가를 최소화에 응집 공지 기반 소스의 원심 분리와 여과 후 제거됩니다. 개선 된 세포의 건강과 합류의 시각적 확인 (그림 2)에 의한 PBW의의 CuO-NP 처리 개선 생존의 MTT 분석 결과를 지원합니다. 평가 (또는 특징) 수의 CuO-NP에 의한 유사한 교란 효과를 다른 방법을 사용하여 앞으로의 연구.
인간 배아 신장 (HEK 293)과 인간의 간세포 암 (HEP의 G2) 세포 독성 시험을 위해 선택되었다. 이들은 중금속 장기 독성 24,25,34-40에 임상 적으로 관련된 표준 셀 라인입니다. 낮은 시딩 밀도는 MTT 분석에 사용 하였다. 세포는 회복 할 수 / 잘 500 세포에 접종 하였다24 시간 동안 후 시험 배지에 노출시켰다. 낮은 파종 밀도가 6 일 또는 7 Chakraborty는 등의 오버 합류 및 고정되기 전에, 하루 5 주위 로그 위상 성장 곡선을 달성하기 위해 필요했다. (2010 년)보고 그 배양 신장에서 카드뮴의 독성에 대한 연구에 서브 합류 증식 세포가 컨 플루 언트 (정지) 세포보다 세포 독성을 나타내었다 : 근위 세뇨관 세포 (PTC)가 컨 플루 증식 상태 카드뮴 노출에 대한 반응에 영향 (무부하 대 증식). 다른 분석을 위해 사용되는 것과 유사한 높은 농도 (보다 포화 상태)에서 PBW에 노출 HEP 및 HEK 세포를 MTT 분석으로 본 형태에서 강력한 변화를 나타내지 않았다 (결과 미도시). 비 부착 세포주 또는 수확하고 모든 세포를 수집 프로토콜을 사용하여 세포 독성의 변화에 대한 추가 조사는 (예 : 유동 세포 계측법)가 필요합니다.
연구 미국 MTT 방법의 다른 제한나노 입자를 보내고은 나노 입자의 몇 가지 유형의 세포 영양을 방해 할 수 있다는 것입니다. 세포 배양 배지는 일반적으로 세포의 성장을 보완하는 등의 소 태아 혈청 (FBS)으로 추가의 단백질 공급원을 함유. 연구는 금속 산화물 나노 입자는 나노 입자로 인해 증가 된 흡수 용량, FBS 성장에 중요한 성분을 소모 할 수 있는지 보여 주었다. 금속 산화물 나노 입자는 칼슘 (41)의 상호 작용을 통해 FBS을 링크하는 것으로 나타났다. 용액의 pH에 따라 금속 나노 입자는 양 또는 음의 전하를 운반 할 수있다. 독성 연구는 미디어가 칼슘을 포함 양이온을 흡수하는 금속 나노 입자는 세포 배양 물에 첨가 도시하고 FBS 단백질에 대한 결합 부위 칼슘 NP-칼슘 복합체의 결합을 통해 FBS / 혈청 알부민을 제거 하였다. 이것은 본질적으로 세포 배고파 및 NA에 의한 세포 독성을 증가 매체 FBS와 칼슘의 농도를 감소41 noparticles. 또한, FBS / 칼슘 나노 입자의 노광 전은 세포 독성 효과를 감소, 나노 입자를 코팅. 그러나, 우리는 직접의 CuO-NP에에 미디어를 노출하지 않았다. 또한, 그 프라이밍의 CuO-NP에 상 칼슘의 유의 흡수를 표시하지 2+ 농도의 CuO-NP는 치료 후 PBW에서 볼 수 있었다 칼슘에 유의 한 감소는 FBS과 결합 없습니다. 그러나 PBW 칼슘의 농도는 나노 입자 - 유도 감소가 명백하지 않았을 수도 충분히 높다. 그것은 함께 이전 연구에 비해 높은 수준의 칼슘이 포함 PBW에서의 CuO-NP에의 비소 흡착 성능의 저하없이 없었기 때문에 본 연구에서 사용의 CuO-NPS에서, 프로세싱 동안 많은 양의 칼슘 흡수되는 것을 여전히 어렵다 낮은 칼슘 지하수 13 농도.
데이터의 CuO-NPS에서 비소, 셀레늄, 바나듐과 우라을 제거하는 것이 보여천년는,이은 MTT 분석에서의 개선 및 HEP HEK 세포 생존과 연관된다. 생존 능력이 향상되는 메커니즘 (들)은 아직 결정되어야하지만, 다른 메커니즘들 사이의 CuO-NP 의해 우선 오염물의 제거에 기인 할 수있다. 현재의 연구는 또한 표준 세포 배양 방법은 많은 비용과 시간이 소요되는 생체 내 동물 실험으로 이동하기 전에 완료 될 잠재적 기전 연구의 범위를 허용 나노 ISR 수처리 방법의 유효성을 평가하기 위해 사용될 수 있음을 보여 . 또한, CuO를-NPS는의 CuO-NPS에서 pH 조절 또는 물의 산화를 필요로하지 않기 때문에, 마이닝 프로세스 및 알루미늄, 철, 티타늄, 망간 산화물과 같은 종래의 흡착제보다 금속 혼합물의 치료를위한 더 융통성 증명할 수도 비소 제거, 및 CuO를-NP에 대한 실리케이트 및 설페이트 음이온 경쟁 인산의 존재하에 아비산 및 비산을 모두 제거한다. 또한, CuO를-NPS는 재생하고 다시 할 수 있습니다- 중고, 시약 비용 및 처리 (12)의 소비를 필요로 처리 폐기물 부산물의 양을 감소시킨다.
MTT 프로토콜의 잠재적 인 제한은 낮은 세포 노출 시간에 밀도, 세포의 분리 및 신호의 손실, 세포 기아와의 CuO-순이익을 바꾸기 MTT의 반응성 세포의 수에 직접 노출을 포함한다. 세포 밀도 및 박리 문제는 더 높은 밀도 시드 허용 유동 세포 계측법뿐만 아니라, 모든 셀의 집합 (즉, 모두가 부동 및 장착)으로 대체 테스트를 사용하여 해결 될 수있다. 세포 고갈 문제는 주기적으로 치료 중에 매체의 성장 인자의 농도를 측정함으로써 평가 될 수있다. 향후 연구는 치료 동안 다른 세포 독성 가능성의 CuO-NP 노광 변경된 분석 활동 경우 다룰 것이다 분석, 세포 고갈의 측정치 현재 프로토콜을 적용하고 또한 contamina을 제거의 CuO-NP에의 능력을 시험에 중점국세청과는 슈퍼 펀드 사이트 및 폐기물 처리 연못에서 폐기물로 복잡한 혼합물의 다른 유형의 세포 독성에 영향을 미칩니다. 이러한 연구는 방법은 여러 가지 설정에 강력한되었는지를 해결하는 것입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CuCl2 | Sigma | 203149 | |
| Borosilicate glass balls | VWR | 26396-639 | 6 mm |
| Nitric Acid | Fisher | A509-P500 | Trace metal grade |
| 0.45 μm syringe filter | Fisher | SLHA 033S S | |
| 10x EMEM | Fisher | BW12-684F | |
| Fetal Bovine Serum | ATCC | 30-2020 | |
| L-glutamine | Fisher | BP379-100 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| Penicillin/Streptomycin | ATCC | 30-2300 | |
| 0.22 μm vacuum filter unit | Fisher | 09-740-28C | |
| HEK293 | ATCC | CRL-1573 | |
| HEPG2 | ATCC | HB-8065 | |
| Trypsin | Sigma | SV3003101 | |
| MTT | Sigma | M2128 | |
| D-penicillamine | Fisher | ICN15180680 | |
| 96-well plates | Fisher | 07-200-92 | |
| DMSO | Fisher | D12814 | |
| Spectra Max 190 | Molecular Devices | ||
| Visual MINTEQ version 3.0 | KTH Royal Institute of Technology | ||
| ICP-MS | Agilent | Details of instruments, models and detection limits were published in Reddy et al., 2013. | |
| IC DIONEX DX 500 | Dionex | Details of instruments, models and detection limits were published in Reddy et al., 2013. | |
| VWR Incubator | VWR |
References
- What is the status of the U.S. nuclear industry? Washington (DC): U.S. Energy Information Administration (US). , Available from: http://www.eia.gov/energy_in_brief/article/nuclear_industry.cfm (2014).
- International Energy Outlook. Washington (DC): U.S. Energy Information Administration (US). , Available from: http://www.eia.gov/forecasts/archive/ieo11/pdf/0484%282011%29.pdf (2011).
- Uranium Marketing Annual Report. Washington (DC): U.S. Energy Information Administration (US). , Available from: http://www.eia.gov/uranium/marketing/ (2014).
- Domestic Uranium Production Report. Washington (DC): U.S. Energy Information Administration (US). , Available from: http://www.eia.gov/uranium/production/annual/ (2014).
- Uranium Recovery. Washington (DC): U.S. United States Nuclear Regulatory Commission (US). , Available from: http://www.nrc.gov/materials/uranium-recovery/license-apps/ur-projects-list-public.pdf (2014).
- U.S. Uranium Reserves Estimates. Washington (DC): U.S. Energy Information Administration (US). , Available from: http://www.eia.doe.gov/cneaf/nuclear/page/reserves/ures.html (2010).
- The Future of Uranium Production in Wyoming: A Public Forum on In-Situ Recovery. Washington (DC): Meridian Institute. , Available from: http://www.uwyo.edu/ser/_files/docs/conferences/2010/uraniumforum/ser_uranium_forum_final_report.pdf (2010).
- Generic Environmental Impact Statement for In-Situ Leach Uranium Milling Facilities Washington (DC): U.S. Nuclear Regulatory commission (US). , Available from: http://www.nrc.gov/reading-rm/doc-collections/nuregs/staff/sr1910/v1/ (2012).
- Wyoming surface water quality standards. Cheyenne (WY): State of Wyoming Department of Environmental Quality (US). , Available from: http://soswy.state.wy.us/Rules/RULES/6547.pdf (2011).
- Qu, X., Alvarez, P., Li, Q. Applications of nanotechnology in water and wastewater treatment. Water Research. 47 (12), 3931-3946 (2013).
- Martinson, C., Reddy, K. Adsorption of arsenic(III) and arsenic(V) by cupric oxide nanoparticles. Journal of Colloid and Interface Science. 336 (2), 401-411 (2009).
- Reddy, K., McDonald, K., King, H. A novel arsenic removal process for water using cupric oxide nanoparticles. Journal of Colloid and Interface Science. 397, 96-102 (2013).
- Reddy, K., Roth, T. Arsenic Removal from Natural Groundwater Using Cupric Oxide. Ground Water. 51 (1), 83-91 (2012).
- Zhang, G., Ren, Z., Zhang, X., Chen, J. Nanostructured iron(III)-copper(II) binary oxide: a novel adsorbent for enhanced arsenic removal from aqueous solutions. Water Research. 47 (12), 4022-4031 (2013).
- Ali, I. New generation adsorbents for water treatment. Chemical Reviews. 112 (10), 5073-5091 (2012).
- Zhang, Q. CuO nanostructures: Synthesis, characterization, growth mechanisms, fundamental properties, and applications. Progress in Materials Science. 60, 208-337 (2014).
- Schmidt, C. TOX 21: new dimensions of toxicity testing. Environmental health perspectives. 117 (8), 348-353 (2009).
- Firestone, M., Kavlock, R., Zenick, H., Kramer, M. The U.S. Environmental Protection Agency Strategic Plan for Evaluating the Toxicity of Chemicals. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part B. 13 (2-4), 139-162 (2010).
- Guidance Manual for the Assessment of Joint Toxic Action of Chemical Mixtures [Internet]. Atlanta (GA); Agency for Toxic Substance and Disease Registry (US). , Available from: http://www.atsdr.cdc.gov/interactionprofiles/IP-ga/ipga.pdf (2014).
- Bae, D., Gennings, C., Carter, W., Yang, R., Campain, J. Toxicological interactions among arsenic, cadmium, chromium, and lead in human keratinocytes. Toxicological Sciences: An Official Journal of the Society of Toxicology. 63 (1), 132-142 (2001).
- Whittaker, M. Exposure to Pb, Cd, and As mixtures potentiates the production of oxidative stress precursors: 30-day, 90-day, and 180-day drinking water studies in rats. Toxicology and Applied Pharmacology. 254 (2), 154-166 (2011).
- Schilz, J. Investigating the ability of cupric oxide nanoparticles to adsorb metal contaminants from uranium in-situ recovery (ISR) production bleed water and assessing the associated changes in cytotoxicity. , University of Wyoming. Laramie, WY. Available from: ProQuest UMI, Ann Arbor, MI (2014).
- Manual of Standard Operating Procedures for Sample Collection and Analysis. Cheyenne (WY): Wyoming Department of Environmental Quality (US). , Available from: http://deq.state.wy.us/wqd/watershed/downloads/qa/4-1089.pdf (2011).
- Florea, A., Splettstoesser, F., Büsselberg, D. Arsenic trioxide (As2O3) induced calcium signals and cytotoxicity in two human cell lines SY-5Y neuroblastoma and 293 embryonic kidney (HEK). Toxicology and Applied Pharmacology. 220 (3), 292-301 (2007).
- Mao, W. Cadmium induces apoptosis in human embryonic kidney (HEK) 293 cells by caspase-dependent and -independent pathways acting on mitochondria. Toxicology in Vitro. 21 (3), 343-354 (2007).
- Tchounwou, P., Yedjou, C., Patlolla, A., Sutton, D. Heavy Metal Toxicity and the Environment. Molecular, Clinical and Environmental Toxicology. 101, 133-164 (2012).
- Meerloo, J., Kaspers, G., Cloos, J. Cell Sensitivity Assays: The MTT Assay. Cancer Cell Culture. 731, 237-245 (2011).
- Gustafsson, J. Visual MINTEQ. , Royal Institute of Technology. Stockholm, Sweden. (2010).
- Hallab, N., Caicedo, M., McAllister, K., Skipor, A., Amstutz, H., Jacobs, J. Asymptomatic prospective and retrospective cohorts with metal-on-metal hip arthroplasty indicate acquired lymphocyte reactivity varies with metal ion levels on a group basis. Journal of Orthopaedic Research. 31 (2), 173-182 (2013).
- Goswami, A., Raul, P., Purkait, M. Arsenic adsorption using copper (II) oxide nanoparticles. Chemical Engineering Research and Design. 90 (9), 1387-1396 (2011).
- Pillewan, P., Mukherjee, S., Roychowdhury, T., Das, S., Bansiwal, A., Rayalu, S. Removal of As(III) and As(V) from water by copper oxide incorporated mesoporous alumina. Journal of Hazardous Materials. 186 (1), 367-375 (2011).
- Kroll, A. Cytotoxicity screening of 23 engineered nanomaterials using a test matrix of ten cell lines and three different assays. Particle and fibre toxicology. 8 (9), 1-19 (2011).
- Fahmy, B., Cormier, S. Copper oxide nanoparticles induce oxidative stress and cytotoxicity in airway epithelial cells. Toxicology in vitro: an international journal published in association with BIBRA. 23 (7), 1365-1371 (2009).
- Radike, M. Distribution and accumulation of a mixture of arsenic, cadmium, chromium, nickel and vanadium in mouse small intestin, kidney, pancreas, and femur following oral administration in water or feed. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A. 65 (23), 2029-2052 (2002).
- Barbier, O., Jacquillet, G., Tauc, M., Cougnon, M., Poujeol, P. Effect of heavy metals on, and handling by, the kidney. Nephron. Physiology. 99 (4), 105-110 (2005).
- Zheng, X., Watts, G., Vaught, S., Gandolfi, A. Low-level arsenite induced gene expression in HEK293 cells. Toxicology. 187 (1), 39-48 (2003).
- Li, Z., Piao, F., Liu, S., Wang, Y., Qu, S. Subchronic exposure to arsenic trioxide-induced oxidative DNA damage in kidney tissue of mice. Experimental and Toxicologic Pathology. 62 (5), 543-547 (2010).
- Farombi, E., Akintunde, J., Nzute, N., Adedara, I., Arojojoye, O. Municipal landfill leachate induces hepatotoxicity and oxidative stress in rats. Toxicology and Industrial Health. 28 (6), 532-541 (2011).
- Das, N. Arsenic exposure through drinking water increases the risk of liver and cardiovascular diseases in the population of West Bengal. India. BMC public health. 12 (1), 639-648 (2012).
- Valko, M., Morris, H., Cronin, M. Metals, toxicity and oxidative stress. Current Medicinal Chemistry. 12 (10), 1161-1208 (2005).
- Horie, M. Protein Adsorption of Ultrafine Metal Oxide and Its Influence on Cytotoxicity toward Cultured Cells. Chemical Research in Toxicology. 22 (3), 543-553 (2009).
