Abstract
В месте восстановления (ISR) является основным методом добычи урана в Соединенных Штатах. Во ISR, уран вымывается из рудного тела и экстрагируют с помощью ионного обмена. Полученный производство кровотечения воды (ПБВ) содержит загрязняющие вещества, такие как мышьяк и другие тяжелые металлы. Образцы PBW от активного объекта ISR урана лечили медных наночастиц оксида CuO (NPS),. CuO-НП лечение PBW снижается приоритетных загрязняющих веществ, в том числе мышьяка, селена, урана и ванадия. Необработанные и CuO-NP лечение ПБВ был использован в качестве жидкого компонента из питательной среды клеток и изменения в жизнеспособности определяли с помощью МТТ (3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолийбромид) Анализ в человеческой эмбриональной почки (НЕК 293) и гепатоцеллюлярной карциномы человека (Hep G2) клеток. Лечение CuO-НП было связано с улучшенной НЕК и ГЭС жизнеспособности клеток. Ограничения этого метода включают в себя разбавление PBW компонентами роста медиа и во время осмольРегулировка Эк, а также необходимые регулировки рН. Этот метод будет ограничен в своем более широком контексте за счет эффектов разбавления и изменений в рН мас.ч. который традиционно слегка кислой однако; этот метод может иметь более широкое использование Оценка лечения CuO-NP в более нейтральных водах.
Introduction
Примерно 20% от электроснабжения США обеспечивается ядерной энергии и, частично на основе национальных стимулов для повышения энергетической независимости США ядерный потенциал, как ожидается, увеличится на 1. Во всем мире рост ядерной энергии также, как ожидается, продолжится, причем большая часть роста придется за пределами США 2. Как 2013, 83% из США урана было импортировано, но 952 544 метрических тонн запасов существуют в США 3,4. В 2013 году было 7 новых объектов приложения и приложения 14 перезапуск / расширения между Вайоминг, Нью-Мексико, и Небраска 5. В США, уран извлекается преимущественно через восстановление в месте (ISR) обрабатывает 6. ISR вызывает меньше разрушения земель и избегает создания хвостохранилищ сваи, которые могут выпускать загрязнителей окружающей среды 7. ISR использует водной основе окислительные растворы для выщелачивания урана из подземных рудного тела, после чего уран экстрагируют из фильтрата с помощьюпроцесс обмена ионов 8. Для поддержания отрицательного баланса воды в организме руды, часть фильтрата, называется производство кровоточить воды (ПБВ), является сброшено. Часть ПБВ дезактивации с помощью обратного осмоса (RO) и вновь введен в процессе добычи, но ПБВ может также иметь положительные промышленных или сельскохозяйственных целей, если токсичные загрязнители могут быть уменьшены до приемлемого уровня, определенных государственных регулирующих органов для поверхности и подземных 9. В настоящее время большинство ISR урана, использовать RO для удаления загрязнений из PBW. Тем не менее, обработка РО является энергоемким и производит токсичных отходов рассол, который требует регулируемой утилизации.
Существует много методов обеззараживания воды, в том числе адсорбентов, мембран и ионного обмена. Из них адсорбции является наиболее часто используемым, и недавние разработки в синтеза наночастиц была повышена возможности адсорбента на основе дезактивации воды перерабатывает 10. Меди оксиде наночастицы (CuO-ИГ) ранее не изучались на уране ISR PBW, но в последних исследований удаления загрязнений из грунтовых вод, CuO-НП были обнаружены уникальные свойства, в том числе не требующих стадий обработки до или после воды ( например, регулируя рН или окислительно-восстановительного потенциала) и хорошо работает в различных композициях водных (например, в разных значениях рН, концентрации соли, или конкурирующих ионов) 11. Кроме того, CuO-НЧ легко регенерировать путем промывки гидроксидом натрия (NaOH), после чего регенерированный CuO-НЧ можно использовать повторно. Подробная информация о CuO-NP след металлических фильтрующих возможностей из природных вод были ранее опубликованы 11-14.
Хотя это и полезно для очистки воды, наночастицы оксида металла могут быть токсичными для живых организмов, но степень токсичности зависит, в частности, на характеристики наночастиц и составляющих 10,15,16. Таким образом, важно, чтобы изучить одноврпрочие обязательства удаления загрязнений и наночастиц токсичности до применения на местах. Нынешнее исследование определило возможность CuO-наночастиц для удаления PBW приоритетных загрязняющих веществ (в том числе мышьяка, селена, ванадия и урана), и оценили эффект лечения CuO-НП на PBW цитотоксичности.
ПБВ были собраны из активного объекта ISR урана и используется для определения эффективности лечения CuO-NP в приоритетном удаления загрязнений. ПБВ цитотоксичность перед и после лечения CuO-NP также оценивали. ПБВ является сложное геологическое (промышленная / окружающей среды) смесь, и оба Национальный институт гигиены окружающей среды и науки (NIEHS) и Агентство по токсическим веществам и регистрации заболеваний (ASTDR) являются делая акцент на изучении токсичности для окружающей среды соответствующих смесей, в том числе смесей как они существуют в природе или промышленных установок, а также содействие в пробирке тестирования приоритеты химикаты для дальнейшего тестирования в естественных условиях17-19. Исследования хронических, низких доз облучения смеси бросают вызов, потому что хроническое воздействие смеси низкой дозы не производят очевидные эффекты, по крайней мере, не в короткие сроки в большинстве лабораторных исследований. Точно так же, наиболее пробирке исследования химических смесей подвергайте клетки в определенной лабораторного производства смеси 2 или более металлов 20,21. Эти исследования дают исходную информацию, но упрощенные смеси не повторить сложные антагонистические и синергетические взаимодействия, которые могут возникнуть в родном, окружающей образец, где полный спектр компонентов смеси присутствуют.
Цели данного исследования были изучить альтернативные процессы удаления загрязнений для PBW и оценить эффект (CuO-НП) лечения на PBW цитотоксичности, используя культивируемые клетки человека. Результаты могут воспользоваться урановой промышленности путем развития более эффективных или экологичных методов удаления загрязнений. Это исследование даетПервое свидетельство, что сокращение приоритетных загрязняющих веществ в PBW по CuO-наночастиц снижает цитотоксичность в клетках млекопитающих 22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все образцы были собраны в здании по переработке урана жидкого уранового ISR объекта в Вайоминге.
1. Производство Кровотечение воды (ПБВ)
- Соберите два типа проб воды из ISR объекта урана: ПБВ и обратного осмоса (RO) воды. Соберите PBW из крана мониторинга после процесса ионного обмена, но до обратного осмоса очистки. Соберите образцы RO после ПБВ дезактивации обратной лечения осмоса.
Примечание: выщелачивателе транспортируется по трубопроводам из нескольких полей также к зданию обработки урана жидкости, где его собирают в колонку и подготовленной для ионного обмена. Приблизительно 1-3% выщелачивателе после ионного обмена удаляют из контура и называется отбираемого производство воды (ПБВ). ПБВ повторно используется в горнодобывающей процессов или обеззараживать / деминерализованной с фильтрацией RO. - Сбор проб воды в полиэтилен высокой плотности (HDPE) бутылки с нуля свободное пространство постандартных операционных процедур для сбора и анализа Вайоминг Департамента качества окружающей среды (WYDEQ) 23 пробы.
- Измерьте температуру и рН на месте и образцов на лед, чтобы держать их здорово.
- Магазин ПБВ при 4 ° С. Держите решение PBW круто только после минимального важно СМИ (EMEM-10x) концентрированной Игла добавляется во время подготовки медиа, как указано в следующей протокола.
Примечание: ПБВ является Раствор окисленного что будет выпадать в осадок, если это разрешено, чтобы заморозить или нагревают до комнатной температуры. После разбавления раствора ПБВ достаточно разбавленной, что он не будет выпадать в осадок при нагревании до 37 ° С перед нанесением к клеткам и в процессе инкубации.
2. Подготовка CuO наночастиц (НЧ-CuO)
- Зерноуборочный чистый этанольного раствора, содержащего 250 мл 0,2 М CuCl 2 • 2H 2 O, 250 мл 0,4 М гидроксида натрия (NaOH) и 5 г полиэтиленгликоля (PEG) в круглодонную колбу с шести мм боросиликатного стекла шаров.
- Поместите раствор в модифицированной микроволновой печи и позволяют ему реагировать с обратным холодильником при давлении окружающего воздуха в течение 10 мин при 20% мощности (с интервалом в 6 сек на 24 сек, с).
- Охлаждают раствор до комнатной температуры (20 ° С), затем декантируют в 50 мл конические пробирки, в результате чего стеклянные шарики.
- Центрифуга раствор в 50 мл конические пробирки при 1000 х г в течение 30 мин, декантировали, а затем промыть CuO-NPS с последовательностью 300 мл горячей воды (60-65 ° C), 100 мл этанола и 100 мл ацетона.
- Высушите CuO-NPS до комнатной температуры (20 ° C) в 50 мл конические пробирки.
- Очистите CuO-NPS из своих труб в ступке. Накройте CuO-NPS с фольгой и нагреть CuO-NPS до 110 ° С в печи, чтобы удалить оставшуюся жидкость. Комбинат CuO-NPS в одном пакете, и взвесить CuO-NPS.
ПРИМЕЧАНИЕ: подготовка CuO-наночастиц и CuO-NP лечения PBW проводились в воде качность Лаборатория науки экосистем и управления, Университет Вайоминга. CuO-НП синтез с последующим процедуру Мартинсон и Редди (2009) 11.
3. Лечение PBW с CuO-наночастиц
- Добавить 50 мг (1 мг / мл) CuO-NP в 50 мл коническую пробирку с последующим добавлением 50 мл мас.ч.. Уплотнение трубки и подвергают взаимодействию в течение 30 мин на настольной орбитальном шейкере при 250 оборотах в минуту.
- Пробирок центрифуге при 250 мкг в течение 30 мин и затем фильтруют супернатант использованием шприцевой фильтр 0,45 мкм. Изменять скорость центрифуги и время может зависеть от наночастицы, чтобы обеспечить CuO-НП стать компактно в центрифужную пробирку.
4. Элементный анализ
- Подготовка необработанных (контрольных) и CuO-НП обработанные образцы ПБВ для элементного анализа следующим образом.
- Подкислите Аликвоты (40 мл) CuO-NP-обработанных и необработанных мас.ч. со следом металла класса азотной кислоты до рН 2,0. Анализ подкисленной аликвоты PBW катионов с индуктивно couplизд-плазменной масс-спектроскопии (ИСП-МС), как описано в Редди и Roth (2012) 13.
- Подготовьте unacidified Аликвоты (20 мл) CuO-NP-обработанных и необработанных мас.ч. и анализировать unacidified аликвоты для анионов методом ионной хроматографии (IC), как описано в Редди и Roth (2012) 13.
ПРИМЕЧАНИЕ: Аликвоты анализировали с помощью Вайоминг Департамента сельского аналитических служб, Ларами Вайоминг 82070. описание процедуры IC и МСПМС можно найти в Редди и Рот, (2012) 13.
5. Подготовка среды для культивирования клеток, используя PBW
- Используйте два управления (ЕМЕМ-1x и RO + СМИ) и восемь PBW тест медиа решений (четыре концентраций каждого из необработанной PBW и CuO-НП обработанной СМИ) в жизнеспособности исследований. Обзоры решений являются:
- Для контроля ЕМЕМ-1x, купить минимально необходимый СМИ Орла (ЕМЕМ-1x) с L-глютамин и бикарбонат натрия уже добавили. Добавить фетальной бычьей сыворотки (FBS) И антибиотики в инструкции завода-изготовителя.
Примечание: ЕМЕМ-1x приобретается разбавляют до соответствующей концентрации для роста клеток и содержащий L-глутамина и бикарбонат натрия. ЕМЕМ-1x требует добавления фетальной бычьей сыворотки (FBS) и антибиотик смеси пенициллина и стрептомицина (50 МЕ / мл пенициллина и 50 мкг / мл стрептомицина). ЕМЕМ-1x используется в качестве контрольной СМИ, потому что это рекомендуется роста медиа-изготовителя для обоих типов клеток, используемых в данном исследовании. Концентрированный ЕМЕМ-10x разбавляют RO воды из установки или необработанном или CuO-НП обработанной PBW производить испытания решения. Концентрированный ЕМЕМ-10x при покупке не содержит L-глутамин или бикарбонат натрия, так это добавляют в дополнение к эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) и антибиотик смеси пенициллина и стрептомицина. - Для решения управления RO RO использовать воду, собранную из ISR объекта. Используйте тот же протокол, тестовые СМИ PBW только подставить 100% RO Ватэ из ISR объекта на месте PBW. Для разбавления необработанной и CuO-НП-обработке в использовании решение RO или сверхчистой воды из лаборатории.
- Развести необработанный PBW в четырех концентрациях тест перед смешиванием с компонентами клеточной культуры. Подготовьте четыре различные концентрации необработанных решений PBW путем смешивания необработанной PBW с RO (из лаборатории) в следующих комбинациях: 100% (чистый PBW + нет воды RO), 75% (187,5 мл PBW + 62,5 мл воды RO), 50% (125 мл + 125 мас.ч. мл RO воды) или 25% (62,5 мл мас.ч. + 187,5 мл RO воды).
- Развести CuO-НП обработанных мас.ч. на четыре концентрации тест перед смешиванием с компонентами клеточной культуральной среде. Подготовьте четыре различные концентрации CuO-NP-обработанных растворами PBW путем смешивания мас.ч. (предварительно обработанные 1 мг / мл CuO-NP в течение 30 мин) с RO (из лаборатории) в следующих комбинаций: 100% (чистый CuO- NP-лечение ПБВ + NO RO воды), 75% (187,5 мл CuO-NP-обработанной PBW + 62,5 мл RO воды), 50% (125мл CuO-NP лечение ПБВ + 125 мл воды RO) или 25% (62,5 мл СиО НП обработанной PBW + 187,5 мл RO воды).
- Для контроля ЕМЕМ-1x, купить минимально необходимый СМИ Орла (ЕМЕМ-1x) с L-глютамин и бикарбонат натрия уже добавили. Добавить фетальной бычьей сыворотки (FBS) И антибиотики в инструкции завода-изготовителя.
- Подготовьте 250 мл RO + СМИ, необработанной PBW + СМИ и CuO-НП обработанной PBW + СМИ концентрации путем добавления 25 мл концентрированной EMEM-10x 190 мл 100% RO и 100%, 75%, 50% или 25% из предварительно сделанных неочищенных или CuO-НП, получавших концентрации PBW, созданных в шаге 6.1.3 и 6.1.4.
- Доводят рН каждого раствора до 7,4 с помощью NaOH или HCl.
- Дополнение каждую концентрацию неочищенных и CuO-НП обработанной PBW а также RO + СМИ со следующими стандартными компонентами: 25мл (10%) фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2,5 мл L-глутамина, 0,55 г NaHCO 3 и 1,25 мл ручка / Strep (50 МЕ / мл пенициллина и 50 мкг / мл стрептомицина).
- Отрегулируйте осмолярность каждой концентрации необработанной PBW + СМИ, CuO-НП-обработке PBW + СМИ и RO + средства массовой информации 290-310 мОсм / кг, добавляя RO воду и мера помощи осмометр.
- Фильтр каждое решение с помощьюБлок фильтров 0,22 мкм вакуум, и хранят при температуре 4 ° С.
ПРИМЕЧАНИЕ: В связи с небольшими вариациями в размере RO воды, используемой для регулировки осмотического давления, меняются конечные концентрации СМИ в пределах 5% диапазона А с необработанной PBW + концентрации средств массовой информации в 56%, 44%, 29% и 16,5% и CuO-NP- лечение мас.ч. + медиа концентрации 53%, 45%, 30% и 17%.
6. Жизнеспособность клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Учитывая, что почки и печень являются целевыми органы токсичности тяжелых металлов, используют культурные эмбриональной почки человека (НЕК293) клетки (НЕК), и гепатоцеллюлярной карциномы человека (HepG2) клеток (HEP) методы тестирования 24-26.
- Подготовка культуры НЕК и клеток HEP 2-3 дней до посева на 96-луночных используемые в эксперименте в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Измерение жизнеспособности клеток с использованием 3- [4, 5-диметилтиазол-2-ил] -2, 5-дифенилтетразолийбромид (МТТ).
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол МТТ был изменен с Миrloo и др. (2011) 27.- Получение МТТ в виде порошка. Добавить фосфатном буферном растворе (PBS), чтобы до концентрации акций в размере 50 мг / мл. Перемешивают раствор в течение 2 ч, а затем фильтруют с помощью шприца 0,45 мкм фильтр и аликвоту в 1,5 мл морозильных безопасных трубок. Защитите трубки от света и хранить при 4 ° С.
- Удалить HEK и HEP клетки от их культуры блюд с использованием трипсина, центрифуги при 1000 мкг в течение 5 мин и сливают трипсина. Добавляют 5 мл PBS и смешать клетки, чтобы получить единственное решение клеток. Затем применить 20 мкл раствора одного клеток в гемоцитометра, чтобы получить число клеток на миллилитр раствора. Центрифуга клетки снова при 1000 мкг в течение 5 мин и переливать PBS используется для промывки клеток. Добавить соответствующее количество EMEM-1x, чтобы довести концентрацию клеток до 500 клеток / 100 мкл (100 мкл / лунку).
- Заполните по периметру лунки планшета по 200 мкл PBS для управления для испарения.
- Семя клетокс при плотности 500 клеток / лунку добавлением 100 мкл в каждую лунку, для периметра скважин (которые не плакированных клеток), за исключением.
ПРИМЕЧАНИЕ: плотность посев для НЕК и клеток HEP на основе экспериментальных кривых роста, которые позволяют пик роста происходит вокруг дней, 4-5. Подготовка кривые роста для всех клеточных линий, чтобы оценить плотность посева. - Инкубируйте клетки в течение 24-ч при 37 ° С, позволяя им восстановить (форма жесткие спайки к пластине) перед выполнением чтения базовой МТТ плотности клеток.
- Выполнение базовых показания МТТ плотности клеток путем удаления посева носители из первого столбца (не включая периметру) и добавлением 100 мкл МТТ (5 мг / мл в средах) в лунки в течение 1 часа.
- Через один час, удалить МТТ и добавить 100 мкл диметилсульфоксида (ДМСО), чтобы растворить МТТ-формазана произведенный жизнеспособных клеток (20 мин).
- Считать оптическую плотность (ОП) в первой колонке при длине волны поглощения 570 нм, чтобы получить базулиния чтения.
- Использование базовых показания, чтобы обеспечить все пластины высевали правильно и что клетки растут последовательно между пластинами. Удалить ДМСО из колонки проходит проверку перед инкубацией в течение последующих 24 ч.
Примечание: Если ДМСО остается в плите на ночь она тянет влагу из соседней колонке, вызывая уменьшение объема средств массовой информации.
- Использование базовых показания, чтобы обеспечить все пластины высевали правильно и что клетки растут последовательно между пластинами. Удалить ДМСО из колонки проходит проверку перед инкубацией в течение последующих 24 ч.
- Теплый тестовые решения (т.е., ЕМЕМ-1x, RO, лечить ПБВ и CuO-НП обработанные решения ПБВ СМИ) до 37 ° С на водяной бане.
- Извлеките посева носители от остальной части пластины (не включая периметру или первом столбце, который был использован для базового чтения) и замещали 100 мкл EMEM-1x, RO + медиа, лечить PBW + медиа концентрации или CuO-NP -обработанной ПБВ + концентрации средств массовой информации (за одно решение пластины). Инкубируйте клетки в их концентрации испытаний или контрольных растворов для в общей сложности семи дней (дни 2-8).
ПРИМЕЧАНИЕ: Там 10 пластин всего: 1 EMEМ-1x, 1 RO + СМИ, 1 каждой необработанной концентрации PBW + СМИ (56%, 44%, 29% и 16,5%) и одна из пластин каждой CuO-НП обработанной концентрации PBW + СМИ (53%, 45% , 30% и 17%) в эксперименте на клеточной линии. - Каждый день после базовой чтения МТТ, удалить контроля и испытаний решений (перечисленные в примечании под 6.11) из следующей колонке их соответствующей пластины (например, день 2 тестовые и контрольные СМИ удаляются из строки 3, колодцы BG; День 3: строку 4, скважины BG т.д.) и повторить протокол МТТ, как описано в шагах 6,7-6,9 выше.
- Повторите протоколе, каждый день в течение семи дней. Нормальное результаты OD для каждой строки (6) скважин и сообщил на время, чтобы генерировать кривую роста семидневный.
- Чтобы оценить эффект меди хелятации на жизнеспособность клеток в CuO-NP обработанных мас.ч. + носитель такую же процедуру, как описано выше, за исключением того, добавление 100 мкМ D-пеницилламин, чтобы контролировать и испытуемые растворы перед добавлением растворов к их соответствующих плит. Выполните анальный данныхлиз с помощью программного обеспечения научно графический.
7. Моделирование геохимических
- Скачать для Visual версии MINTEQ 3.0 / 3.1 бесплатный со следующего сайта http://www2.lwr.kth.se/English/Oursoftware/vminteq/ .
Примечание: Visual MINTEQ это бесплатная химическое равновесие модель для расчета металлической видообразования, растворимости равновесия, сорбционной и т.д. для природных вод. Кроме того, он используется для прогнозирования ионный видообразования, ионные деятельности, ионные комплексы и индексы насыщения, который по сравнению с концентрацией элементов до и после лечения (результаты масс-спектроскопии), чтобы изучить возможные механизмы удаления элемента 28. - Откройте программу и введите данные масс-спектроскопии с шагом 4, в том числе рН, щелочности и концентрации различных элементов, в программу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Учитывая, что подземные воды окисляется во время на месте УраниПроцесс экстракции мкм, используют окисленные разновидности мышьяка, ванадия и урана для ввода.
8. ингибирующей концентрации 50 (IC 50)
- Рассчитать IC 50 для необработанных и CuO-НП, получавших PBW + СМИ концентрации сначала усреднением жизнеспособность (OD) средние по 5-й день из трех отдельных трасс.
- Вычитание день пять жизнеспособность средние необработанных и CuO-НП, получавших PBW + СМИ концентрациях от пяти день жизнеспособность средних EMEM-1x для расчета жизнеспособности различия. Затем разделите различия жизнеспособности от среднего жизнеспособность на 5 день в EMEM, и умножить на 100, чтобы получить процент ингибирования.
- Вычтите процент ингибирования от 100 (ЕМЕМ-1x жизнеспособности), чтобы получить процент жизнеспособности для каждого необработанного и CuO-НП обработанной PBW + СМИ концентрации.
- Вклад в научной программного обеспечения графический путем установки Emem-1X в концентрации одного и более процентов жизнеспособность 100; превратить все концентрации в журналешкала (Х = Log (X)), а также выполнять нелинейной регрессии наименьших квадратов с анализом подходят.
9. Анализ данных
- Сравните концентрации элементов в необработанной и CuO-НП обработанной PBW с двумя хвостами, в паре, Стьюдента.
- Рассчитать площади под кривой (AUC) с использованием данных кривой роста, собранные в течение семи дней и анализируют дисперсию с повторного анализа мер дисперсии (ANOVA) с последующим постфактум сравнению Тьюки между всеми группами (п = 3).
- Вычислить IC 50, используя данные из пяти день кривой роста как для необработанной и CuO-НП обработанной PBW + СМИ решений (описано выше). Значения Р <0,05 считаются существенными.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для целей статистического анализа, значения масс спектроскопии половины предела обнаружения был назначен ионов концентрации уровней ниже этого предела 29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Концентрации компонентов PBW и рН в необработанном и CuO-НП обработанной PBW приведены в таблице 1. Мартинсон и Редди (2009), сообщает, что точка нулевого заряда CuO-НП оценивается в 9,4 ± 0,4. Учитывая, что рН 7,2-7,4 мас.ч. было, в этих условиях, вода жертвует протоны CuO-наночастиц, что приводит к поверхности наночастиц, которые будут положительно заряженные позволяет адсорбции отрицательно заряженных частиц. Лечение CuO-НП удалены приоритетные загрязняющие вещества из мас.ч., в том числе мышьяка, селена, урана и ванадия (таблица 1). Средняя концентрация мышьяка была снижена на 87% [от 0,0175 до 0,002 мг / л (двусторонний парного Т-тест, р <0,0001)]. Лечение CuO-НП также значительно снижается селен (30%), уран (78%), ванадия (92%), и фосфат (85%) (р <0,05).
Результаты моделирования ВИДООБРАЗОВАНИЕ, приведены в таблице 2, поддерживает аналитические результаты: 99% сТаль раствор мышьяка в PBW присутствует как Haso 4 2- и Н 2 AsO 4 - 94% от общего растворенного селена в PBW присутствует как SeO 4 2-. Эти виды заряжены отрицательно, следовательно, способны адсорбировать на CuO-наночастиц. Видообразование моделирование предсказал, что 99% видов ванадия в PBW заряжены отрицательно, а также содействие адсорбции CuO-наночастиц. Тем не менее, видообразование моделирование предсказал только 35,5% урана виды отрицательно заряженной, что бы ограничить адсорбции CuO-наночастиц. Анализ показателей насыщения предсказал, что ни один вид мышьяком, selenium-, урана или ванадия минералов, содержащих не было рядом насыщения (т.е., минеральная осадков) уровни, поддерживая адсорбции CuO-наночастиц, в сравнении осадков.
Для оценки, если ожидаемые концентрации приоритетных загрязняющих веществ в средствах массовой информации, изготовленного из необработанной и CuO-НП обработанной PBW, образцов неразбавленного управления СМИ (ЕМЕМ-1x), 56%необработанные PBW + СМИ и 53% CuO-НП-обработке ПБВ + СМИ были проанализированы ICP-MS. Неразведенный управления медиа (ЕМЕМ-1x) является коммерческим продуктом поставляется с L-глутамина и бикарбонат натрия (предварительно добавлено). Меди и селена концентрации в контрольной EMEM-1x были слегка повышенной, как ожидалось, поскольку они необходимы для роста клеток, но мышьяк, уран и ванадий были незначительными, приведены в таблице 3. Предварительные исследования показали, что, мышьяк, селен и ванадий концентрации были снижены на Лечение CuO-НП и снижение была представлена в концентрации в CuO-НП обработанной PBW + СМИ. Измеренная концентрация урана в CuO-НП обработанной PBW + средах снизился по сравнению с необработанным PBW, и это снижение было более выраженным, чем предсказывали моделирования визуальной MINTEC v.3. Уровни меди выросли в CuO-НП обработанной СМИ, как ожидалось.
Для определения способности лечения CuO-NP для улучшения цитотоксичности PBW на млекопитающихклетки, жизнеспособность оценивали в клетках, подвергшихся воздействию растворов PBW + СМИ до и после лечения CuO-НП. Оба НЕК (1А) и ГЭС (рис 1B) клетки подвергали воздействию различных концентраций неочищенных или обработанной PBW + СМИ на срок до семи дней. В клетках, выращенных в необработанной мас.ч. + средах, жизнеспособность была нарушена в зависимости от концентрации, в то время как лечение CuO-НП улучшена жизнеспособность клеток в обеих клеточных линий. Интегрированный AUC на рисунке 1C показывает, что НЕК-клетки, выращенные в CuO-NP обработанных мас.ч. и носителя были более жизнеспособным сравнению с необработанным мас.ч. + средах при трех самых высоких концентраций (29%, 44% и 56%). HEP клетки показали несколько иной жизнеспособность: только два высокие концентрации необработанной мас.ч. + СМИ (44% и 56%) показали нарушение жизнеспособности по сравнению с CuO-NP-обработанной мас.ч. + информации (рис 1D). Более разбавленные концентрации мас.ч. были менее токсичен для клеток HEP, и жизнеспособность клеток меньшей степени зависит от лечения.Жизнеспособность как НЕК и HEP клеток, выращенных в 16,5% необработанной PBW + СМИ существенно не отличается от клеток, выращенных в 53% CuO-НП обработанной PBW + СМИ (р <0,05). Таким образом, лечение CuO-НП, казалось, улучшить цитотоксичность PBW, с жизнеспособностью вблизи уровней управления. Как обсуждалось выше, CuO-NP лечение мас.ч. связано с увеличением концентрации меди. Увеличение ожидалось, на основе ранее полученных результатов по Редди и Roth (2012), в котором они используются CuO-NPS для удаления мышьяка из грунтовых вод. Увеличение меди зависит от конкретного химического состава воды в мас.ч., но оставалась ниже EPA мкл 1,3 мг / л. Тем не менее, важно, чтобы исключить, что увеличение концентрации меди способствовало улучшению жизнеспособности (т.е. в дополнение к, или вместо, уменьшением приоритетных загрязняющих веществ). Соответственно, медь хелатор Д-пеницилламин был добавлен в контроль ЕМЕМ-1x, RO + контроля над СМИ, необработанных и CuO-НП, получавших PBW + СМИ решений, и гоан МТТ кривой роста жизнеспособности были получены, как описано выше. Медь комплексообразования не сделал значительное влияние жизнеспособность либо НЕК или HEP клеток инкубировали в RO управления + СМИ, необработанной и CuO-НП обработанной PBW + СМИ (результаты не показаны).
Половину максимальной ингибирующей концентрации (IC 50), рассчитывали из пяти дней роста клетки НЕК и HEP клеток, выращенных в необработанной мас.ч. + СМИ (Таблица 4a) и CuO-NP-обработанной мас.ч. + информации (Таблица 4b). Для НЕК клеток, выращенных в необработанном PBW + СМИ, стоимость СК 50 был 1.264 (войти% от веса). Таким образом, необработанные и носителя мас.ч. должны быть разбавлен до 18.38%, чтобы добраться до 50% снижению жизнеспособности. Для НЕК клеток, выращенных в CuO-НП обработанной PBW + СМИ, стоимость СК 50 был 2.744 (войти% от веса). Этот результат позволяет предположить, что теоретически цитотоксичность раствора была снижена до такой степени, что обработанной мас.ч. + носитель должен был бы быть сосредоточены на 500% (% от веса войти = 2,744), чтобы произвести аналогичную 50% Deскладка в жизнеспособности. Для HEP клеток, выращенных в необработанном PBW + СМИ, ИК 50 было 1.243 (войти% от веса). Это потребует разбавление мас.ч. + средах до 17,5% с получением 50% -ное снижение жизнеспособности. В противоположность этому, для HEP клеток, выращенных в CuO-NP-обработанной мас.ч. + средах, ИК 50 была 5,327 (войти% от веса). Это значение, вероятно, был настолько большим, потому что жизнеспособность клеток в CuO-NP-обработанной мас.ч. + средах существенно не отличалась от клеток, выращенных в EMEM-1x (контроль). Яркий поле изображения, показано на рисунке 2, обоих клеточного роста НЕК и ГЭС на пятый день. Число клеток и крепление в CuO-NP-обработанных PBW + средах (рис 2E, F) были улучшены по сравнению с необработанным мас.ч. + СМИ (фиг.2с, D).
Рисунок 1: Кривые роста. Кривые роста были использованы для оценки жизнеспособности и гrowth из культур во время лечения. Кривые роста для НЕК (A) и HEP (B) клетки выращены в четырех разведениях мас.ч. + средах по сравнению с 53% CuO-NP-обработанной мас.ч. + информации (верхние панели). Контроль ЕМЕМ-1x (ЕМЕМ) 
, RO 
, 53% CuO-НП обработанных 
16,5% необработанной ПБВ 
29% лечения ПБВ 
44% лечения ПБВ 
56% лечения ПБВ 
, Площадь под кривой (AUC) анализа НЕК (C) и ГЭС (D) данных кривых роста 7 дней (нижние панели). * Р <0,05 по сравнению с контролем, EMEM #p <0,05 по сравнению с контролем РО, §p <0,05 по сравнению с 53% CuO НП обработанных PBW-медиа. (По сравнению с использованием двух хвостатых ANOVA сПостфактум анализ Тьюки, п = 3.)
Рисунок 2:. Морфология клеток до и после лечения CuO-НП Яркий области микроскопии (20х) НЕК (левый столбец) и ГЭС (правая колонка) клеток в 5-й день, вырос в: контроль ЕМЕМ-1x (EMEM) (A, B ), 56% необработанных ПБВ + СМИ (C, D) и 53% CuO-НП-обработке ПБВ + СМИ (Е, F) был использован для изучения морфологии клеток. НЕК и HEP клетки, выращенные в управлении ЕМЕМ-1x (EMEM) (А, В) показывают, здоровый, почти сливающийся рост. НЕК и HEP клетки, выращенные в необработанном PBW + СМИ сократили число и появляются отдельные (С, D). НЕК и HEP клетки, выращенные в CuO-НП обработанной PBW + СМИ показывают лучшую привязанность и здоровые, более сливной клетки (E F).
| Элемент (мг / л) | Нормальное, Санкт-Дев. & Значение | ||
| До лечения | После Лечения | ||
| Мышьяк | 0,018 ± 0,001 | 0,002 ± 0,0 | *** |
| Селен | 1.8 ± 0.07 | 1.3 ± 0.05 | ** |
| Медь | 0,0015 ± 0,001 | 0.93 ± 0.43 | * |
| Кальций | 102 ± 82 | 106 ± 15 | |
| Стронций | 3.3 ± 1.1 | 1.5 ± 0.4 | * |
| Магний | 44 ± 2.1 | 47 ± 1,7 | |
| Натрий | 610 ±; 0.0 | 627 ± 27 | |
| Уран | 0.98 ± 0.03 | 0.21 ± 0.03 | *** |
| Барий | 0,037 ± 0,02 | 0,019 ± 0,01 | |
| Калий | 12 ± 0,0 | 12 ± 0,8 | |
| Кремний | 12 ± 0,7 | 12 ± 0,5 | |
| Ванадий | 1.3 ± 0.07 | 0,1 ± 0,02 | *** |
| Фосфат | 0,35 ± 0,07 | 0,05 ± 0,0 | *** |
| Сульфат | 805 ± 21 | 807 ± 15 | |
| Проводимость | 3125 ± 143 | 3190 ± 62 | |
| pH | 7,31 ± 0,09 | 7,36 ± 0,05 | |
Таблица 1:. Анализ катионов и анионов до и после лечения CuO-NP средних концентраций элементов до и после лечения с CuO-NP. Значение между концентрацией CuO-НП обработанной и необработанной PBW обозначены как * = р <0,05, ** = р <0,01 и *** = р <0,001. Пустая ячейка означает отсутствие существенной разницы. Концентрации хлоридов колеблется между 46,5 ± 0,707 и 55,25 ± 8.180. Алюминий, бор, молибден и концентрации были низкими и не показал значительного изменения в связи с лечением CuO-НП. Марганец концентрации не согласуются.
| Компоненты | % От общей концентрации | Вид |
| Мышьяк | 58,7 | HAsO 4 2- |
| 410,2 | Н 2 AsO 4 - | |
| Уран | 64,1 | Са 2 UO 2 (CO 3) 3 (ая) |
| 32,2 | ОЦАС 2 (СО 3) 3 2- | |
| 0.03 | UO 2 (СО 3) 2 2- | |
| 3.5 | UO 2 (СО 3) 3 4- | |
| 0.09 | Са 2 UO 2 (CO 3) 3 (ая) | |
| 0.02 | ОЦАС 2 (СО 3) 3 2- | |
| Селен | 94,3 | SeO 4 2- |
| 5.6 | CaSeO 4 (р-р) | |
| Ванадий | 2.1 | ХВО 4 2- |
| 95,7 | Н 2 О. 4- | |
| 2.1 | Н 2 V 2 O 7 2- | |
| 0.01 | HV 2 O 7 3- | |
| 0.01 | В 4 O 12 4- |
Таблица 2: Виды моделирования с помощью Visual MINTEQ вер. Программное обеспечение 3.0. Визуальный MINTEQ вер. 3.0 Программное обеспечение (КТН Королевский технологический институт, Valhallavägen, Швеция) была использована для расчета металла видообразования компонентов PBW, перечисленных в таблице 1. (Ая) = водный, в отличие от твердой формы этого вида.
| ЕМЕМ управления | Необработанный | ||
| ПБВ | PBW + СМИ | ||
| Мышьяк | 0,003 ± 0,0 | 0,017 ± 0,0 | 0,010 ± 0,001 |
| Медь | 0.01 ± 0.0 | 0,0015 ± 0,001 | 0,018 ± 0,0 |
| Selinium | 0,013 ± 0,002 | 1,75 ± 0,07 | 1.15 ± 0.06 |
| Уран | 0.00015 ± 0,0 | 0,975 ± 0,03 | 0.71 ± 0.01 |
| Ванадий | 0,0015 ± 0.0 | 1.25 ± 0.07 | 0,785 ± 0,007 |
| CuO НП лечение | |||
| ПБВ | PBW + СМИ | ||
| Мышьяк | 0,0022 ± 0,001 | 0,0015 ± 0.0 | |
| Медь | 0,926 ± 0,4 | 0.81 ± 0.0 | |
| Selinium | 1.25 ± 0.05 | 0,855 ± 0.0.02 | |
| Уран | 0,208 ± 0,03 | 0,45 ± 0,01 | |
| Ванадий | 0,102 ± 0,02 | 0,0795 ± 0,01 | |
Таблица 3:. Концентрации загрязняющих веществ в средствах массовой информации Концентрации приоритетных загрязняющих веществ (мг / л) в управление ЕМЕМ-1x (EMEM), необработанной PBW, CuO-НП-обработке ПБВ, лечить ПБВ + СМИ и CuO-НП-обработке ПБВ + СМИ после добавления компонентов медиа (п = 3) были оценены для обеспечения изменений в концентрации примеси из-за лечения были представлены в необработанных PBW + СМИ и CuO-NP лечение PBW + СМИ применительно к КВЖДлевая сторона
| Необработанные ПБВ + Медиа | ||
| Концентрации неочищенных PBW (войти X) | Жизнеспособность% (НЕК клетки) | Жизнеспособность% (HEP клетки) |
| ЕМЕМ | 100 | 100 |
| 16,5% (1.217) | 51,4 | 50,8 |
| 29% (1,462) | 39 | 33,3 |
| 44% (1.643) | 19,3 | 14,7 |
| 56% (1.748) | 14,5 | 9.4 |
| IC 50 Вход [ПБВ] | 1.264 | 1.243 |
| В CuO-НП-обработке ПБВ + Медиа | ||
| Концентрации CuO-НП-обработанных PBW (X) журнала | Жизнеспособность% (НЕК клетки) | Жизнеспособность% (HEP клетки) |
| ЕМЕМ | 100 | 100 |
| 17% (1,230) | 86,7 | 119,8 |
| 30% (1.477) | 75,8 | 86,7 |
| 45% (1,653) | 81 | 92,4 |
| 53% (1,724) | 70,3 | 97,5 |
| IC 50 Вход [ПБВ] | 2.744 | 5,327 |
Таблица 4: Расчет ИК 50. IC 50 представляет собой концентрацию неочищенных PBW + СМИ или CuO-НП обработанной PBW + СМИ, необходимого для 50% ингибирования жизнеспособности в. Процентов жизнеспособность на 5 день для НЕК и HEP клеток, подвергшихся разведения неочищенных PBW + СМИ (A) или CuO-НП обработанной PBW + СМИ (B) были использованы для расчета половины максимального ингибирующей концентрации (IC 50).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Предыдущие исследования сообщили, что CuO-НП удалены мышьяка из грунтовых вод 11,13,30,31. Это исследование поддерживает эти предыдущие результаты, а также сообщает, что CuO-НП удалить дополнительные загрязняющие вещества из PBW. Это исследование также подтверждает предыдущие сообщения, что CuO-НП эффективны при удалении мышьяка, несмотря на наличие других загрязнений и потенциальных конкурирующих ионов 11. ВИДООБРАЗОВАНИЕ моделирование предсказал, что 97% видов ванадия в мас.ч. заряжены отрицательно, что позволяет адсорбции CuO-наночастиц, и пакетного лечение удалены 92% ванадия.
Это первое исследование, изучить влияние удаления конкретных загрязнений из PBW помощью CuO-NP, а затем оценить изменения цитотоксичности, связанные с удалением. Результаты показывают, что исследования изменений в цитотоксичности сложных смесей с использованием подход в пробирке может быть возможным, но эти методы не без ограничений. ПБВ не могут быть использованы FУлла сила на клетки, потому что, чтобы выжить, культивируемые клетки требуют определенного средства массовой информации роста и конкретные осмоляльности. PBW + СМИ не могли быть использованы на клетках без регулировки рН. Значение рН было 7,31 мас.ч. до и после лечения 7,36 однако; Добавление компонентов питательной среды снижается рН до примерно 6,8, в зависимости от разбавления. Регулирование рН нормальный шаг в подготовке среды для культивирования клеток однако; регулируя рН PBW + СМИ может изменять молекулярные взаимодействия видов элементов с медиа компонентов. Необработанные и CuO-НП-обработке ПБВ были объединены с концентрированной питательной среды ЕМЕМ-10X в различных пропорциях для получения тестовых решений (ПБВ + медиа). Анализ ИСП-МС проводили на испытательной среды, чтобы убедиться, что концентрации металлов значительно пострадавших от CuO-NP-лечения (мышьяка, меди, селена, урана, ванадия) были при ожидаемых концентрациях после разбавления СМИ компонентов и регулирование осмоляльности. Снижениемышьяка, селена и ванадия после CuO-НП обращения отражается в различиях между необработанной концентрации PBW + СМИ и CuO-НП обработанной PBW + СМИ. Концентрации урана выше в CuO-НП обработанной PBW + СМИ, чем прогнозировалось. Данные ICP-MS (Таблица 1), что свидетельствует о более урана был удален из мас.ч. во время лечения CuO-NP, чем предсказано моделирования. ВИДООБРАЗОВАНИЕ моделирование (Таблица 2) предсказал, что при рН 7,3, только 35,5% видов урана отрицательно заряженные. Модель предсказывает, что основные виды урана, Уранилкарбонат кальция (Са 2 UO 2 (CO 3) 3), является нейтральным.
Наблюдается 78% удаление урана, вероятно, из-за сочетания адсорбции урана и осадков (как карбонат кальция минерала уранила). На основании геохимического моделирования, процент урана удалены путем адсорбции меньше, рассчитываемую с учетом более высокой концентрации в CuO-NP-обработанной ПБВ + СМИ. Механизм удаления урана CuO-НП обращения неясно и требует дальнейших исследований. Увеличение концентрации кальция, калия и магния было ожидать, когда ПБВ был добавлен в EMEM-10x однако; CuO-НП-лечение не производят значительные изменения в этих элементах, так никакой разницы не было видно в необработанной против CuO-НП обработанной PBW + СМИ. Техника объединения существующей экологической со средствами массовой информации компонентов был успешно представляет изменения видны в концентрациях элементов из-за лечения; Однако окисленный характер мас.ч. ограничены, как мас.ч. + носитель может быть сделано. В попытке увеличить максимальную концентрацию элементов в испытательной среды, порошок среда культуры клеток был изначально смешивают с необработанной и CuO-НП обработанной PBW сделать PBW + СМИ. Порошкообразные средства массовой информации часто приводит к осаждению солей кальция и увеличился осмоляльности PBW + средствах массовой информации, требуемой большую разбавления водой RO, производство концентрациях, близкие к получены с жидкими 10х СМИ. Эти вопросы, скорее всего, ПБВ конкретных благодаря своей окислительной государства и не может быть проблемой с другими, менее чувствительных смесей.
МТТ был выбран для оценки цитотоксичности, потому что это признанный стандарт высокой пропускной анализ, который оценивает общее состояние здоровья клеток путем измерения активности митохондрий. Этот метод имеет свои преимущества и недостатки. 96-луночный полезно для получения нескольких точек данных, однако; Большинство клеток на 5-й день были нездоровым смотрит, не закругленные, а более не прикреплен к пластине. Фотографии на рисунке 2 были приняты, прежде чем средства массовой информации была удалена с использованием вакуума; отсасывание от СМИ, а затем добавить МТТ решение может быть удалена одиноких клеток или отдельные плохо прилипшие клетки, способствуя общей плато сигнала МТТ после второй день видели с необработанной PBW. Предполагается, что плавучие клетки мертвы или умирают, и оолько прикрепленные клетки оценивали с помощью этого метода. Важно также учитывать ограничения МТТ по отношению к исследований с использованием наночастиц.
Предыдущие исследования показали, что, когда непосредственно применяться к культуре клеток, наночастицы могут иметь присущую токсичность, за пределами их базы химических свойств, в зависимости от их уникальных физических характеристик, таких как размер и форма 32,33. В этом текущем исследовании, мы не применяем CuO-NPS непосредственно на клетки. Вместо этого, клетки подвергали воздействию мас.ч., которые были предварительно обработанную CuO-наночастиц, центрифугировали, чтобы удалить большую часть CuO-наночастиц, а затем фильтруют, чтобы удалить два раза больше, CuO-НП до ПБВ используют для получения мас.ч. + носитель. Результаты МС показали увеличение меди после лечения. Это может быть ионы меди, которые были растворены от наночастиц во время лечения или CuO-наночастиц, которые могут прошедших через стадии центрифугирования / фильтрации, чтобы оставаться в обработанной мас.ч. UСЭД сделать PBW + СМИ. CuO-НЧ в диапазоне размеров от 12-18 нм с БЭТ измеряли площади поверхности 85 ± 1 м 2 / г 11, но, как известно, собирать и на основе минимальным увеличением концентрации меди в обработанной мас.ч., большую часть меди, независимо источника удаляется после центрифугирования и фильтрации. Визуальное подтверждение улучшения здоровья клеток и слияния подтверждают результаты МТТ улучшенной жизнеспособности из-за CuO-NP лечения мас.ч. (рисунок 2). Будущие исследования с использованием других методов можно оценить (или характеризуют) подобные смешанные эффекты, вызванные CuO-наночастиц.
Человеческого эмбриона почек (НЕК 293) и гепатоцеллюлярной карциномы человека (Hep G2) клетки были выбраны для испытаний на токсичность. Это стандартный клеточные линии, которые клинически значимых для тяжелых металлов органов токсичности 24,25,34-40. Низкой плотности посева был использован для MTT анализа. Клетки высевали при 500 клеток / лунку, позволяют восстановитьсяв течение 24 ч, а затем подвергали воздействию испытуемой среде. Низкой плотности посева необходимо для достижения кривой роста с логарифмической фазе около 5 суток, прежде чем стать чрезмерно сливной и стационарные в день 6 или 7. Chakraborty и др. (2010) сообщили, что при исследовании токсичности кадмия на культивируемых почек клетках проксимальных канальцев (PTC), конфлюентности и состояние оружия (пролиферирующих против покоя), пострадавших в ответ на воздействия кадмия: суб-сливающихся пролиферирующих клеток показал больше, чем цитотоксичность сливающихся (покоящихся) клеток. HEP и НЕК-клетки подвергаются мас.ч. на более высоких концентрациях (более сплошности), аналогичных тем, которые используются для других анализа (результаты не показаны) не показывают очевидные изменения в морфологии видно с МТТ. Дальнейшее расследование в изменениях в цитотоксичности, используя неадгезированных клеточные линии или протоколы, которые урожай и собрать все клетки (например, проточной цитометрии) необходим.
Еще одно ограничение метода МТТ в исследованиях насIng наночастиц является то, что некоторые типы наночастиц могут мешать сотовой питания. Клеточной культуральной среде, как правило, содержит добавленных источников белка, таких как эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), в дополнение рост клеток. Исследования показали, что наночастицы оксида металла могут привести к истощению важные компоненты роста в FBS, в связи с увеличением поглощающей способности наночастиц. Наночастицы оксида металла, как было показано, чтобы связать с FBS через взаимодействие с кальцием 41. В зависимости от рН раствора, металлические наночастицы могут нести положительный или отрицательный заряд. Цитотоксичности исследования показали, что наночастицы металлов добавлены в культуре клеток поглощать катионы СМИ, в том числе Са 2+, а затем удалить FBS / сывороточный альбумин через связывание 2+ комплекса NP-Ca, чтобы кальций сайтов связывания на белках в FBS. Это уменьшает концентрацию Са 2+ и FBS из средств массовой информации, по сути голодали клеток и увеличение цитотоксичности отнести к наnoparticles 41. Кроме того, до контакта наночастиц в FBS / Ca 2+ покрытием наночастиц, уменьшая их цитотоксический эффект. Тем не менее, мы не непосредственно подвергать СМИ в CuO-наночастиц. Кроме того, не значительное снижение Са 2+ концентрации были замечены в PBW после лечения с CuO-наночастиц, что указывает на отсутствие существенного поглощения Са 2+ на CuO-наночастиц грунтовки их не связывать с FBS. Тем не менее, концентрация кальция в мас.ч. достаточно высока, что наночастицы индуцированных уменьшение не может быть очевидной. Это по-прежнему маловероятно, что CuO-НП, используемый в этом исследовании, поглощать большие количества кальция в процессе обработки, потому что не было уменьшение мышьяка возможностей поглощения CuO-наночастиц в мас.ч., который содержит высокие уровни кальция по сравнению с ранее проведенных исследований с подземных с низкой плотности кальция 13.
Данные показывают, что CuO-НП удалить мышьяк, селен ванадий и УПАnium, и это связано с улучшением HEK и жизнеспособности клеток HEP в МТТ-анализе. Механизм (ы), по которому жизнеспособность улучшается до сих пор не определен, но может быть связано с удалением приоритетных загрязняющих веществ по CuO-NP, среди других механизмов. Нынешнее исследование также показывает, что стандартные методы клеточной культуры могут быть использованы для оценки эффективности метода очистки воды наночастиц ISR, потенциально позволяя ряд механистических исследований будет завершена, прежде чем переходить к более дорогостоящим и трудоемким в естественных условиях исследования на животных , Кроме того, CuO-НП может оказаться более универсальным для горных работ и для обработки металлических смесей по сравнению с обычными адсорбентами, как оксиды алюминия, железа, титана и марганца, так как CuO-НП не требует регулировки рН или окисления воды для удаления мышьяка, и CuO-наночастиц удалить как арсенит и арсенат в присутствии конкурирующего анионов фосфата, силиката и сульфата. Кроме того, CuO-НП можно регенерировать и повторно-Используется, снижение затрат реагентов и количество отработанных побочных очистки сточных нуждающихся в распоряжении 12.
Потенциальные ограничения протокола МТТ включают низкую плотность клеток в момент облучения, отряд клеток и потере сигнала, сотовый голодание и, возможно, непосредственного воздействия на клетки в CuO-НП изменяющий МТТ реактивности. Плотность клеток и отряд вопросы могут быть решены с помощью альтернативного испытания, такие как проточной цитометрии, которая позволяет более высокой плотности посева, а также совокупность всех клеток (то есть, как плавающий и прилагается). Сотовый голод вопросы могут быть оценены путем измерения концентрации факторов роста в средствах массовой информации периодически во время лечения. Будущая работа будет сосредоточена на применении текущий протокол к различным анализов цитотоксичности, которые будут рассмотрены, если это возможно CuO-НП экспозиции изменены анализа деятельности, измерения клеточной голода во время лечения, а также тестирование на способность CuO-наночастиц для удаления ЗагрязнителиNTS и влияет на цитотоксичность других типов сложных смесей, таких как отходы от Суперфонд сайтов и прудов утилизации отходов. Такие исследования будут рассмотрены также были ли надежными в различных условиях методы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CuCl2 | Sigma | 203149 | |
| Borosilicate glass balls | VWR | 26396-639 | 6 mm |
| Nitric Acid | Fisher | A509-P500 | Trace metal grade |
| 0.45 μm syringe filter | Fisher | SLHA 033S S | |
| 10x EMEM | Fisher | BW12-684F | |
| Fetal Bovine Serum | ATCC | 30-2020 | |
| L-glutamine | Fisher | BP379-100 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| Penicillin/Streptomycin | ATCC | 30-2300 | |
| 0.22 μm vacuum filter unit | Fisher | 09-740-28C | |
| HEK293 | ATCC | CRL-1573 | |
| HEPG2 | ATCC | HB-8065 | |
| Trypsin | Sigma | SV3003101 | |
| MTT | Sigma | M2128 | |
| D-penicillamine | Fisher | ICN15180680 | |
| 96-well plates | Fisher | 07-200-92 | |
| DMSO | Fisher | D12814 | |
| Spectra Max 190 | Molecular Devices | ||
| Visual MINTEQ version 3.0 | KTH Royal Institute of Technology | ||
| ICP-MS | Agilent | Details of instruments, models and detection limits were published in Reddy et al., 2013. | |
| IC DIONEX DX 500 | Dionex | Details of instruments, models and detection limits were published in Reddy et al., 2013. | |
| VWR Incubator | VWR |
References
- What is the status of the U.S. nuclear industry? Washington (DC): U.S. Energy Information Administration (US). , Available from: http://www.eia.gov/energy_in_brief/article/nuclear_industry.cfm (2014).
- International Energy Outlook. Washington (DC): U.S. Energy Information Administration (US). , Available from: http://www.eia.gov/forecasts/archive/ieo11/pdf/0484%282011%29.pdf (2011).
- Uranium Marketing Annual Report. Washington (DC): U.S. Energy Information Administration (US). , Available from: http://www.eia.gov/uranium/marketing/ (2014).
- Domestic Uranium Production Report. Washington (DC): U.S. Energy Information Administration (US). , Available from: http://www.eia.gov/uranium/production/annual/ (2014).
- Uranium Recovery. Washington (DC): U.S. United States Nuclear Regulatory Commission (US). , Available from: http://www.nrc.gov/materials/uranium-recovery/license-apps/ur-projects-list-public.pdf (2014).
- U.S. Uranium Reserves Estimates. Washington (DC): U.S. Energy Information Administration (US). , Available from: http://www.eia.doe.gov/cneaf/nuclear/page/reserves/ures.html (2010).
- The Future of Uranium Production in Wyoming: A Public Forum on In-Situ Recovery. Washington (DC): Meridian Institute. , Available from: http://www.uwyo.edu/ser/_files/docs/conferences/2010/uraniumforum/ser_uranium_forum_final_report.pdf (2010).
- Generic Environmental Impact Statement for In-Situ Leach Uranium Milling Facilities Washington (DC): U.S. Nuclear Regulatory commission (US). , Available from: http://www.nrc.gov/reading-rm/doc-collections/nuregs/staff/sr1910/v1/ (2012).
- Wyoming surface water quality standards. Cheyenne (WY): State of Wyoming Department of Environmental Quality (US). , Available from: http://soswy.state.wy.us/Rules/RULES/6547.pdf (2011).
- Qu, X., Alvarez, P., Li, Q. Applications of nanotechnology in water and wastewater treatment. Water Research. 47 (12), 3931-3946 (2013).
- Martinson, C., Reddy, K. Adsorption of arsenic(III) and arsenic(V) by cupric oxide nanoparticles. Journal of Colloid and Interface Science. 336 (2), 401-411 (2009).
- Reddy, K., McDonald, K., King, H. A novel arsenic removal process for water using cupric oxide nanoparticles. Journal of Colloid and Interface Science. 397, 96-102 (2013).
- Reddy, K., Roth, T. Arsenic Removal from Natural Groundwater Using Cupric Oxide. Ground Water. 51 (1), 83-91 (2012).
- Zhang, G., Ren, Z., Zhang, X., Chen, J. Nanostructured iron(III)-copper(II) binary oxide: a novel adsorbent for enhanced arsenic removal from aqueous solutions. Water Research. 47 (12), 4022-4031 (2013).
- Ali, I. New generation adsorbents for water treatment. Chemical Reviews. 112 (10), 5073-5091 (2012).
- Zhang, Q. CuO nanostructures: Synthesis, characterization, growth mechanisms, fundamental properties, and applications. Progress in Materials Science. 60, 208-337 (2014).
- Schmidt, C. TOX 21: new dimensions of toxicity testing. Environmental health perspectives. 117 (8), 348-353 (2009).
- Firestone, M., Kavlock, R., Zenick, H., Kramer, M. The U.S. Environmental Protection Agency Strategic Plan for Evaluating the Toxicity of Chemicals. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part B. 13 (2-4), 139-162 (2010).
- Guidance Manual for the Assessment of Joint Toxic Action of Chemical Mixtures [Internet]. Atlanta (GA); Agency for Toxic Substance and Disease Registry (US). , Available from: http://www.atsdr.cdc.gov/interactionprofiles/IP-ga/ipga.pdf (2014).
- Bae, D., Gennings, C., Carter, W., Yang, R., Campain, J. Toxicological interactions among arsenic, cadmium, chromium, and lead in human keratinocytes. Toxicological Sciences: An Official Journal of the Society of Toxicology. 63 (1), 132-142 (2001).
- Whittaker, M. Exposure to Pb, Cd, and As mixtures potentiates the production of oxidative stress precursors: 30-day, 90-day, and 180-day drinking water studies in rats. Toxicology and Applied Pharmacology. 254 (2), 154-166 (2011).
- Schilz, J. Investigating the ability of cupric oxide nanoparticles to adsorb metal contaminants from uranium in-situ recovery (ISR) production bleed water and assessing the associated changes in cytotoxicity. , University of Wyoming. Laramie, WY. Available from: ProQuest UMI, Ann Arbor, MI (2014).
- Manual of Standard Operating Procedures for Sample Collection and Analysis. Cheyenne (WY): Wyoming Department of Environmental Quality (US). , Available from: http://deq.state.wy.us/wqd/watershed/downloads/qa/4-1089.pdf (2011).
- Florea, A., Splettstoesser, F., Büsselberg, D. Arsenic trioxide (As2O3) induced calcium signals and cytotoxicity in two human cell lines SY-5Y neuroblastoma and 293 embryonic kidney (HEK). Toxicology and Applied Pharmacology. 220 (3), 292-301 (2007).
- Mao, W. Cadmium induces apoptosis in human embryonic kidney (HEK) 293 cells by caspase-dependent and -independent pathways acting on mitochondria. Toxicology in Vitro. 21 (3), 343-354 (2007).
- Tchounwou, P., Yedjou, C., Patlolla, A., Sutton, D. Heavy Metal Toxicity and the Environment. Molecular, Clinical and Environmental Toxicology. 101, 133-164 (2012).
- Meerloo, J., Kaspers, G., Cloos, J. Cell Sensitivity Assays: The MTT Assay. Cancer Cell Culture. 731, 237-245 (2011).
- Gustafsson, J. Visual MINTEQ. , Royal Institute of Technology. Stockholm, Sweden. (2010).
- Hallab, N., Caicedo, M., McAllister, K., Skipor, A., Amstutz, H., Jacobs, J. Asymptomatic prospective and retrospective cohorts with metal-on-metal hip arthroplasty indicate acquired lymphocyte reactivity varies with metal ion levels on a group basis. Journal of Orthopaedic Research. 31 (2), 173-182 (2013).
- Goswami, A., Raul, P., Purkait, M. Arsenic adsorption using copper (II) oxide nanoparticles. Chemical Engineering Research and Design. 90 (9), 1387-1396 (2011).
- Pillewan, P., Mukherjee, S., Roychowdhury, T., Das, S., Bansiwal, A., Rayalu, S. Removal of As(III) and As(V) from water by copper oxide incorporated mesoporous alumina. Journal of Hazardous Materials. 186 (1), 367-375 (2011).
- Kroll, A. Cytotoxicity screening of 23 engineered nanomaterials using a test matrix of ten cell lines and three different assays. Particle and fibre toxicology. 8 (9), 1-19 (2011).
- Fahmy, B., Cormier, S. Copper oxide nanoparticles induce oxidative stress and cytotoxicity in airway epithelial cells. Toxicology in vitro: an international journal published in association with BIBRA. 23 (7), 1365-1371 (2009).
- Radike, M. Distribution and accumulation of a mixture of arsenic, cadmium, chromium, nickel and vanadium in mouse small intestin, kidney, pancreas, and femur following oral administration in water or feed. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A. 65 (23), 2029-2052 (2002).
- Barbier, O., Jacquillet, G., Tauc, M., Cougnon, M., Poujeol, P. Effect of heavy metals on, and handling by, the kidney. Nephron. Physiology. 99 (4), 105-110 (2005).
- Zheng, X., Watts, G., Vaught, S., Gandolfi, A. Low-level arsenite induced gene expression in HEK293 cells. Toxicology. 187 (1), 39-48 (2003).
- Li, Z., Piao, F., Liu, S., Wang, Y., Qu, S. Subchronic exposure to arsenic trioxide-induced oxidative DNA damage in kidney tissue of mice. Experimental and Toxicologic Pathology. 62 (5), 543-547 (2010).
- Farombi, E., Akintunde, J., Nzute, N., Adedara, I., Arojojoye, O. Municipal landfill leachate induces hepatotoxicity and oxidative stress in rats. Toxicology and Industrial Health. 28 (6), 532-541 (2011).
- Das, N. Arsenic exposure through drinking water increases the risk of liver and cardiovascular diseases in the population of West Bengal. India. BMC public health. 12 (1), 639-648 (2012).
- Valko, M., Morris, H., Cronin, M. Metals, toxicity and oxidative stress. Current Medicinal Chemistry. 12 (10), 1161-1208 (2005).
- Horie, M. Protein Adsorption of Ultrafine Metal Oxide and Its Influence on Cytotoxicity toward Cultured Cells. Chemical Research in Toxicology. 22 (3), 543-553 (2009).
