Abstract
In situ återvinning (ISR) är den dominerande metoden för utvinning av uran i USA. Under ISR, är uran lakas ut från en malmkropp och ut genom jonbyte. Den erhållna produktionen avtappnings vatten (pbw) innehåller föroreningar, såsom arsenik och andra tungmetaller. Prover av PBW från en aktiv anläggning ISR uran behandlades med kopparoxid nanopartiklar (CuO-NPS). CuO-NP behandling av PBW minskat prioriterade föroreningar, bland annat arsenik, selen, uran och vanadin. Obehandlade och CuO-NP behandlade PBW användes som den vätskeformiga komponenten i celltillväxtmedium och förändringar i viabilitet bestämdes genom MTT (3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid) -analysen i human embryonal njure (HEK 293) och humant hepatocellulärt karcinom (Hep G2) celler. CuO-NP behandling var associerad med förbättrad HEK och HEP cellviabiliteten. Begränsningar av denna metod innefattar utspädning av PBW av tillväxtmediakomponenter och under osmoltionalitet justering samt nödvändig pH-justering. Denna metod är begränsad i sin bredare sammanhang på grund av utspädningseffekter och förändringar i pH för PBW som traditionellt lätt surt men; denna metod kan ha en bredare användning bedömning CuO-NP behandling i mer neutrala vatten.
Introduction
Ungefär 20% av den amerikanska elnätet tillhandahålls av kärnkraft och delvis baserad på de nationella stimulansåtgärder för att öka energioberoende, USA: s nukleära kapacitet väntas öka 1. Också väntas den globala tillväxten av kärnenergi att fortsätta, med en stor del av tillväxten inträffar utanför USA 2. Från och med 2013, var 83% av USA: s uran importeras, men 952.544 ton reserver i USA 3,4. År 2013 fanns det 7 nya anläggningen applikationer och 14 omstart / expansionsapplikationer mellan Wyoming, New Mexico, och Nebraska 5. I USA är uran huvudsakligen ut genom i tillfrisknandet situ (ISR) behandlar 6. ISR orsakar mindre störningar mark och undviker att skapa svans pålar som kan frigöra miljögifter 7. ISR använder vattenbaserade oxiderande lösningar för att laka uran från den underjordiska malmkroppen, varefter uranet extraheras från lakvatten genomen jonbytesprocess 8. För att upprätthålla ett negativt vattenbalansen i malmkroppen, ett parti av lakvatten, som kallas produktionen bleed vatten (pbw), avtappas. En del av PBW är saneras med hjälp av omvänd osmos (RO) och återinföras i gruvprocessen, men PBW kan också ha positiva industri- eller jordbruks bruk, om giftiga föroreningar kan minskas till acceptabla nivåer som fastställts av statliga tillsynsmyndigheter för ytan och grundvatten 9. För närvarande, de flesta anläggningar ISR uran använder RO för att avlägsna föroreningar från PBW. Men är RO bearbetning energikrävande och producerar giftigt avfall saltlösning, vilket kräver reglerad förfogande.
Många vattensanerings metoder finns, inklusive adsorbenter, membran och jonbyte. Av dessa är adsorption den vanligaste, och den senaste utvecklingen i nanopartiklar syntes har ökat kapaciteten hos adsorbent baserade vatten reningsförfaranden 10. Koppar oxide nanopartiklar (CuO-NPS) tidigare inte hade studerats på uran ISR PBW, men under de senaste studier av avlägsnande av föroreningar från grundvatten, var CuO-nationella parlamenten visade sig ha unika egenskaper, inklusive inte kräver före eller efter vattenbehandlingsstegen ( t.ex. justera pH eller redoxpotential) och prestera bra i olika vattenkompositioner (t.ex. i olika pH, saltkoncentrationer, eller konkurrerande joner) 11. Dessutom är CuO-NP lätt regenereras genom urlakning med natriumhydroxid (NaOH), varefter den regenere CuO-NP kan återanvändas. Uppgifter om CuO-NP spårmetallfiltreringskapacitet från naturliga vatten har tidigare publicerats 11-14.
Även användbar för vattenrening, kan metalloxidnanopartiklar vara giftiga för levande organismer, men omfattningen av toxicitet beror delvis på nanopartiklar egenskaper och beståndsdelar 10,15,16. Därför är det viktigt att studera simultuttalanden, borttagning av föroreningar och nanopartiklar toxicitet före fältapplikationer. Den aktuella studien bestäms förmågan hos CuO-NP att avlägsna PBW prioriterade föroreningar (inklusive arsenik, selen, vanadin och uran), och bedömt effekten av CuO-NP behandling på PBW cytotoxicitet.
PBW uppsamlades från en aktiv anläggning ISR uran och utnyttjas för att bestämma effektiviteten av CuO-NP-behandling i prioritets avlägsnande av föroreningar. PBW cytotoxicitet före och efter CuO-NP behandling bedömdes också. PBW är en komplex geologisk (industri / miljö) blandningen och både National Institute of Environmental Health och Science (NIEHS) och byrån för giftiga ämnen och sjukdom Registry (ASTDR) lägger tyngdpunkten på att studera toxicitet av miljö relevanta blandningar inklusive blandningar eftersom de förekommer i naturen eller industriella miljöer, samt främja in vitro att prioritera kemikalier för ytterligare in vivo-testning17-19. Studier av kronisk, låg dos blandning exponeringar utmanande eftersom kronisk exponering för en låg blandning dos inte ger tydliga effekter, åtminstone inte på kort tid de flesta laboratoriestudier. På liknande sätt är de flesta in vitro-studier av kemiska blandningar exponera cellerna till en definierad labb tillverkad blandning av två eller flera metaller 20,21. Dessa studier ger grundinformation, men förenklade blandningen inte replikera komplexa antagonistiska och samverkande effekter som kan uppstå i en inföding, miljöprov, där komplett utbud av blandningskomponenter är närvarande.
Målen för denna studie var att undersöka alternativa förorenande flyttprocesser för PBW och att utvärdera effekten av (CuO-NP) behandling på PBW cytotoxicitet med hjälp av odlade humanceller. Resultaten skulle kunna gynna uranindustrin genom utveckling av effektivare eller miljövänliga metoder för avlägsnande av föroreningar. Denna studie gerdet första beviset att en minskning av prioriterade föroreningar i PBW av CuO-NPS minskar cytotoxicitet i däggdjursceller 22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla prover samlades in vid bearbetnings byggandet av en uran ISR anläggning i Wyoming uran vätska.
1. Produktion Bleed Vatten (vd)
- Samla två typer av vattenprov från en ISR anläggning uran: PBW och omvänd osmos (RO) vatten. Samla PBW från en övervaknings kran efter jonbytesprocessen men före omvänd osmos dekontaminering. Samla RO prover efter PBW dekontamineras genom behandling med omvänd osmos.
OBS: Lixiviant transporteras i rörledningar från flera väl fält till bearbetnings byggnaden uran vätska, där det samlas upp i en kolumn och förberedd för jonbyte. Cirka 1-3% av lixiviant efter jonbyte avlägsnas från kretsen och benämns produktion avtappnings vatten (pbw). PBW återanvänds i gruvprocesser eller dekontamineras / demineraliserat RO filtrering. - Samla vattenprover i högdensitetspolyeten (HDPE) med noll huvudutrymmet enligtstandardrutiner för insamling och analys av Wyoming Department of Environmental Quality (WYDEQ) 23 prov.
- Mät temperatur och pH på plats och transport prover på is för att hålla dem svalna.
- Butiks PBW vid 4 ° C. Håll PBW lösningen svalna förrän efter den koncentrerade Eagles minimala essentiella medium (EMEM-10x) tillsätts under medie beredning enligt instruktionerna i följande protokoll.
OBS: PBW är en oxiderad lösning som kommer att falla ut om det tillåts att frysa eller värmdes till rumstemperatur. Efter spädning PBW lösningen är tillräckligt utspädd att den inte kommer att falla ut vid upphettning till 37 ° C före applicering på cellerna och under inkubering.
2. Framställning av CuO nanopartiklar (CuO-NPS)
- Kombinera en ren etanolisk lösning innehållande 250 ml 0,2 M CuCl2 • 2 H2O, 250 ml av 0,4 M natriumhydroxid (NaOH), och 5 g polyetylenglykol (PEG) i en rundbottnad kolv med sex mm borosilikat glaskulor.
- Placera lösningen i en modifierad mikrovågsugn och låt den reagera under återflöde vid omgivande lufttryck under 10 minuter vid 20% effekt (intervall om 6 sekunder på, 24 sekunder av).
- Kyl lösningen till rumstemperatur (20 ° C), sedan dekanterades i 50 ml koniska rör och lämnar glaskulorna.
- Centrifugera lösningen i de 50 ml koniska rör vid 1000 xg under 30 minuter, dekanterades, och tvätta sedan CuO-NP med en sekvens av 300 ml varmt vatten (60-65 ° C), 100 ml etanol och 100 ml aceton.
- Torka CuO-NP till rumstemperatur (20 ° C) i 50 ml koniska rör.
- Skrapa CuO-NP ut ur sina rör i en mortel. Täck CuO-NP med stanniol och värm CuO-NP till 110 ° C i en ugn för att avlägsna kvarvarande vätska. Kombinera CuO-NP i en sats och väga CuO-NP.
OBS: Framställningen av CuO-NP och CuO-NP-behandling av PBW utfördes i vatten Qualhet Laboratoriet för ekosystemvetenskap och Management, University of Wyoming. CuO-NP-syntes följt förfarandet enligt Martinson och Reddy (2009) 11.
3. Behandling av PBW med CuO-NP
- Tillsätt 50 mg (1 mg / ml) av CuO-NP till en 50 ml koniska rör följt av 50 ml PBW. Försegla röret och omsattes under 30 min på en bänk orbitalskakare vid 250 varv per minut.
- Centrifugera provrör vid 250 xg under 30 min och filtrera sedan supernatanten med användning av ett 0,45 fim sprutfilter. Alter centrifugen hastighet och tid kan lita på nanopartikeln att säkerställa CuO-NP bli kompakt i centrifugröret.
4. Elementaranalys
- Bered Obehandlad (kontroll) och CuO-NP-behandlade PBW prover för elementaranalys enligt följande.
- Surgör alikvoter (40 ml) av CuO-NP-behandlade och obehandlade PBW med spårmetallkvalitet salpetersyra till ett pH av 2,0. Analysera försurade PBW portioner för katjoner genom induktivt coupled plasma-mass-spektroskopi (ICP-MS) såsom beskrivs i Reddy och Roth (2012) 13.
- Förbered unacidified alikvoter (20 ml) av CuO-NP-behandlade och obehandlade PBW och analysera unacidified alikvoter för anjoner med jonkromatografi (IC), såsom beskrivs i Reddy och Roth (2012) 13.
OBS: Portioner analyserades genom Wyoming Department of Agriculture analytiska tjänster, Laramie WY 82070. En beskrivning av IC och ICPMS förfarande kan hittas i Reddy och Roth, (2012) 13.
5. Beredning av cellodlingsmedia Använda PBW
- Använd två kontroll (EMEM-1x och RO + media) och åtta PBW provmedielösningar (fyra koncentrationer vardera av obehandlat PBW och CuO-NP-behandlade media) i studierna lönsamhets. Översikter av lösningarna är enligt följande:
- För EMEM-1x kontroll, köpa Eagles minimala essentiella medium (EMEM-1x) med L-glutamin och natriumbikarbonat redan lagts. Lägg fetalt bovint serum (FBS) Och antibiotika enligt tillverkarens instruktioner.
OBS: EMEM-1x köps utspädd till lämplig koncentration för celltillväxt och innehållande L-glutamin och natriumbikarbonat. EMEM-1x kräver tillsats av fetalt bovint serum (FBS) och ett antibiotikum blandning av penicillin och streptomycin (50 lU / ml penicillin och 50 | ig / ml streptomycin). EMEM-1x används som en kontrollmedia eftersom det är tillverkarens rekommenderade tillväxtmedia för båda celltyper som används i denna studie. Koncentrerad EMEM-10x späds med RO vatten från anläggningen eller obehandlat eller CuO-NP-behandlade PBW att producera testlösningar. Koncentrerad EMEM-10x när de köps inte innehåller L-glutamin eller natriumbikarbonat så dessa tillsättes utöver den fetalt bovint serum (FBS) och ett antibiotikum blandning av penicillin och streptomycin. - När det gäller kontrolllösningen RO använda RO vatten som samlats in från ISR anläggningen. Använd samma protokoll som PBW testmedier bara ersätta 100% RO water från ISR anläggningen i stället för PBW. Att späda ut den obehandlade och CuO-NP-behandlade brukslösning RO eller ultrarent vatten från laboratoriet.
- Späd obehandlad PBW i fyra testkoncentrationer före blandning med cellodlingsmediakomponenter. Förbered fyra olika koncentrationer av obehandlade PBW lösningar genom att blanda obehandlat PBW RO (från laboratoriet) i följande kombinationer: 100% (ren PBW + ingen RO vatten), 75% (187,5 ml PBW + 62,5 ml RO vatten), 50% (125 ml PBW + 125 ml RO vatten) eller 25% (62,5 ml PBW + 187,5 ml RO vatten).
- Späd CuO-NP-behandlade PBW i fyra testkoncentrationer före blandning med cellodlingsmediakomponenter. Förbered fyra olika koncentrationer av CuO-NP-behandlade PBW lösningar genom att blanda PBW (förbehandlad med 1 mg / ml CuO-NP under 30 minuter) med RO (från laboratoriet) i följande kombinationer: 100% (ren CuO- NP-behandlade PBW + nr RO-vatten), 75% (187,5 ml CuO-NP-behandlade PBW + 62,5 ml RO-vatten), 50% (125ml CuO-NP-behandlade PBW + 125 ml RO vatten) eller 25% (62,5 ml CuO-NP-behandlade PBW + 187,5 ml RO vatten).
- För EMEM-1x kontroll, köpa Eagles minimala essentiella medium (EMEM-1x) med L-glutamin och natriumbikarbonat redan lagts. Lägg fetalt bovint serum (FBS) Och antibiotika enligt tillverkarens instruktioner.
- Bered 250 ml RO + media, obehandlad PBW + media och CuO-NP-behandlade PBW + mediekoncentration genom att tillsätta 25 ml koncentrerad EMEM-10x till 190 ml av 100% RO och 100%, 75%, 50% eller 25% av de förgjorda obehandlade eller CuO-NP-behandlade PBW koncentrationer skapade i steg 6.1.3 och 6.1.4.
- Justera pH-värdet hos varje lösning till 7,4 med NaOH eller HCl.
- Tillägg varje koncentration av obehandlade och CuO-NP-behandlade PBW liksom RO + media med följande standardkomponenter: 25ml (10%) fetalt bovint serum (FBS), 2,5 ml L-glutamin, 0,55 g NaHCOs 3 och 1,25 ml Pen / Strep (50 lU / ml penicillin och 50 | ig / ml streptomycin).
- Justera osmolalitet av varje koncentration av obehandlat PBW + media, CuO-NP-behandlade PBW + media och RO + media till 290-310 mOsm / kg genom att tillsätta RO-vatten och mäta med hjälp av en osmometer.
- Filtrera varje lösning med användning aven 0,22 ^ m vakuumfilterenhet, och förvara vid 4 ° C.
OBS: På grund av små variationer i mängden av RO vatten som används för att justera osmolaliteten, varierar slutliga mediekoncentrationer inom en 5% intervall, med obehandlad PBW + mediekoncentrationer på 56%, 44%, 29% och 16,5% och CuO-NP behandlade PBW + mediekoncentrationer vid 53%, 45%, 30% och 17%.
6. Cellviabilitet
OBS: Med tanke på att njurar och lever är målorgan av tung metal toxicitet, anställa odlade humana embryonala njur (HEK293) celler (HEK) och mänsklig hepatocellulär cancer (HepG2) celler (Hep) testmetoder 24-26.
- Förbered en kultur av HEK och HEP celler 2-3 dagar innan plätering av 96-brunnsplattor som används i experimentet enligt tillverkarens anvisningar.
- Mät cellviabiliteten med användning av 3- [4, 5-dimetyltiazol-2-yl] -2, 5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) analys.
OBS: MTT analysprotokoll ändrades från Meerloo et al., (2011) 27.- Skaffa MTT i pulverform. Lägg fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att ge en stamkoncentration av 50 mg / ml. Rör lösningen under 2 timmar och sedan filtrera med ett 0,45 um sprutfilter och delprov i 1,5 ml fryssäkra rör. Skydda rören från ljus och förvaras vid 4 ° C.
- Ta HEK och HEP celler från sina odlingsskålar med hjälp av trypsin, centrifugera vid 1000 xg under 5 minuter och dekantera trypsin. Lägg 5 ml PBS och blanda celler för att erhålla en enda cell lösning. Sedan gäller 20 pl av en enda cell lösningen till en hemocytometer för att erhålla en celltalet per milliliter lösning. Centrifugera cellerna igen vid 1000 xg under 5 minuter och dekantera PBS användes för att skölja cellerna. Tillsätt lämplig mängd EMEM-1x att justera koncentrationen av celler till 500 celler / 100 | il (100 | j, l / brunn).
- Fyll omkrets brunnarna i plattan med 200 | j, l PBS för att styra för avdunstning.
- Seed cells vid en densitet av 500 celler / brunn tillsätta 100 | il till varje brunn, med undantag av de omkretsbrunnar (som inte är pläterade med celler).
OBS: Seedning täthet för HEK och HEP celler bygger på experimentella tillväxtkurvor som gör toppen av tillväxten att ske runt dagar 4-5. Förbered tillväxtkurvor för alla cellinjer att uppskatta såddtäthet. - Inkubera cellerna under 24-h vid 37 ° C så att de kan återhämta sig (formulär snäva vidhäftningar till plattan) innan utförande av baslinje MTT avläsningar av celldensitet.
- Utför baslinjen MTT avläsningar av celldensitet genom att ta bort sådd media från den första kolumnen (exklusive omkrets) och tillsätta 100 pl MTT (5 mg / ml i media) till brunnarna under 1 timme.
- Efter en timme, avlägsna MTT och tillsätt 100 | il dimetylsulfoxid (DMSO) för att upplösa MTT-formazan som produceras av levande celler (20 min).
- Läs den optiska densiteten (OD) för den första kolonnen vid en absorptionsvåglängd av 570 nm för erhållande av en basline läsning.
- Använd baslinjen avläsningar för att se till alla plattor såddes korrekt och att cellerna konsekvent växer mellan plattorna. Ta bort DMSO från kolonnen som testas innan inkubation under nästa 24 timmar.
OBS: Om DMSO är kvar i plattan över natten det drar fukt från angränsande kolumn, vilket orsakar en minskning av medievolymen.
- Använd baslinjen avläsningar för att se till alla plattor såddes korrekt och att cellerna konsekvent växer mellan plattorna. Ta bort DMSO från kolonnen som testas innan inkubation under nästa 24 timmar.
- Värm testlösningar (dvs EMEM-1x, RO, obehandlad PBW och CuO-NP-behandlade PBW medielösningar) till 37 ° C i ett vattenbad.
- Ta bort sådd media från resten av plattan (exklusive omkretsen eller första kolumnen som användes för baslinjen läsning) och ersattes med 100 pl EMEM-1x, RO + media, obehandlad PBW + mediekoncentrationer eller CuO-NP behandlad PBW + mediekoncentrationer (en lösning per platta). Inkubera cellerna i deras testkoncentrationer eller kontrollösningar för totalt sju dagar (dag 2-8).
OBS: Det 10 plattor totalt: 1 EMEM-1x, 1 RO + media, 1 av varje obehandlad PBW + mediakoncentration (56%, 44%, 29% och 16,5%) och en platta av varje CuO-NP-behandlade PBW + mediakoncentration (53%, 45% , 30% och 17%) per experiment per cellinje. - Varje dag efter baslinjen MTT läsning, ta bort kontroll- och testlösningar (som anges i anmärkningen under 6.11) från nästa kolumn av deras respektive platta (t.ex. Dag 2 test- och kontrollmedier tas bort från rad 3, brunnar BG, Dag 3: rad 4 brunnar BG etc.) och upprepa MTT protokoll som beskrivs i steg 6,7-6,9 ovan.
- Upprepa protokoll varje dag under sju dagar. Medelvärdet OD resultaten för varje rad (6 brunnar) och redovisas mot tiden för att generera en sju-dagars tillväxtkurva.
- För att bedöma effekten av koppar kelering på cellviabilitet i CuO-NP-behandlade PBW + media följer samma procedur som ovan, förutom tillsätt 100 iM D-penicillamin att styra och testlösningar innan du lägger till lösningar på deras respektive plattor. Utföra data anallys med hjälp av vetenskapliga grafiska program.
7. geokemisk modellering
- Ladda ner Visual MINTEQ version 3.0 / 3.1 ett gratisprogram från följande webbplats http://www2.lwr.kth.se/English/Oursoftware/vminteq/ .
OBS: Visual MINTEQ är ett gratisprogram kemisk jämviktsmodell för beräkning av metall artbildning, löslighetsjämvikter, sorption mm för naturliga vatten. Dessutom används för att förutsäga jon artbildning, jon aktiviteter, jonkomplex och mättnad index som är jämfört med koncentrationen av element före och efter behandling (masspektroskopi resultat) att undersöka möjliga mekanismer för elementet bort 28. - Öppna programmet och mata in spektroskopi uppgifter mass från steg 4, inklusive pH, alkalinitet och koncentrationerna av olika element, till programmet.
OBS: Eftersom grundvattnet oxideras under in situ-uranium utvinningsprocessen, använda oxiderade arter av arsenik, vanadin och uran för inmatning.
8. hämmande koncentration 50 (IC 50)
- Beräkna IC 50 för de obehandlade och CuO-NP-behandlade PBW + mediekoncentrationer genom att först medelvärdes livskraft (genomsnitt OD) på dag 5 av tre separata körningar.
- Subtrahera dag fem lönsamhets genomsnitt av de obehandlade och CuO-NP-behandlade PBW + mediekoncentrationer från dag fem lönsamhets medelvärden av EMEM-1x för att beräkna lönsamhetsskillnader. Sedan dela lönsamhets skillnader genom den genomsnittliga lönsamhet på dag 5 i EMEM, och multiplicera med 100 för att få procent inhibition.
- Subtrahera procent inhibition från 100 (EMEM-1x livskraft) för att få procent lönsamhet för varje obehandlade och CuO-NP-behandlade PBW + mediekoncentration.
- Ingång till vetenskapliga grafiska program genom att ställa EMEM-1x vid en koncentration av en och en procent livskraft 100; omvandla alla koncentrationer i loggenskala (X = Log (X)) och utföra icke-linjär regression med minsta kvadratanpassning analys.
9. Dataanalys
- Jämför halter av element i obehandlade och CuO-NP-behandlade PBW med en två-tailed, parat, Student T-test.
- Beräkna ytorna under kurvan (AUC) med hjälp av tillväxt kurvdata samlats in under sju dagar och analysera variansen med upprepade mätningar variansanalys (ANOVA), följt av Tukeys post hoc-jämförelse mellan alla grupper (n = 3).
- Beräkna IC 50 genom att använda data från dag fem av tillväxtkurvan för både obehandlade och CuO-NP-behandlade PBW + medielösningar (som beskrivits ovan). P-värden av <0,05 anses betydande.
OBS: För statistisk analys, var masspektroskopi värden på halva detektionsgränsen tilldelats joner koncentrationer nivåer under denna gräns 29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PBW komponentkoncentrationer och pH i obehandlat och CuO-NP-behandlade PBW redovisas i tabell 1. Martinson och Reddy (2009), rapporterade att den punkt noll ansvarar för CuO-NP uppskattas till 9,4 ± 0,4. Med tanke på att pH-värdet hos PBW var 7,2-7,4, under dessa förhållanden, donerar vatten protoner till CuO-NP, vilket gör att nanopartikelytan som skall positivt laddad möjliggör adsorption av negativt laddade ämnen. CuO-NP-behandlings avlägsnade prioriterade föroreningar från PBW, inklusive arsenik, selen, uran och vanadin (tabell 1). Medel arsenik koncentrationen reducerades med 87% [0,0175-0,002 mg / I (två-tailed parat t-test, p <0,0001)]. CuO-NP-behandling minskade också signifikant selen (30%), uran (78%), vanadin (92%), och fosfat (85%) (p <0,05).
Speciation modelleringsresultat, som redovisas i tabell 2, stöder de analytiska resultat: 99% av tilltal löst arsenik i PBW är närvarande som Haso 4 2- och H 2 Aso 4 - och 94% av den totala löst selen i PBW är närvarande som SEO 4 2-. Dessa arter är negativt laddade, därav förmåga att adsorbera till CuO-NP. Speciation modellering förutspådde att 99% av vanadin arter i PBW är negativt laddade, även främjar adsorption till CuO-NP. Men artbildning modellering förutspådde bara 35,5% av uranet arter negativt laddade, vilket skulle begränsa adsorption till CuO-NP. Analys av mättnadsindex förutspådde att inga arter av arsenik-, selenium-, uranium- eller vanadinhaltiga mineraler var nära mättnad (dvs. mineral nederbörd) nivåer, stödja adsorption till CuO-NP, jämfört med nederbörd.
För att bedöma om förväntade koncentrationerna av prioriterade föroreningar är i media tillverkad av obehandlad och CuO-NP-behandlade PBW prover av outspätt kontrollmedier (EMEM-1x), 56%obehandlade PBW + media och 53% CuO-NP-behandlade PBW + media analyserades med ICP-MS. Outspädd kontroll media (EMEM-1x) är en kommersiell produkt som levereras med L-glutamin och natriumbikarbonat (pre-ivering). Koppar och selen koncentrationer i kontroll EMEM-1x var något förhöjda som förväntat eftersom de är viktiga för celltillväxt, men arsenik, uran och vanadin var försumbar, redovisas i tabell 3. Preliminära studier visade att arsenik, var selen och vanadin koncentrationer minskas med CuO-NP behandling och att minskningen var representerad i de koncentrationer i CuO-NP-behandlade PBW + media. Den uppmätta koncentrationen av uran i CuO-NP-behandlade PBW + media minskat jämfört med obehandlad PBW, och denna minskning var mer uttalad än vad som förutspåtts av Visual Mintec v.3 modellering. Kopparnivåer ökade i CuO-NP-behandlade media som förväntat.
För att bestämma förmågan hos CuO-NP behandling för att förbättra cytotoxiciteten hos PBW på däggdjursceller, var lönsamheten bedöms i celler som utsätts för lösningar av PBW + media före och efter CuO-NP behandling. Båda HEK (Figur 1A) och HEP (Figur 1B) celler exponerades för olika koncentrationer av obehandlat eller behandlat PBW + medier för upp till sju dagar. I celler som odlats i obehandlade PBW + media, var viabiliteten nedsatt på ett koncentrationsberoende sätt, medan CuO-NP-behandling förbättrade cellulär viabilitet i båda cellinjerna. Den integrerade AUC i figur 1C visar att HEK celler odlade i CuO-NP-behandlade PBW + media var mer lönsamt jämfört med obehandlad PBW + media vid de tre högsta koncentrationerna (29%, 44% och 56%). HEP celler visade något annorlunda livskraft: endast de två högsta koncentrationerna av obehandlad PBW + media (44% och 56%) visade försämrad lönsamhet jämfört med CuO-NP-behandlade PBW + media (Figur 1D). De mer utspädda koncentrationer av PBW var mindre giftigt för HEP celler, och cellviabiliteten påverkas mindre av behandlingen. Denlivskraft både HEK och HEP celler odlade i 16,5% obehandlat PBW + media var inte signifikant från celler odlade i 53% CuO-NP-behandlade PBW + media (p <0,05). Således verkade CuO-NP behandling för att förbättra cytotoxiciteten hos PBW, med lönsamhet nära kontrollnivåer. Som diskuterats ovan, är CuO-NP behandling av PBW samband med en ökning av kopparkoncentrationer. Ökningen var väntad, baserat på tidigare resultat från Reddy och Roth (2012), där de använde CuO-NP att ta bort arsenik från grundvattnet. Är Ökningen av koppar beroende på det specifika vattenkemi av PBW, men förblev lägre än EPA MCL på 1,3 mg / L. Det var dock viktigt att utesluta att ökningen av kopparhalterna har bidragit till förbättrad lönsamhet (dvs vid sidan av eller i stället för minskningen av prioriterade föroreningar). Följaktligen var koppar kelator D-penicillamin sattes till EMEM-1x kontroll, RO + mediakontroll, obehandlade och CuO-NP-behandlade PBW + medialösningar, och esv MTT viabilitet tillväxtkurva genererades, såsom beskrivits ovan. Koppar kelering inte signifikant påverka lönsamheten för antingen HEK eller HEP celler inkuberade i RO + mediakontroll, obehandlade och CuO-NP-behandlade PBW + media (resultat ej visade).
Den halv maximal hämmande koncentration (IC 50) beräknades från dag fem tillväxt HEK och HEP celler odlade i obehandlad PBW + media (Tabell 4A) och CuO-NP-behandlade PBW + media (tabell 4B). För HEK-celler som odlas i obehandlad PBW + media, var IC 50 värde 1.264 (log% PBW). Således skulle de obehandlade PBW + media måste spädas till 18,38% för att komma till en 50% minskning av lönsamheten. För HEK-celler som odlas i CuO-NP-behandlade PBW + media, var IC 50 värdet 2,744 (log% PBW). Detta resultat tyder på att teoretiskt cytotoxiciteten av lösningen reducerades till den grad att behandlas PBW + media skulle behöva koncentreras med 500% (log% PBW = 2,744) för att producera en liknande 50% deveck i lönsamhet. För Hep celler odlade i obehandlad PBW + media, IC 50 var 1.243 (log% PBW). Detta skulle kräva en utspädning av PBW + media till 17,5% för att producera en 50% minskning av lönsamheten. I motsats härtill för HEP celler odlade i CuO-NP-behandlade PBW + medier, IC 50 var 5,327 (log% PBW). Detta värde troligen var så stor, eftersom cellernas viabilitet i CuO-NP-behandlade PBW + media var inte signifikant från celler odlade i EMEM-1x (kontroll). Ljust fältavbildning, som visas i fig 2, av både HEK och HEP cellulär tillväxt på dag fem. Cellantal och fastsättning i CuO-NP-behandlade PBW + media (Figur 2E, F) förbättrades jämfört med obehandlad PBW + media (Figur 2C, D).
Figur 1: Tillväxtkurvor. Tillväxtkurvor användes för att bedöma lönsamhet och gTILLVÄXT av kulturerna under behandlingen. Tillväxtkurvor för HEK (A) och HEP (B) celler odlade i fyra utspädningar av PBW + media jämfört med 53% CuO-NP-behandlade PBW + medium (övre fält). EMEM-1x kontroll (EMEM) 
, RO 
, 53% CuO-NP-behandlad 
, 16,5% obehandlat PBW 
29% obehandlad PBW 
, 44% obehandlat PBW 
, 56% obehandlad PBW 
. Area under kurvan (AUC) analys av HEK (C) och HEP (D) 7 dagars tillväxt kurvdata (lägre paneler). * P <0,05 jämfört med EMEM kontroll, #p <0,05 jämfört med kontroll RO, §p <0,05 i jämförelse med 53% CuO NP-behandlade PBW-media. (Jämfört med användning av en två-tailed ANOVA medTukeys post hoc-analys, n = 3.)
Figur 2:. Cell morfologin före och efter CuO-NP-behandling ljusfältsmikroskopi (20X) av HEK (vänstra kolumnen) och HEP (höger kolumn) celler vid dag 5, odlade i: EMEM-1x kontroll (EMEM) (A, B ), var 56% obehandlad PBW + media (C, D) och 53% CuO-NP-behandlade PBW + media (E, F) används för att undersöka cellmorfologin. HEK och HEP celler odlade i EMEM-1x kontroll (EMEM) (A, B) visar friska, nära-konfluent tillväxt. HEK och HEP celler odlade i obehandlad PBW + media har minskat siffror och visas fristående (C, D). HEK och HEP celler odlade i CuO-NP-behandlade PBW + media visar bättre fäste och hälsosamma, mer sammanflytande celler (E F).
| Element (mg / I) | Vanlig, St. Dev. & Signifikans | ||
| Före behandling | Efter behandling | ||
| Arsenik | 0,018 ± 0,001 | 0,002 ± 0,0 | *** |
| Selen | 1,8 ± 0,07 | 1,3 ± 0,05 | ** |
| Koppar | 0,0015 ± 0,001 | 0,93 ± 0,43 | * |
| Kalcium | 102 ± 82 | 106 ± 15 | |
| Strontium | 3,3 ± 1,1 | 1,5 ± 0,4 | * |
| Magnesium | 44 ± 2,1 | 47 ± 1,7 | |
| Natrium | 610 ±; 0,0 | 627 ± 27 | |
| Uran | 0,98 ± 0,03 | 0,21 ± 0,03 | *** |
| Barium | 0,037 ± 0,02 | 0,019 ± 0,01 | |
| Kalium | 12 ± 0,0 | 12 ± 0,8 | |
| Kisel | 12 ± 0,7 | 12 ± 0,5 | |
| Vanadin | 1,3 ± 0,07 | 0,1 ± 0,02 | *** |
| Fosfat | 0,35 ± 0,07 | 0,05 ± 0,0 | *** |
| Sulfat | 805 ± 21 | 807 ± 15 | |
| Konduktivitet | 3125 ± 143 | 3190 ± 62 | |
| pH | 7,31 ± 0,09 | 7,36 ± 0,05 | |
Tabell 1:. Analys av katjoner och anjoner före och efter CuO-NP behandling Genomsnittlig elementet koncentrationer före och efter behandling med CuO-NP. Signifikans mellan koncentrationen av CuO-NP-behandlade och obehandlade PBW betecknas som * = p <0,05, ** = p <0,01 och *** = p <0,001. En tom cell betyder ingen signifikant skillnad. Kloridhalter varierade mellan 46,5 ± 0,707 och 55,25 ± 8,180. Aluminium, bor och molybden Halterna var låga och visade ingen signifikant förändring på grund av CuO-NP behandling. Manganhalter var inte konsekvent.
| Komponenter | % Av total koncentration | Arter |
| Arsenik | 58,7 | Haso 4 2- |
| 410,2 | H 2 Aso 4 - | |
| Uran | 64,1 | Ca 2 UO 2 (CO3) 3 (aq) |
| 32,2 | CaUO 2 (CO3) 3 2- | |
| 0,03 | UO 2 (CO3) 2 2- | |
| 3,5 | UO 2 (CO3) 3 4- | |
| 0,09 | Ca 2 UO 2 (CO3) 3 (aq) | |
| 0,02 | CaUO 2 (CO3) 3 2- | |
| Selen | 94,3 | SeO 4 2- |
| 5,6 | CaSeO 4 (aq) | |
| Vanadin | 2,1 | HVO 4 2- |
| 95,7 | H 2 VO 4- | |
| 2,1 | H 2 V 2 O 7 2- | |
| 0,01 | HV 2 O 7 3- | |
| 0,01 | V 4 O 12 4- |
Tabell 2: Art modellering med hjälp av Visual MINTEQ ver. 3.0 programvara. Visual MINTEQ ver. 3,0 programvara (Kungliga Tekniska Högskolan, Valhallavägen, Sverige) användes för att beräkna metallspecieringen av PBW komponenter som anges i tabell 1. (Aq) = vatten i motsats till den fasta formen av denna art.
| EMEM Kontroll | Obehandlad | ||
| PBW | PBW + medier | ||
| Arsenik | 0,003 ± 0,0 | 0,017 ± 0,0 | 0,010 ± 0,001 |
| Koppar | 0,01 ± 0,0 | 0,0015 ± 0,001 | 0,018 ± 0,0 |
| Selinium | 0,013 ± 0,002 | 1,75 ± 0,07 | 1,15 ± 0,06 |
| Uran | 0,00015 ± 0,0 | 0,975 ± 0,03 | 0,71 ± 0,01 |
| Vanadin | 0,0015 ± 0,0 | 1,25 ± 0,07 | 0,785 ± 0,007 |
| CuO NP-behandlad | |||
| PBW | PBW + medier | ||
| Arsenik | 0,0022 ± 0,001 | 0,0015 ± 0,0 | |
| Koppar | 0,926 ± 0,4 | 0,81 ± 0,0 | |
| Selinium | 1,25 ± 0,05 | 0,855 ± 0.0.02 | |
| Uran | 0,208 ± 0,03 | 0,45 ± 0,01 | |
| Vanadin | 0,102 ± 0,02 | 0,0795 ± 0,01 | |
Tabell 3:. Halterna av föroreningar i media koncentrationerna av prioriterade föroreningar (mg / L) i EMEM-1x kontroll (EMEM), obehandlad PBW, CuO-NP-behandlade PBW, obehandlat PBW + media och CuO-NP-behandlade PBW + media efter tillsats av media komponenter (n = 3) bedömdes att säkerställa förändringar i föroreningskoncentrationen till följd av behandlingen var representerade i obehandlade PBW + media och CuO-NP-behandlade PBW + media tillämpas på avbrytls.
| En Obehandlad PBW + Medier | ||
| Koncentrationerna av Obehandlad PBW (log X) | % Viabilitet (HEK celler) | % Viabilitet (Hep-celler) |
| EMEM | 100 | 100 |
| 16,5% (1,217) | 51,4 | 50,8 |
| 29% (1.462) | 39 | 33,3 |
| 44% (1.643) | 19,3 | 14,7 |
| 56% (1,748) | 14,5 | 9,4 |
| IC 50 Logga [PBW] | 1,264 | 1,243 |
| B CuO-NP-behandlade PBW + Media | ||
| Koncentrationerna av CuO-NP-behandlade PBW (log X) | % Viabilitet (HEK celler) | % Viabilitet (Hep-celler) |
| EMEM | 100 | 100 |
| 17% (1.230) | 86,7 | 119,8 |
| 30% (1.477) | 75,8 | 86,7 |
| 45% (1.653) | 81 | 92,4 |
| 53% (1,724) | 70,3 | 97,5 |
| IC 50 Logga [PBW] | 2,744 | 5,327 |
Tabell 4: Beräkning av IC 50. IC 50 representerar koncentrationen av obehandlad PBW + media eller CuO-NP-behandlade PBW + media som krävs för en 50% hämning av lönsamheten. Den procentuella viabilitet på dag 5 för HEK och HEP celler exponerade för utspädningar av obehandlad PBW + media (A) eller CuO-NP-behandlade PBW + Medier (B) användes för att beräkna den halva maximala inhiberande koncentration (IC 50).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tidigare studier har rapporterat att CuO-NPS bort arsenik från grundvatten 11,13,30,31. Denna studie stöder dessa tidigare resultat och rapporterar att CuO-NP avlägsna ytterligare föroreningar från PBW också. Denna studie bekräftar också tidigare rapporter om att CuO-NP är effektiva på arsenik borttagning, trots närvaron av andra föroreningar och potentiella konkurrerande joner 11. Speciation modellering förutsade att 97% av vanadin arter i PBW är negativt laddade, vilket möjliggör adsorption till CuO-NP, och grupphanterings avlägsnades 92% av vanadin.
Detta är den första studie för att undersöka effekterna av att ta bort vissa föroreningar från PBW använder CuO-NP, och sedan bedöma förändringarna i cytotoxicitet i samband med borttagningen. Resultaten visar att undersöka förändringarna i cytotoxicitet av komplexa blandningar med användande av en in vitro-metod kan vara möjligt, men dessa metoder är inte utan begränsningar. PBW kunde inte användas fUll styrka på cellerna, eftersom att överleva, odlade celler kräver ett definierat tillväxtmedium och specifik osmolalitet. PBW + media kunde heller inte användas på cellerna utan pH-justering. PH-värdet hos PBW var 7,31 före och 7.36 efter behandling dock; tillsatsen av tillväxtmediekomponenter reducerade pH till ca 6,8, beroende på utspädning. Ph justering är ett normalt steg vid framställning av cellodlingsmedier men; justering av pH hos PBW + medier kan ha förändrat de molekylära interaktionerna av elementet arter med mediakomponenter. Obehandlad och CuO-NP-behandlade PBW kombinerades med koncentrerad EMEM-10X tillväxtmedier i olika proportioner för att erhålla testlösningar (pbw + media). ICP-MS-analys utfördes på testmedier för att kontrollera att halterna av metaller i betydande grad av CuO-NP-behandling (arsenik, koppar, selen, uran, vanadin) var på förväntade koncentrationer efter utspädning av mediakomponenter och osmolalitet justering. Minskningeni arsenik, selen och vanadin efter CuO-NP-behandling avspeglas i koncentrationsskillnaderna mellan obehandlat PBW + media och CuO-NP-behandlade PBW + media. Uran koncentrationer är högre i CuO-NP-behandlade PBW + media än förutspått. ICP-MS-data (Tabell 1) tyder på att mer uran togs bort från PBW under CuO-NP behandling än väntat genom modellering. Speciation modellering (tabell 2) förutspådde att vid pH 7,3, är endast 35,5% av arterna uran negativt laddade. Modellen förutspår att större arter uran, kalcium AUC karbonat (Ca 2 UO 2 (CO 3) 3), är neutral.
Den observerade 78% borttagande av uran var sannolikt på grund av en kombination av uran adsorption och utfällning (såsom ett kalcium AUC karbonatmineral). Baserat på den geokemisk modellering, är den procentuella andelen av uran avlägsnas genom adsorption mindre än beräknat som medger en högre koncentration i CuO-NPbehandlad PBW + media. Mekanismen för avlägsnande av uran av CuO-NP-behandling är oklar och kräver ytterligare utredning. En ökning av koncentrationen av kalcium, kalium och magnesium förväntades när PBW sattes till EMEM-10x dock; CuO-NP-behandling gav inte en signifikant förändring i dessa element så ingen skillnad sågs i obehandlade vs. CuO-NP-behandlade PBW + media. Tekniken att kombinera den faktiska miljö med mediakomponenter lyckades representerar förändringar ses i elementhalterna på grund av behandling; emellertid den oxiderade karaktär PBW begränsade hur PBW + media skulle kunna göras. I ett försök att öka den maximala koncentrationen av elementen i testmedier, var pulveriserad cellodlingsmedia ursprungligen blandas med obehandlad och CuO-NP-behandlade PBW att göra PBW + media. De pulveriserade medier gav ofta i utfällning av kalciumsalter och det ökade osmolaliteten av PBW + media som krävde en större utspädning med RO vatten, producerar koncenttrationer nära med de som erhålles med flytande 10x media. Dessa frågor är mest sannolikt PBW specifika grund av dess oxidativa tillstånd och kan inte vara ett problem med andra mindre känsliga blandningar.
MTT-analysen valdes för att bedöma cytotoxiciteten eftersom det är en erkänd standard med hög genomströmning analys som utvärderar den allmänna hälsan hos celler genom att mäta mitokondrie aktivitet. Denna metod har fördelar och nackdelar. Den 96-brunnsformat är användbara för att erhålla multipla datapunkter men; majoriteten av cellerna vid dag 5 var ohälsosamma ser, avrundade och inte längre fastsatt vid plattan. Fotona i fig 2 togs före mediet avlägsnades med användning av en vakuum; suga bort medierna, och sedan tillsätta MTT-lösning kan ha tagit bort lös celler eller fristående dåligt vidhäftande celler, vilket bidrar till den totala platå MTT signalen efter dag två ses med obehandlad PBW. Antagandet är att flytande celler är döda eller döende och ondast bifogade cellerna bedöms med användning av denna metod. Det är också viktigt att beakta de begränsningar av MTT-analysen med avseende på studier med nanopartiklar.
Tidigare studier har rapporterat att när de appliceras direkt på odlade celler kan nanopartiklar har inneboende toxicitet, utanför deras bas kemiska egenskaper, beroende på deras unika fysiska egenskaper såsom storlek och form 32,33. I denna studie har vi inte tillämpa CuO-nationella parlamenten direkt på cellerna. Istället, exponerades cellerna för PBW som tidigare hade behandlats med CuO-NP, centrifugerades för att avlägsna huvuddelen av CuO-NP och filtrerades sedan två gånger för att ta bort mer CuO-NP innan PBW användes för framställning av PBW + medier. MS Resultaten visade en ökning av koppar efter behandling. Detta kan vara kopparjoner som löstes från nanopartiklarna under behandling eller CuO-NP som kan ha passerat genom centrifugering / filtreringssteg för att stanna kvar i det behandlade PBW used att göra PBW + media. CuO-NP varierar i storlek från 12 till 18 nm med en BET-uppmätt ytarea av 85 ± 1 m 2 / g 11 men är kända för att aggregera och baserat på minimal ökning av kopparkoncentrationen i det behandlade PBW, de flesta av koppar oavsett av källan avlägsnas efter centrifugering och filtrering. Visuell bekräftelse av förbättrad cellhälsa och konfluens stöder MTT-analysen resultaten av förbättrad viabilitet på grund av CuO-NP-behandling av PBW (figur 2). Framtida studier med andra metoder kan utvärdera (eller karakterisera) liknande störande effekter orsakade av CuO-NPS.
Humana embryonala njur (HEK 293) och Human hepatocellulär cancer (Hep G2) celler valdes för toxicitetstester. Dessa är vanliga cellinjer som är kliniskt relevant för heavy metal organtoxicitet 24,25,34-40. En låg såddtäthet användes för MTT-analyser. Celler såddes vid 500 celler / brunn, fick återhämta sigunder 24 h, och därefter exponeras för testmediet. Den låga sådd densitet var nödvändigt för att uppnå en tillväxtkurva med en log-fas runt dag 5, innan han blev över sammanhängande och stilla i dag 6 eller 7. Chakraborty et al. (2010) rapporterade att i en studie av kadmium toxicitet på odlade njure proximala tubuli-celler (PTC), konfluens och spridning status (prolifererande kontra vilande) påverkas svaret på kadmiumexponering: sub-sammanflytande celler som förökar visade mer cytotoxicitet än sammanflytande (vilande) celler. HEP och HEK-celler som exponerats för PBW vid ett högre koncentrationer (större konfluens) liknande de som används för annan analys (resultat ej visade) visade inte de robusta förändringar i morfologin ses med MTT-analysen. Det krävs ytterligare utredning av förändringar i cytotoxicitet med hjälp av icke-vidhäftande cellinjer eller protokoll som skördar och samlar alla celler (t.ex. flödescytometri).
En annan begränsning av MTT-metoden i studier using nanopartiklar är att vissa typer av nanopartiklar kan störa cellnäring. Cellodlingsmedia innehåller typiskt tillsatta proteinkällor, såsom fetalt bovint serum (FBS), för att komplettera celltillväxt. Studier har visat att metalloxid nanopartiklar kan utarma viktiga tillväxtkomponenter i FBS, på grund av den ökade absorptionskapacitet av nanopartiklar. Metalloxidnanopartiklar har visat att länka till FBS genom en interaktion med kalcium 41. Beroende på lösningens pH, kan metallnanopartiklar bära en positiv eller negativ laddning. CYTOTOXICITET studier har visat att metallnanopartiklar tillsätts till cellodlingsmedia adsorbera katjoner, inklusive Ca2 +, och sedan ta bort FBS / serumalbumin genom bindning av NP-Ca2 + komplexet till kalciumbindningsställen på proteiner i FBS. Detta minskar koncentrationen av Ca2 + och FBS från media, i huvudsak svälta cellerna och öka cytotoxiciteten skrivs nanoparticles 41. Dessutom, pre-exponering av nanopartiklar till FBS / Ca2 + belagda nanopartiklarna, minska deras cytotoxiska effekt. Men vi inte direkt utsätta media till CuO-NP. Dessutom, för att ingen signifikant minskning av Ca2 + koncentrationer observerades PBW efter behandling med CuO-NP, tyder på att ingen signifikant absorption av Ca2 + på CuO-NP priming dem binda med FBS. Emellertid är koncentrationen av kalcium i PBW tillräckligt hög att en nanopartikel-inducerade minskningen inte kan ha varit uppenbara. Det är fortfarande osannolikt att CuO-NP används i denna studie är att absorbera stora mängder kalcium under behandlingen, eftersom det inte fanns någon minskning av arsenik absorption kapacitet CuO-NP i PBW, som innehåller höga halter av kalcium jämfört med tidigare studier med grundvatten med en lägre kalciumkoncentrationer 13.
Data visar att CuO-NP bort arsenik, selen vanadin och uranium, är och detta i samband med förbättrad HEK och HEP cellviabiliteten i MTT-analysen. Mekanismen (s), genom vilken lönsamheten förbättras har ännu inte fastställts, men kan bero på avlägsnande av prioriterade föroreningar genom CuO-NP, bland andra mekanismer. Den aktuella studien visar också att standardcellodlingsmetoder kan användas för att bedöma effekten av en nanopartikel ISR vatten behandlingsmetod, potentiellt möjliggör en rad mekanistiska studier som skall slutföras, innan han flyttade till de mer kostsamma och tidskrävande in vivo djurstudier . Dessutom kan CuO-NP visa sig vara mer mångsidig för gruvprocesser och för behandling av metallblandningar än konventionella adsorbenter som oxider av aluminium, järn, titan och mangan, eftersom CuO-NP inte kräver pH-justering eller oxidation av vatten för arsenik avlägsnandet och CuO-NP avlägsna både arsenit och arsenat i närvaro av den konkurrerande anjoner fosfat, silikat och sulfat. Dessutom kan CuO-NP regenereras och åter-rosa, reduktionsmedel kostnader och mängden av förbrukade avfallshanterings biprodukter i behov av omhändertagande 12.
Potentiella begränsningar av MTT-protokollet inkluderar låg celldensitet vid tidpunkten för exponering, avlossning av celler och förlust av signal, cell svält och eventuell direkt exponering av cellerna till CuO-NP förändra MTT reaktivitet. Cell densitet och lösgör frågor skulle kunna åtgärdas genom att använda ett alternativt test såsom flödescytometri, vilket möjliggör högre sådd täthet samt insamling av alla celler (dvs, både flytande och bifogas). Cell svält frågor kan bedömas genom mätning av tillväxtfaktorkoncentrationer i media med jämna mellanrum under behandlingen. Framtida arbete kommer att inriktas på tillämpningen av det nuvarande protokollet till olika cytotoxicitetsanalyser som kommer att ta upp om det är möjligt CuO-NP exponering förändrad analysverksamhet, mätningar av cell svält under behandlingen och även testa förmågan hos CuO-NP att avlägsna contaminanätter och påverka cytotoxiciteten av andra typer av komplexa blandningar, såsom avfall från Superfund områden och avfallsdammar. Sådana studier skulle också ta itu med om de metoder som var stark i olika inställningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CuCl2 | Sigma | 203149 | |
| Borosilicate glass balls | VWR | 26396-639 | 6 mm |
| Nitric Acid | Fisher | A509-P500 | Trace metal grade |
| 0.45 μm syringe filter | Fisher | SLHA 033S S | |
| 10x EMEM | Fisher | BW12-684F | |
| Fetal Bovine Serum | ATCC | 30-2020 | |
| L-glutamine | Fisher | BP379-100 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| Penicillin/Streptomycin | ATCC | 30-2300 | |
| 0.22 μm vacuum filter unit | Fisher | 09-740-28C | |
| HEK293 | ATCC | CRL-1573 | |
| HEPG2 | ATCC | HB-8065 | |
| Trypsin | Sigma | SV3003101 | |
| MTT | Sigma | M2128 | |
| D-penicillamine | Fisher | ICN15180680 | |
| 96-well plates | Fisher | 07-200-92 | |
| DMSO | Fisher | D12814 | |
| Spectra Max 190 | Molecular Devices | ||
| Visual MINTEQ version 3.0 | KTH Royal Institute of Technology | ||
| ICP-MS | Agilent | Details of instruments, models and detection limits were published in Reddy et al., 2013. | |
| IC DIONEX DX 500 | Dionex | Details of instruments, models and detection limits were published in Reddy et al., 2013. | |
| VWR Incubator | VWR |
References
- What is the status of the U.S. nuclear industry? Washington (DC): U.S. Energy Information Administration (US). , Available from: http://www.eia.gov/energy_in_brief/article/nuclear_industry.cfm (2014).
- International Energy Outlook. Washington (DC): U.S. Energy Information Administration (US). , Available from: http://www.eia.gov/forecasts/archive/ieo11/pdf/0484%282011%29.pdf (2011).
- Uranium Marketing Annual Report. Washington (DC): U.S. Energy Information Administration (US). , Available from: http://www.eia.gov/uranium/marketing/ (2014).
- Domestic Uranium Production Report. Washington (DC): U.S. Energy Information Administration (US). , Available from: http://www.eia.gov/uranium/production/annual/ (2014).
- Uranium Recovery. Washington (DC): U.S. United States Nuclear Regulatory Commission (US). , Available from: http://www.nrc.gov/materials/uranium-recovery/license-apps/ur-projects-list-public.pdf (2014).
- U.S. Uranium Reserves Estimates. Washington (DC): U.S. Energy Information Administration (US). , Available from: http://www.eia.doe.gov/cneaf/nuclear/page/reserves/ures.html (2010).
- The Future of Uranium Production in Wyoming: A Public Forum on In-Situ Recovery. Washington (DC): Meridian Institute. , Available from: http://www.uwyo.edu/ser/_files/docs/conferences/2010/uraniumforum/ser_uranium_forum_final_report.pdf (2010).
- Generic Environmental Impact Statement for In-Situ Leach Uranium Milling Facilities Washington (DC): U.S. Nuclear Regulatory commission (US). , Available from: http://www.nrc.gov/reading-rm/doc-collections/nuregs/staff/sr1910/v1/ (2012).
- Wyoming surface water quality standards. Cheyenne (WY): State of Wyoming Department of Environmental Quality (US). , Available from: http://soswy.state.wy.us/Rules/RULES/6547.pdf (2011).
- Qu, X., Alvarez, P., Li, Q. Applications of nanotechnology in water and wastewater treatment. Water Research. 47 (12), 3931-3946 (2013).
- Martinson, C., Reddy, K. Adsorption of arsenic(III) and arsenic(V) by cupric oxide nanoparticles. Journal of Colloid and Interface Science. 336 (2), 401-411 (2009).
- Reddy, K., McDonald, K., King, H. A novel arsenic removal process for water using cupric oxide nanoparticles. Journal of Colloid and Interface Science. 397, 96-102 (2013).
- Reddy, K., Roth, T. Arsenic Removal from Natural Groundwater Using Cupric Oxide. Ground Water. 51 (1), 83-91 (2012).
- Zhang, G., Ren, Z., Zhang, X., Chen, J. Nanostructured iron(III)-copper(II) binary oxide: a novel adsorbent for enhanced arsenic removal from aqueous solutions. Water Research. 47 (12), 4022-4031 (2013).
- Ali, I. New generation adsorbents for water treatment. Chemical Reviews. 112 (10), 5073-5091 (2012).
- Zhang, Q. CuO nanostructures: Synthesis, characterization, growth mechanisms, fundamental properties, and applications. Progress in Materials Science. 60, 208-337 (2014).
- Schmidt, C. TOX 21: new dimensions of toxicity testing. Environmental health perspectives. 117 (8), 348-353 (2009).
- Firestone, M., Kavlock, R., Zenick, H., Kramer, M. The U.S. Environmental Protection Agency Strategic Plan for Evaluating the Toxicity of Chemicals. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part B. 13 (2-4), 139-162 (2010).
- Guidance Manual for the Assessment of Joint Toxic Action of Chemical Mixtures [Internet]. Atlanta (GA); Agency for Toxic Substance and Disease Registry (US). , Available from: http://www.atsdr.cdc.gov/interactionprofiles/IP-ga/ipga.pdf (2014).
- Bae, D., Gennings, C., Carter, W., Yang, R., Campain, J. Toxicological interactions among arsenic, cadmium, chromium, and lead in human keratinocytes. Toxicological Sciences: An Official Journal of the Society of Toxicology. 63 (1), 132-142 (2001).
- Whittaker, M. Exposure to Pb, Cd, and As mixtures potentiates the production of oxidative stress precursors: 30-day, 90-day, and 180-day drinking water studies in rats. Toxicology and Applied Pharmacology. 254 (2), 154-166 (2011).
- Schilz, J. Investigating the ability of cupric oxide nanoparticles to adsorb metal contaminants from uranium in-situ recovery (ISR) production bleed water and assessing the associated changes in cytotoxicity. , University of Wyoming. Laramie, WY. Available from: ProQuest UMI, Ann Arbor, MI (2014).
- Manual of Standard Operating Procedures for Sample Collection and Analysis. Cheyenne (WY): Wyoming Department of Environmental Quality (US). , Available from: http://deq.state.wy.us/wqd/watershed/downloads/qa/4-1089.pdf (2011).
- Florea, A., Splettstoesser, F., Büsselberg, D. Arsenic trioxide (As2O3) induced calcium signals and cytotoxicity in two human cell lines SY-5Y neuroblastoma and 293 embryonic kidney (HEK). Toxicology and Applied Pharmacology. 220 (3), 292-301 (2007).
- Mao, W. Cadmium induces apoptosis in human embryonic kidney (HEK) 293 cells by caspase-dependent and -independent pathways acting on mitochondria. Toxicology in Vitro. 21 (3), 343-354 (2007).
- Tchounwou, P., Yedjou, C., Patlolla, A., Sutton, D. Heavy Metal Toxicity and the Environment. Molecular, Clinical and Environmental Toxicology. 101, 133-164 (2012).
- Meerloo, J., Kaspers, G., Cloos, J. Cell Sensitivity Assays: The MTT Assay. Cancer Cell Culture. 731, 237-245 (2011).
- Gustafsson, J. Visual MINTEQ. , Royal Institute of Technology. Stockholm, Sweden. (2010).
- Hallab, N., Caicedo, M., McAllister, K., Skipor, A., Amstutz, H., Jacobs, J. Asymptomatic prospective and retrospective cohorts with metal-on-metal hip arthroplasty indicate acquired lymphocyte reactivity varies with metal ion levels on a group basis. Journal of Orthopaedic Research. 31 (2), 173-182 (2013).
- Goswami, A., Raul, P., Purkait, M. Arsenic adsorption using copper (II) oxide nanoparticles. Chemical Engineering Research and Design. 90 (9), 1387-1396 (2011).
- Pillewan, P., Mukherjee, S., Roychowdhury, T., Das, S., Bansiwal, A., Rayalu, S. Removal of As(III) and As(V) from water by copper oxide incorporated mesoporous alumina. Journal of Hazardous Materials. 186 (1), 367-375 (2011).
- Kroll, A. Cytotoxicity screening of 23 engineered nanomaterials using a test matrix of ten cell lines and three different assays. Particle and fibre toxicology. 8 (9), 1-19 (2011).
- Fahmy, B., Cormier, S. Copper oxide nanoparticles induce oxidative stress and cytotoxicity in airway epithelial cells. Toxicology in vitro: an international journal published in association with BIBRA. 23 (7), 1365-1371 (2009).
- Radike, M. Distribution and accumulation of a mixture of arsenic, cadmium, chromium, nickel and vanadium in mouse small intestin, kidney, pancreas, and femur following oral administration in water or feed. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A. 65 (23), 2029-2052 (2002).
- Barbier, O., Jacquillet, G., Tauc, M., Cougnon, M., Poujeol, P. Effect of heavy metals on, and handling by, the kidney. Nephron. Physiology. 99 (4), 105-110 (2005).
- Zheng, X., Watts, G., Vaught, S., Gandolfi, A. Low-level arsenite induced gene expression in HEK293 cells. Toxicology. 187 (1), 39-48 (2003).
- Li, Z., Piao, F., Liu, S., Wang, Y., Qu, S. Subchronic exposure to arsenic trioxide-induced oxidative DNA damage in kidney tissue of mice. Experimental and Toxicologic Pathology. 62 (5), 543-547 (2010).
- Farombi, E., Akintunde, J., Nzute, N., Adedara, I., Arojojoye, O. Municipal landfill leachate induces hepatotoxicity and oxidative stress in rats. Toxicology and Industrial Health. 28 (6), 532-541 (2011).
- Das, N. Arsenic exposure through drinking water increases the risk of liver and cardiovascular diseases in the population of West Bengal. India. BMC public health. 12 (1), 639-648 (2012).
- Valko, M., Morris, H., Cronin, M. Metals, toxicity and oxidative stress. Current Medicinal Chemistry. 12 (10), 1161-1208 (2005).
- Horie, M. Protein Adsorption of Ultrafine Metal Oxide and Its Influence on Cytotoxicity toward Cultured Cells. Chemical Research in Toxicology. 22 (3), 543-553 (2009).
