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Developmental Biology

免疫组化可视化小鼠肠神经系统的发展

doi: 10.3791/52716 Published: April 29, 2015

Introduction

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一个发挥作用的肠神经系统(ENS),控制运动,营养吸收和局部血流量,是生活中必不可少的1。该ENS是由神经嵴细胞(NCC)的增殖,迁移和定居的肠道,在那里他们分化成神经节含有神经元和神经胶质细胞形成。先天性巨结肠症(文中HSCR,在线孟德尔遗传),一个multigeneic先天性疾病与1 4000活产儿发病,可以被认为是原型病研究打乱ENS形成。在HSCR,NCC无法迁移并定居于远端肠2的可变长度。此外,其他常见的胃肠道(GI)中的儿科人群发育缺陷,如肛门直肠畸形,肠atresias,和运动障碍是与在基本ENS功能紊乱有关,并有可能与微妙,低估,解剖变化和功能性变化有关在ENS 3-6。因此,技术,使我们能够理解的ENS形成发展的决定因素可能会阐明其发病机制及小儿胃肠道疾病的潜在治疗轻。

以下迁移和殖民化,NCC分化为神经元特异性神经递质的表型标记。胆碱能神经元包括肠神经元7的约60%,并且可以通过染色胆碱乙酰转移酶(ChAT的),合成酶的兴奋性神经递质乙酰胆碱来检测。在历史上,试图可视胆碱能神经元是由不同的针对中枢神经系统的抗体的抗原特异性混淆(CNS)的ChAT的与外周神经系统(PNS)的ChAT的8-10。然而,针对胎盘胆碱抗体识别中枢和外周胆碱11-13,和我们最近所描述的技术,允许visuaENS胆碱能神经元的高灵敏度补肾中药较早发展比已取得的ChAT记者线14。

在这里,我们提出了解剖,固定小鼠胚胎胃肠道和免疫可视化ENS神经递质表达的神经元的技术。在这些研究中,我们已经利用交配R26R聊天的Cre小鼠:floxSTOP:tdTomato动物生产聊天的Cre; R26R:floxSTOP:tdTomato小鼠(整个手稿定义 ​​为聊天的Cre tdTomato)。这些动物,然后用纯合子聊天GFP报告小鼠交配,获得表达的小鼠都来检测胆碱表达荧光14记者。这两个记者动物是在C57BL / 6J背景和市售(Jackson实验室,巴港,缅因州)。

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Protocol

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威斯康星州的动物护理和使用委员会的批准大学的所有程序。

1.准备解决方案

  1. 使用1×磷酸盐缓冲盐水(PBS),为解剖缓冲液和冲洗液。
  2. 由30克蔗糖和地点到瓶中制备30%的蔗糖。添加99毫升1×PBS中并加入1毫升10%的叠氮化钠。调匀,直到所有的蔗糖溶解。直到需要保存在4℃。
  3. 制备通过混合的1×PBS,3%牛血清白蛋白(BSA)和0.1%的Triton-X-100的封闭溶液。调匀,直到需要在冰箱里储存。
  4. 制备在1×PBS中的8%的多聚甲醛(PFA)溶液通过称重的PFA的适量的1×PBS中,然后孵育在65℃直到它完全溶解。商店在25毫升等份在-20℃冷冻,直到需要。稀释至4%PFA中的1×PBS在使用的当天。

2.胚胎和肠道解剖离子

  1. 按照机构动物护理和使用委员会批准的方案,安乐死定时怀孕小鼠和子宫转移到60毫米培养皿中含有冰冷的1×PBS。
  2. 在使用锋利的剪刀解剖镜下,切开子宫壁并暴露出胚胎。除去从子宫和地点胚胎成含冰冷的1×PBS中的清洁60毫米培养皿。
  3. 安乐死在冰冷的1X PBS每个胚胎被斩首。如果您使用的是含有荧光蛋白转基因小鼠,在荧光照明,标识正转基因胚胎。
  4. 解剖使用解剖显微镜每个胚GI道。用细镊子,定向,使得所述左侧朝上,右侧是针对培养皿底部的胚胎。从胚胎中取出上体壁以暴露内部器官。将背体壁和内脏之间的细镊子。铬oss骨粉对对方的镊子在剪刀状切割动作,从胚胎取出内脏。
  5. 从周围器官进一步分解剖GI道远,然后将每个GI道到含有冰冷的1×PBS 1.5ml微量离心管中。

3.固定GI大片

  1. 冲洗每个GI道3次,用冰冷的1×PBS,然后替换用4%PFA。固定在摇摆平台在RT 1.5小时在1.5 ml微量离心管在胃肠道。冲洗胃肠道3次,每次5分钟,RT,然后进行1小时的摇动平台上。在此阶段,存储在胃肠道,在4℃下在30%蔗糖中含有1x PBS中的0.1%的叠氮化钠,直到需要。
    注意:可替换地,存储在30%蔗糖的胚胎为长达一年而不对组织的完整性的任何影响。在30%的蔗糖样品的存储允许的样品无论是对免疫染色或进入十月为低温sectioni的购买处理NG。另外,继续进行下面详细介绍的免疫协议。

4.免疫染色协议

  1. 如果样本已储存在30%的蔗糖,冲洗他们在摇摆平台上在1×PBS中3次20分钟。
  2. 放置在胃肠道进入封闭溶液在摇摆平台上1小时,在室温。
  3. 除去封闭液孵育胃肠道与稀释于封闭为任一4小时,在室温或O / N在4℃下在摇摆平台上的解决方案的主要抗体的适当的量。使用1:1000稀释的人抗胡抗体(血清自患者获得),1:1000稀释的鸡抗 - 绿色荧光蛋白(GFP)的抗体和1:100稀释的山羊抗胆碱抗体。
    注意:我们利用了从患者局部获得的人抗胡抗体,然而,抗胡抗体是可商购的,例如,小鼠抗胡,(使用1:500稀释)。
  4. 在冲洗1X PBS胃肠道3次,每次5分钟,然后进行1小时,在室温在摇摆平台上。
  5. 在封闭溶液在摇摆平台上为4小时,在室温或O / N在4℃下500:取代的1×PBS稀释1的二次抗体。使用驴抗人胺反应性染料如Dylight,驴抗鸡的Cy2和驴抗山羊Cy5的。如果使用小鼠抗胡抗体然后用1:500稀释的驴抗小鼠胺反应性染料405。
    注:内源性GFP和tdTomato表达和免疫染色随发育年龄的清晰度的强度。我们通常免疫染色胚胎胆单独在0.2ml管中加入150μl的染色溶液,以减少所使用的抗体的量,同时确保组织的有效染色。
  6. 冲洗在1×PBS中的3倍胃肠道5分钟,然后进行1小时,在室温在摇摆平台上。
  7. 放置几滴荧光封固剂用DAPI的载玻片上。沉浸GI TRA克拉到荧光封固剂并直接在组织上添加一个玻璃盖。荧光封固剂-G是一种水溶性化合物,它提供了半永久性密封。
    注:使用荧光安装介质如的Vectashield这是基于安装介质,防止褪色和抗体的漂白甘油。这两种产品使组织被存储的时间,在4℃下长期使用。
  8. 捕捉利用共聚焦显微镜荧光每个人的图片。使用激发波长为荧光团和过滤器使用的表3中。
  9. 使用根据用于捕捉图像共焦的类型适当的软件执行计算机辅助图像分析。

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Representative Results

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我们先前描述了小鼠表达GFP和tdTomato荧光记者,检测ChAT的表达14的产生。简单地说, 聊天的Cre小鼠交配R26R:floxSTOP:tdTomato动物生产聊天的Cre; R26R:floxSTOP:tdTomato小鼠(称为聊天的Cre tdTomato)。这些动物处死后交配的纯合的ChAT-GFP报道小鼠。胚胎中分离和组织之前被固定进行解剖并如上述进行免疫染色,并在表1中列出的抗体。远端小肠(SI)和近端结肠在E11,E13.5和E16.5进行分析

在E11,胡阳性神经元是所述远端SI中存在,但NCC尚未达到近端结肠( 图1)。在这个时间点,多数胡阳性细胞表现出的ChAT免疫反应以及GFP阳性。有趣的是,在这个时间点,位于expr聊天Cre重组tdTomato构建体的分裂国家是不可检测。由E13.5,多数胡阳性神经元均的ChAT-IR和ChAT的-GFP阳性,而少数的ChAT Cre重组tdTomato阳性神经元的被看见。的ChAT的Cre重组tdTomato阳性神经元增加E16.5的数量,但是仍然是ChAT的-IR神经元的数目的一小部分。

图1
胆碱能神经元在远端小肠和结肠在胚胎11天在E11 图1代表图像 ,在远端的SI(标记为“SI”)和近端结肠(标记为“CO”),胡阳性细胞(蓝色)仅在此阶段在SI中存在。胡锦涛大部分阳性细胞被共同免疫染色聊天IR(白色)和聊天-GFP(绿色)。然而,在这个时间点,没有这些神经元是ChAT的Cre重组tdTomato阳性(红色)。规模酒吧= 100微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图胆碱能神经元的远端小肠2.代表图像,并在胚胎天数结肠13.5和16.5。图像显示胆碱能神经元在远端小肠在E13.5(上图)和E16.5(下图)。在E13.5广大胡阳性神经元都是聊天IR和聊天GFP阳性(上图)。少数这些共同表达聊天的Cre tdTomato的。由E16.5,更聊天的Cre tdTomato神经元被发现在新生神经节(下图)。比例尺= 100微米。 请点击此处查看该FIGUR的放大版本。

一抗
抗原免疫原稀释供应商与细则
胡(人类神经元蛋白) 胡锦涛蛋白 1:1000 从人类患者血清(麦迪逊)
GFP(绿色荧光蛋白) GFP蛋白,球蛋白比例 1:1000 鸟类实验室公司(蒂伽德,OR),鸡多克隆,GFP-1020
聊天(胆碱乙酰转移酶) 人胎盘酶 1:100 密理博(比尔里卡,MA),山羊多克隆,AB144P
二抗
名字荧光稀释供应商与细则
驴抗人 Dylight 405 1:500 杰克逊免疫研究实验室(西树林,PA),709-475-149
驴抗鸡 CY2 1:500 杰克逊免疫研究实验室(西树林,PA),703-225-155
驴抗山羊 Cy5的 1:500 杰克逊免疫研究实验室(西树林,PA),705-175-147

表在研究中使用一次和二次抗体,1的详细信息。在这项研究中所用的第一和第二抗体以及它们的供应商以及所使用的稀释液。

一抗
抗原稀释供应商二抗
SOX10 1:50 Santa Cruz公司,达拉斯,TX 驴抗山羊
P75 1:250 Promega公司,麦迪逊威斯康星驴抗兔
PGP9.5 1:1000 Abcam公司,马萨诸塞州剑桥驴抗兔
BFABP 1:500 Millipore公司,比尔里卡,MA 驴抗兔
S-100 1:500 DAKO,卡平特里亚,CA 驴抗兔
GFAP 1:500 DAKO,卡平特里亚,CA 驴抗兔
nNOS的 1:500-1000 EMSON,剑桥,英国驴抗羊
VIP(血管活性肠肽) 1:500 爱泼斯坦与保尔森,麦迪逊驴抗兔
P物质 1:200-400 DIASORIN,StillwateR,MN 驴抗羊
二抗
名字稀释供应商与细则荧光
驴抗人 1:500-1000 杰克逊免疫研究实验室,西树林,PA Dylight 488
驴抗人 1:1000 杰克逊免疫研究实验室,西树林,PA Cy3的
驴抗兔 1:500 杰克逊免疫研究实验室,西树林,PA Dylight 488
驴抗兔 1:500 杰克逊免疫研究实验室,西树林,PA Cy3的
驴抗羊 1:500 杰克逊免疫研究实验室,西树林,PA CY2 驴抗羊 1:1500 杰克逊免疫研究实验室,西树林,PA Cy3的
驴抗山羊 1:500 杰克逊免疫研究实验室,西树林,PA Cy3的

利用学习ENS开发表2,其他小学和中学的抗体。我们在我们的ENS发展研究以前使用的小学和中学的抗体。

激励发射
激光线荧光类型示例光电倍增管过滤器选项
408纳米蓝色的Alexa Fluor 405,瀑布蓝,香豆素30,DAPI,赫司特,太平洋蓝,大多数量子点 1 BP 425-475纳米
488纳米绿的Alexa Fluor 488,ATTO 488,钙黄绿素,的Cy2,绿色荧光蛋白,FITC,俄勒冈绿,YO-PRO-1 2 BP 500-550纳米
561纳米的Alexa Fluor 546,555,568,594,Cy3的,直接投资收益,红色荧光蛋白,mCherry,藻红蛋白(PE),碘化丙啶(PI),RFP,TAMRA,tdTomato,TRITC 3 BP 570-620纳米
638纳米远红的Alexa Fluor 633和647,别藻蓝蛋白(APC),Cy5标记,TO-PRO-3 4 BP 663-738纳米

表3共焦成像的激发波长,荧光团和过滤器的激发波长,可检测的荧光团,和过滤器使用的呈现。此信息可以在选择第二抗体的组合的多色免疫荧光使用。

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Discussion

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我们的实验室和其他人已经表明,在HSCR肠缺陷不限于无神经节结肠但近侧延伸,连成神经节小肠5,15,16。这些改变包括改变在ENS神经元密度和神经递质的表型,并且可以考虑动力障碍已被观察到的患者HSCR。我们利用上述技术,我们在努力了解ENS形成的决定因素。具体地,这些技术已被用来可视化神经元一氧化氮合成酶(nNOS的)神经元,血管活性肠肽神经元(VIP),以及胆碱乙酰转移酶(ChAT的)神经元( 2)5。该技术的主要优点是存储样品中30%的蔗糖购买处理中,无论是对免疫染色或嵌入和cryosectioning的能力。

肠道定植NCC作为发生前进波前˚FROM E9.5到E14.5。与胡,其中确定的神经元的免疫染色中,如上所述,加上计算机辅助图像分析,允许对神经元密度的定量比较。在神经元密度减少被发现HSCR 5的神经节肠管部分,以及在肠道运动功能障碍13等机型。小鼠有条件缺失HAND2的演示变化中的神经元表达不同的神经递质,以及减少的神经元数的比例。此外,动物过表达或头蛋白PTEN的演示了沿其肠道6,17增加神经元密度。

神经递质的表型的ENS的神经元之间的平衡被严格调控,导致肠壁为管腔内容,血流和营养吸收的调节运动的协调收缩。一旦NCC获得一个神经元的身份,有时间之前一个狭窄窗口承诺的神经递质表型14。我们最近表明,免疫标识聊天神经递质表型在10.5天,比遗传记者机型( 聊天或Cre的聊天GFP)14观察早期萌芽阶段。此外,聊天阳性神经元达到成人水平(所有ENS的神经元的比例)在发展初期,因此这表明胆碱神经元可能在调控中进一步ENS神经元分化的作用。

一氧化氮合酶(NOS)是在ENS发现主松弛的神经递质,并且在ENS神经元沿肠中HSCR 5成比例地增大。此外,在血管活性肠肽(VIP)的改变,一种神经递质,也参与介导肌肉松弛和调节沿着肠壁血流量,被发现在HSCR模型5。这些数据表明,为了理解如何排版巴黎高师的onents调节其功能,不同的神经递质进行了系统的检查应该进行。这里提出的技术可以很容易地适于允许这种类型的分析通过使用适当的抗体。

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Acknowledgments

这项工作是支持的美国bythe小儿外科协会基金会奖(AG)和健康K08DK098271全国学院(AG)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate buffered saline Oxoid BR0014G
Sucrose Fisher S2
Sodium azide Fisher BP9221
Bovine serum albumin Fisher BP1605
Triton X-100 Sigma X100
Paraformaldehyde Sigma 158127
60 mm Petri dishes Fisher FB0875713A
Fluorescence microscope Nikon SMZ-18 stereoscope
Dissection microscope Nikon SMZ-18 stereoscope
Fine forceps Fine science tools 11252-20
1.5 ml Eppendorf tubes VWR 20170-038
Fluoromount-G SouthernBiotech, Birmingham, AL 0100-01
Glass slides Fisher 12-550-15
Cover glass VWR 16004-330
Confocal microscope Nikon Nikon A1
Nikon Elements Nikon

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References

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Barlow-Anacker, A. J., Erickson, C. S., Epstein, M. L., Gosain, A. Immunostaining to Visualize Murine Enteric Nervous System Development. J. Vis. Exp. (98), e52716, doi:10.3791/52716 (2015).More

Barlow-Anacker, A. J., Erickson, C. S., Epstein, M. L., Gosain, A. Immunostaining to Visualize Murine Enteric Nervous System Development. J. Vis. Exp. (98), e52716, doi:10.3791/52716 (2015).

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