Introduction
Eine funktionierende enterische Nervensystem (ENS), der Motilität, Nährstoffaufnahme, und lokale Durchblutung steuert, ist lebens 1. Die ENS wird von Neuralleistenzellen (NCC), die Proliferation, Migration und besiedeln den Darm, wo sie in die Ganglien enthalten Neuronen und Gliazellen differenzieren gebildet. Hirschsprung-Krankheit (HSCR, Online Mendelian Inheritance in Man), ein multigeneic angeborene Störung mit einer Inzidenz von 1 in 4.000 Lebendgeburten, kann als das prototypische Krankheiten für das Studium unterbrochen ENS Bildung werden. In HSCR, NCC nicht zu migrieren und zu kolonisieren variabler Länge des distalen Enddarm 2. Zusätzlich sind andere gemeinsame gastrointestinale (GI) Entwicklungsstörungen bei Kindern und Jugendlichen, wie anorektalen Fehlbildungen, Darmatresien und Motilitätsstörungen mit Störungen im Grund ENS Funktionen verbunden, und werden wahrscheinlich mit subtilen, unterschätzt, anatomischen Veränderungen und funktionelle Veränderungen in assoziiertdie ENS 3-6. Daher können Techniken, die uns, die Entwicklungs Determinanten der ENS Bildung verstehen lassen das Licht auf die Entstehung und mögliche Behandlung von GI-Trakt Erkrankungen pädiatrischen vergießen.
Nach der Migration und Besiedlung, unterscheidet NCC in Neuronen mit bestimmten für ihre Neurotransmitter-Phänotyp-Marker. Cholinergen Neuronen umfassen etwa 60% des enterischen Neuronen 7 und kann durch Färbung auf Cholinacetyltransferase (ChAT), dem synthetisierenden Enzyms zur exzitatorischen Neurotransmitter Acetylcholin nachgewiesen werden. Historisch versucht visualisieren cholinergen Neuronen wurden von unterschiedlichen Antigen-Spezifität von Antikörpern gegen das zentrale Nervensystem gerichtet verwechselt (CNS) ChAT gegen peripheren Nervensystem (PNS) ChAT 8-10. Jedoch Antikörper gegen Plazenta ChAT gerichtet erkennen sowohl zentrale und periphere ChAT 11-13, und wir haben vor kurzem beschriebenen Techniken, die für Visualisierungs ermöglichensierung von ENS cholinergen Neuronen mit hoher Empfindlichkeit früher in Entwicklung, als es mit Chat Reporter Linien 14 erreicht.
Hier präsentieren wir eine Technik zum Präparieren, Fixierung und Immunfärbung des murinen embryonalen GI-Trakt zu ENS Neurotransmitter Expression in Neuronen zu visualisieren. FloxSTOP:: tdTomato Tiere zu produzieren Chat Cre; R26R: Für diese Studien haben wir ChAT-Cre Mäusen mit R26R gepaart genutzt floxSTOP: tdTomato Mäusen (zB Chat-Cre tdTomato ganzen Manuskript definiert). Diese Tiere wurden dann mit homozygot ChAT-GFP-Reporter Mäusen gepaart, um Mäuse, die sowohl fluoreszierenden Reportern, dass ChAT Ausdruck 14 erkennen zu erhalten. Diese beiden Reporter Tiere sind auf einem C57BL / 6J Hintergrund und im Handel erhältlich (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME).
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Protocol
Die University of Wisconsin Animal Care und Verwenden Committee genehmigt alle Verfahren.
1. Herstellung der Lösungen
- Verwenden 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) als Puffer und Dissektion Spüllösung.
- Bereiten Sie 30% Saccharose von einem Gewicht von 30 g Saccharose und Ort in eine Flasche. In 99 ml 1x PBS und 1 ml 10% Natriumazid. Es wird gründlich gemischt, bis die gesamte Saccharose gelöst. Lagerung bei 4 ° C bis zur Verwendung.
- Vorbereitung Blockierungslösung durch Mischen 1x PBS, 3% Rinderserumalbumin (BSA) und 0,1% Triton-X-100. Gründlich mischen und im Kühlschrank aufbewahren, bis sie benötigt.
- Vorbereitung 8% Paraformaldehyd (PFA) Lösung in 1x PBS durch Wiegen der entsprechenden Menge an PFA in 1x PBS gewaschen und dann bei 65 ° C inkubieren, bis es vollständig gelöst ist. Shop in 25 ml-Teilmengen in dem -20 ° C Gefrierschrank bis zum Gebrauch. Verdünnt auf 4% PFA in 1x PBS am Tag der Verwendung.
2. Embryo und Gut DissectIon
- Gemäß Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt Protokolle, einschläfern zeitlich schwangere Maus und übertragen Sie die Gebärmutter in eine 60 mm Petrischale mit eiskaltem 1x PBS.
- Unter einem Dissektionsmikroskop mit einer scharfen Schere, schneiden Sie die Gebärmutterwand geöffnet, um die Embryonen aus. Entfernen Sie die Embryonen aus der Gebärmutter und der Ort in ein sauberes 60 mm Petrischale mit eiskaltem 1x PBS.
- Euthanize jedem Embryo durch Enthauptung in eiskaltem 1x PBS. Wenn Sie mit transgenen Mäusen, fluoreszierende Proteine enthalten, werden unter Fluoreszenzbeleuchtung, identifizieren die positive transgenen Embryos.
- Präparieren Sie die GI-Trakt von jedem Embryo mit einem Dissektionsmikroskop. Verwendung einer feinen Pinzette, richten den Embryo, so dass die linke Seite nach oben gerichtet ist und die rechte Seite ist an dem Boden der Petrischale. Entfernen Sie die obere Körperwand aus dem Embryo, die inneren Organe aus. Legen feinen Pinzette zwischen der dorsalen Körperwand und der inneren Organe. Cross die Zange gegeneinander in einer scherenartigen Schneidwirkung auf die inneren Organe aus dem Embryo zu entfernen.
- Weitere Unter sezieren die GI-Trakt entfernt von den umliegenden Organe und legen Sie dann jedes GI-Trakt in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit eiskaltem 1x PBS.
3. Fixierung der GI Tracts
- Mit eiskaltem 1x PBS spülen jedes GI-Trakt 3 mal und dann mit 4% PFA ersetzen. Befestigen Sie die Verdauungstrakt in den 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen auf einem Wippschüttler bei RT für 1,5 Std. Spülen Sie den Verdauungstrakt 3 mal für 5 min bei RT und dann für 1 Stunde auf dem Wippschüttler. In dieser Phase speichert die Verdauungstrakt bei 4 ° C in 30% Saccharose in 1 × PBS mit 0,1% Natriumazid, bis sie benötigt.
HINWEIS: Sie speichern die Embryonen in 30% Sucrose für bis zu einem Jahr ohne irgendeine Wirkung auf die Integrität der Gewebe. Lagerung der Proben in 30% Saccharose ermöglicht die spätere Verarbeitung der Proben entweder Immunofärbung oder in OCT für Cryo-sectioning. Alternativ fahren Sie mit dem unten beschriebenen Immunfärbung Protokoll.
4. Immunfärbung Protocol
- Wenn Proben in 30% Saccharose gespeichert worden ist, spülen Sie sie 3-mal für 20 min in 1x PBS auf einem Wippschüttler.
- Legen Sie die Verdauungstrakt in Blocking-Lösung auf einem Wippschüttler für 1 h bei RT.
- Entfernen Sie die Blockierlösung und Inkubation der Verdauungstrakt mit der entsprechenden Menge des primären Antikörper in Blockierungslösung entweder für 4 h bei RT oder O / N bei 4 ° C auf einem Wippschüttler verdünnt. Verwenden Sie 1: 1000-Verdünnung von menschlichen Anti-Hu-Antikörper (Serum von Patienten gewonnen), 1: 1000-Verdünnung von Huhn anti-grün fluoreszierende Protein (GFP) Antikörper und 1: 100 Verdünnung von Ziegen-Anti-ChAT-Antikörper.
ANMERKUNG: Wir verwenden einen menschlichen Anti-Hu-Antikörper, der lokal von einem Patienten erhalten wurde, jedoch sind Anti-Hu-Antikörper im Handel erhältlich, beispielsweise Maus-Anti-Hu, (Einsatz bei 1: 500 Verdünnung). - Spülen Sie die Verdauungstrakt in 1x PBS3 mal für 5 min und dann für 1 h bei RT auf einer Schüttelplattform.
- Ersetzen Sie die 1x PBS mit Sekundärantikörper 1: 500 verdünnt in Blockierungslösung auf einem Wippschüttler für entweder 4 h bei RT oder O / N bei 4 ° C. Verwenden Esel anti-human aminreaktiven Farbstoff wie DyLight, Esel anti-Huhn Cy2 und Esel anti-Ziege Cy5. Bei Verwendung der Maus-Anti-Hu-Antikörper dann mit einem 1: 500 Verdünnung der Esel anti-Maus-Amin-Reaktivfarbstoff 405.
HINWEIS: Die Intensität des endogenen GFP und tdTomato Expression und die Klarheit der Immunsteigerung mit Entwicklungsalter. Wir typischerweise um die Antikörpervolumen zu reduzieren und auch um eine effiziente Färbung des Gewebes sicherzustellen Immunfärbung embryonalen Eingeweide einzeln in 0,2 ml-Röhrchen mit 150 & mgr; l Färbelösung. - Spülen Sie die Verdauungstrakt in 1x PBS 3 mal für 5 Minuten und dann für 1 h bei RT auf einem Wippschüttler.
- Legen Sie ein paar Tropfen Fluoreszenz Eindeckmedium mit DAPI auf einen Objektträger. Tauchen Sie die GI-tract in die Fluoreszenz Eindeckmedium und fügen Sie ein Deckglas direkt auf das Gewebe. Die Fluoreszenz Eindeckmediums -G eine wasserlösliche Verbindung, die eine semi-permanente Abdichtung bietet.
HINWEIS: Verwenden Sie Fluoreszenz Eindeckmedium wie Vectashield das eine Glycerin basierte Einschlussmittel, das Verblassen und Photobleichen von Antikörpern verhindert ist. Beide dieser Produkte ermöglichen Gewebe für längere Zeiträume bei 4 ° C gelagert werden. - Machen Sie Bilder von jedem Fluorophor mit einem konfokalen Mikroskop. Verwenden Anregungswellenlängen für Fluorophore und verwendeten Filter in Tabelle 3 dargestellt.
- In die computergestützte Bildanalyse unter Verwendung geeigneter Software in Abhängigkeit von der Art des konfokalen verwendet, um Bilder zu erfassen.
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Representative Results
Wir haben bereits beschrieben die Erzeugung von Mäusen, die sowohl GFP und tdTomato fluoreszierenden Reportern, dass ChAT Ausdruck 14 zu erkennen. FloxSTOP:: Kurz gesagt, wurden Chat Cre Mäusen mit R26R gepaart tdTomato Tiere zu produzieren Chat Cre; R26R: floxSTOP: tdTomato Mäusen (genannt ChAT-Cre tdTomato). Diese Tiere wurden dann mit homozygot ChAT-GFP-Reporter Mäusen gepaart. Embryos wurden isoliert und Gewebe wurden vor ihrer festen seziert und immungefärbt, wie oben, mit den in Tabelle 1 aufgelisteten Antikörper. Die distalen Dünndarm (SI) und dem proximalen Kolon wurden bei E11, E13.5 und E16.5 analysiert
Bei E11, innerhalb des distalen SI vorliegen Hu-positiven Neuronen, aber NCC noch nicht in dem proximalen Kolon (Figur 1) erreicht. Zu diesem Zeitpunkt ist die Mehrzahl der Hu-positiven Neuronen demonstrieren ChAT-Immunreaktivität als auch GFP-Positivität. Interessant ist, dass zu diesem Zeitpunkt, expression des Chat-Cre tdTomato Konstrukt ist nicht nachweisbar. Durch E13.5, die Mehrheit der Hu-positiven Neuronen sind beide ChAT-IR und Chat-GFP positive und eine kleine Anzahl von ChAT-Cre tdTomato-positiven Neuronen zu sehen sind. Die Anzahl der ChAT-Cre tdTomato-positiven Neuronen nimmt um E16.5, aber weiterhin ein kleiner Bruchteil der Anzahl der ChAT-IR Neuronen.
Abbildung 1. Repräsentative Bilder von cholinergen Neuronen im distalen Dünndarm und Dickdarm an embryonalen Tag 11. An E11, im distalen SI (mit "SI") und proximalen Kolon (mit "Co"), Hu-positiven Neuronen (blau) sind nur innerhalb des SI vorhanden in dieser Phase. Die meisten Hu-positiven Neuronen co-immun mit Chat-IR (weiß) und Chat-GFP (grün). Doch zu diesem Zeitpunkt keine dieser Neuronen ChAT-Cre tdTomato positive (rot). Maßstabbar = 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Repräsentative Bilder von cholinergen Neuronen im distalen Dünndarm und Dickdarm an embryonalen Tag 13,5 und 16,5. Das Bild zeigt cholinergen Neuronen im distalen Dünndarm bei E13.5 (obere Felder) und E16.5 (untere Felder). Bei E13.5 die Mehrheit der Hu-positiven Neuronen waren ChAT-IR und Chat-GFP positive (obere Felder). Eine kleine Anzahl von diesen coexprimiert ChAT-Cre tdTomato. Durch E16.5 wurden mehr ChAT-Cre tdTomato Neuronen im Entstehen begriffenen Ganglien (untere Felder) gefunden. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses figur ansehene.
| Primary Antibodies | |||
| Antigen | Immunogen | Verdünnung | Lieferant & Details |
| Hu (Human neuronalen Protein) | Hu Protein | 1: 1000 | Serum von menschlichen Patienten (Madison, WI) |
| GFP (Green Fluorescent Protein) | GFP-Protein, IgY-Fraktion | 1: 1000 | Aves Lab, Inc. (Tigard, OR), Hühner polyklonalen, GFP-1020 |
| Chat (Choline Acetyltransferase) | Menschlicher Plazenta-Enzym | 1: 100 | Millipore (Billerica, MA), Ziege polyklonalen, AB144P |
| Sekundärantikörper | |||
| Name | Fluorophore | Verdünnung | Lieferant & Details |
| Esel anti-Mensch DyLight 405 | 1: 500 | Jackson ImmunoResearch Laboratories (West Grove, PA), 709-475-149 | |
| Esel anti-Huhn- | Cy2 | 1: 500 | Jackson ImmunoResearch Laboratories (West Grove, PA), 703-225-155 |
| Esel anti-Ziege | Cy5 | 1: 500 | Jackson ImmunoResearch Laboratories (West Grove, PA), 705-175-147 |
Tabelle 1 Details von primären und sekundären Antikörper in der Studie verwendet. Die primären und sekundären Antikörpern in dieser Studie verwendet, zusammen mit ihren Lieferanten und die verwendeten Verdünnungen.
| Primary Antibodies | |||||||
| Antigen | Verdünnung | Lieferant | Sekundären Antikörper | ||||
| Sox10 | 1.50 | Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX | Esel anti-Ziege | ||||
| p75 | 1: 250 | Promega, Madison WI | Esel anti-Kaninchen | ||||
| PGP9.5 | 1: 1000 | Abcam, Cambridge, MA | Esel anti-Kaninchen | ||||
| BFABP | 1: 500 | Millipore, Billerica, MA | Esel anti-Kaninchen | ||||
| S-100 | 1: 500 | DAKO, Carpinteria, CA | Esel anti-Kaninchen | ||||
| GFAP | 1: 500 | DAKO, Carpinteria, CA | Esel anti-Kaninchen | ||||
| nNOS | 1: 500-1.000 | Emson, Cambridge, UK | Esel anti-Schaf | ||||
| VIP (Vasoaktives intestinales Peptid) | 1: 500 | Epstein und Paulsen, Madison, WI | Esel anti-Kaninchen | ||||
| Substanz P | 1: 200-400 | DiaSorin, Stillwater, MN | Esel anti-Schaf | ||||
| Sekundärantikörper | |||||||
| Name | Verdünnung | Lieferant & Details | Fluorophore | ||||
| Esel anti-Mensch | 1: 500-1.000 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA | DyLight 488 | ||||
| Esel anti-Mensch | 1: 1000 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA | Cy3 | ||||
| Esel anti-Kaninchen | 1: 500 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA | DyLight 488 | ||||
| Esel anti-Kaninchen | 1: 500 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA | Cy3 | ||||
| Esel anti-Schaf | 1: 500 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA | Cy2 | Esel anti-Schaf | 1: 1500 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA | Cy3 |
| Esel anti-Ziege | 1: 500 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA | Cy3 | ||||
Tabelle 2. Zusätzliche primäre und sekundäre Antikörper der Einsatz in das Studium ENS Entwicklung. Die primären und sekundären Antikörpern, die wir bisher in unseren Studien von ENS Entwicklung haben eingesetzt.
| Erregung | Emission | |||
| Laser Line | Fluorophore Type | Beispiele | Photomultiplier | Filteroptionen |
| 408 nm | Blau | Alexa Fluor 405, Cascade Blau, Cumarin 30, DAPI, Hoechst, Pacific Blue, die meisten Quantenpunkten | 1 | BP 425-475 nm |
| 488 nm | Grün | Alexa Fluor 488, ATTO 488, Calcein, Cy2, eGFP, FITC, Oregon Green, YO-PRO-1 | 2 | BP 500-550 nm |
| 561 nm | Rote | Alexa Fluor 546, 555, 568 und 594, Cy3, Dil, DsRed, mCherry, Phycoerythrin (PE), Propidiumiodid (PI), RFP, TAMRA, tdTomato, TRITC | 3 | BP 570-620 nm |
| 638 nm | Far Red | Alexa Fluor 633 und 647, Allophycocyanin (APC), Cy5, TO-PRO-3 | 4 | BP 663-738 nm |
Tabelle 3. konfokale Bildgebung Anregungswellenlängen, Fluorophore und Filter. Die Anregungswellenlängen, nachweisbaren Fluorophoren und verwendeten Filter dargestellt. Diese Informationen können bei der Auswahl Kombinationen Sekundärantikörper für Mehrfarben-Immunfluoreszenz verwendet werden.
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Discussion
Labor und andere haben gezeigt, dass Darmfehlern HSCR sind nicht auf die aganglionären Kolon sogar ins ganglionated Dünndarm 5,15,16 beschränkt, sondern proximal verlängert. Diese Veränderungen umfassen Veränderungen der ENS neuronalen Dichte und Neurotransmitter-Phänotyp und können für Motilitätsstörungen, die bei Patienten mit HSCR beobachtet wurde, Rechnung zu tragen. Wir haben die oben genannten Techniken in unseren Bemühungen, die Determinanten der ENS Bildung verstehen genutzt. Insbesondere diese Techniken sind verwendet worden, um neuronale Stickstoffmonoxidsynthase (nNOS) Neuronen, vasoaktiven intestinalen Polypeptid Neuronen (VIP) sowie Cholin-Acetyltransferase (ChAT) Neuronen (Tabelle 2) 5 visualisieren. Ein wesentlicher Vorteil dieser Technik ist die Fähigkeit, Proben in 30% Sucrose für die spätere Verarbeitung gespeichert werden, sei es für die Immunfärbung oder zum Einbetten und Kryoschneiden.
NCC Kolonisierung des Darms als fortWellenFront f auftrittrom E9.5 bis E14.5. Immunfärbung mit Hu, welche Neuronen identifiziert, wie oben beschrieben, in Verbindung mit rechnergestützten Bildanalyse ermöglicht die quantitative Vergleiche der neuronalen Dichte. Verringerungen der neuronalen Dichte gefunden werden Abschnitte des ganglionated Darm HSCR 5, sowie in anderen Modellen der intestinalen Motilitätsstörungen 13. Mäuse mit einem Bedingt Löschen Hand2 zeigen Veränderungen in den Proportionen der Neuronen, die unterschiedlichen Neurotransmittern sowie reduzierte neuronalen Zahlen. Zusätzlich zeigen Tiere, die mit Überexpression von Noggin oder PTEN entlang ihrer Darm 6,17 erhöhte neuronale Dichte.
Das Gleichgewicht der Neurotransmitter-Phänotypen zwischen Neuronen des ENS ist streng reguliert, was zu koordinierten Kontraktion der Darmwand für eine Bewegung der luminalen Inhalte, die Regulierung des Blutflusses und der Nährstoffaufnahme. Sobald NCC erwerben eine neuronale Identität, gibt es einen schmalen Zeitfenster vorverpflichten, ein Neurotransmitter Phänotyp 14. Wir haben kürzlich gezeigt, dass die Immunfärbung identifiziert eine Chat-Neurotransmitter-Phänotyp bei E10.5, einen früheren embryonalen Stadium als bei genetischer Reporter Modelle (zB, Chat-Cre oder Chat-GFP) 14 beobachtet. Zusätzlich ChAT immunoreaktiven Neuronen erreichen Erwachsenenwerte (als Anteil aller ENS Neuronen) früh in der Entwicklung, ein Ergebnis, das zeigt, dass ChAT Neuronen möglicherweise eine Rolle bei der Regulierung der neuronalen Differenzierung weiter im ENS zu haben.
Stickoxidsynthase (NOS) ist die primäre Entspannung Neurotransmitter im ENS zu finden, und wird proportional in ENS Neuronen in HSCR 5 erhöht längs des Darms. Darüber hinaus Veränderungen in vasoaktive intestinale Peptid (VIP), ein Neurotransmitter, beteiligt sich auch bei der Vermittlung von Muskelentspannung und der Regulierung des Blutflusses entlang der Darmwand, werden in HSCR Modelle 5 gefunden. Diese Daten legen nahe, dass, um, wie die Datei herunterladen zu verstehenonents der ENS regulieren seine Funktion sollte eine systematische Untersuchung der verschiedenen Neurotransmitter durchgeführt werden. Die hier vorgestellten Verfahren können leicht angepasst werden, um diese Art der Analyse durch die Verwendung der geeigneten Antikörper ermöglichen.
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Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vonThe amerikanischen Pediatric Surgical Association Foundation Award (AG) und den National Institutes of Health K08DK098271 (AG) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline | Oxoid | BR0014G | |
| Sucrose | Fisher | S2 | |
| Sodium azide | Fisher | BP9221 | |
| Bovine serum albumin | Fisher | BP1605 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| 60 mm Petri dishes | Fisher | FB0875713A | |
| Fluorescence microscope | Nikon | SMZ-18 stereoscope | |
| Dissection microscope | Nikon | SMZ-18 stereoscope | |
| Fine forceps | Fine science tools | 11252-20 | |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | VWR | 20170-038 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech, Birmingham, AL | 0100-01 | |
| Glass slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Cover glass | VWR | 16004-330 | |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon A1 | |
| Nikon Elements | Nikon |
References
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