Introduction
Un funzionamento del sistema nervoso enterico (ENS), che controlla la motilità, l'assorbimento dei nutrienti, e il flusso sanguigno locale, è essenziale per la vita 1. L'ENS è formata da cellule della cresta neurale (NCC) che proliferano, migrano e colonizzano l'intestino, dove si differenziano in gangli contenente neuroni e cellule gliali. Malattia di Hirschsprung (HSCR, online eredità mendeliana in Man), una malattia congenita multigeneic con un'incidenza di 1 su 4.000 nati vivi, può essere considerato il prototipo per lo studio della malattia formazione ENS perturbato. In HSCR, NCC non riescono a migrare verso e colonizzare lunghezze variabili del hindgut distale 2. Inoltre, altro gastrointestinale comune (GI) difetti di sviluppo nella popolazione pediatrica, come le malformazioni anorettali, atresie intestinali e disturbi della motilità sono associati a disturbi nelle funzioni di base ENS, e sono probabilmente associate a sottili, sottovalutati, alterazioni anatomiche e cambiamenti funzionaliENS 3-6. Pertanto, le tecniche che ci permettono di capire le determinanti dello sviluppo della formazione dell'ENS possano far luce sulla patogenesi e potenziale trattamento dei disturbi del tratto gastrointestinale in età pediatrica.
Dopo la migrazione e la colonizzazione, NCC differenzia in neuroni con marcatori specifici per il loro fenotipo neurotrasmettitore. Neuroni colinergici comprendono circa il 60% dei neuroni enterici 7, e possono essere rilevate mediante colorazione per la colina acetiltransferasi (ChAT), l'enzima di sintesi per il neurotrasmettitore acetilcolina eccitatorio. Storicamente, i tentativi di visualizzare i neuroni colinergici sono stati confusi da diverse specificità antigenica di anticorpi diretti contro il sistema nervoso centrale (SNC) Discuti contro il sistema nervoso periferico (SNP) ChAT 8-10. Tuttavia, gli anticorpi diretti contro placentare ChAT riconoscere sia centrale che periferico ChAT 11-13, e noi abbiamo le tecniche recentemente descritte che permettono di visualizzazione di ENS neuroni colinergici ad alta sensibilità in precedenza in sviluppo che è stato raggiunto con chat line giornalista 14.
Qui vi presentiamo una tecnica per dissezione, fissaggio e immunostaining del tratto GI murino embrionale visualizzare espressione neurotrasmettitore ENS nei neuroni. Per questi studi, abbiamo utilizzato topi ChAT-Cre accoppiate con R26R: animali tdTomato per produrre chat Cre; R26R:: floxSTOP topi tdTomato (definiti come chat Cre tdTomato tutto il manoscritto): floxSTOP. Questi animali sono stati poi accoppiati con omozigoti topi reporter chat-GFP, per ottenere topi che esprimono entrambi giornalisti fluorescenti che consentono di rilevare l'espressione ChAT 14. Questi due animali giornalista sono su uno sfondo C57BL / 6J e sono disponibili in commercio (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME).
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Protocol
L'Università del Wisconsin Animal Care and Use Committee ha approvato tutte le procedure.
1. preparazione di soluzioni
- Utilizzare fosfato 1x salina tamponata (PBS) come tampone di dissezione e la soluzione di risciacquo.
- Preparare 30% di saccarosio pesando 30 g di saccarosio e posto in una bottiglia. Aggiungere 99 ml di PBS 1x e aggiungere 1 ml di 10% di sodio azide. Mescolare accuratamente fino a quando tutti saccarosio è disciolto. Conservare a 4 ° C fino richiesto.
- Preparare una soluzione bloccante mescolando 1x PBS, 3% di albumina sierica bovina (BSA) e 0,1% Triton-X-100. Mescolare bene e conservare in frigorifero fino al momento.
- Preparare la soluzione 8% paraformaldeide (PFA) in PBS 1x pesando la quantità appropriata di PFA in 1x PBS e incubare a 65 ° C fino a completa dissoluzione. Conservare in aliquote di 25 ml nel -20 ° C freezer fino al momento. Diluire al 4% PFA in 1x PBS, il giorno di utilizzo.
2. Embrione e Gut Dissectione
- In conformità con Institutional Animal Care and Use Committee protocolli approvati, l'eutanasia a tempo topo incinta e trasferire l'utero in un 60 millimetri piastra di Petri contenente ghiacciata 1x PBS.
- Al microscopio dissezione con forbici affilate, tagliare la parete uterina aperta per esporre gli embrioni. Rimuovere gli embrioni dall'utero e posto in una 60 millimetri piastra di Petri pulita contenente freddo ghiaccio 1x PBS.
- Euthanize ogni embrione per decapitazione in 1x PBS ghiacciato. Se si sta utilizzando topi transgenici contenenti proteine fluorescenti, in condizioni di illuminazione a fluorescenza, di identificare gli embrioni transgenici positivi.
- Sezionare il tratto GI da ogni embrione utilizzando un microscopio dissezione. Utilizzando una pinza sottile, orientare l'embrione tale che il lato sinistro sia rivolto verso l'alto e il lato destro è contro il fondo della scatola di Petri. Rimuovere la parete superiore del corpo dall'embrione per esporre gli organi interni. Inserire pinza sottile tra la parete dorsale del corpo e gli organi interni. CrOss pinza contro l'altro in una azione di taglio a forbice per rimuovere gli organi interni dall'embrione.
- Ulteriori sub-sezionare il tratto GI lontano dagli organi circostanti e quindi inserire ogni tratto GI in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga contenente ghiacciata 1x PBS.
3. Fissazione di GI Tracts
- Sciacquare ogni tratto GI 3 volte con 1x PBS freddo e poi sostituirli con 4% PFA. Fissare i tratti GI nei tubi microcentrifuga 1,5 ml su una piattaforma oscillante a temperatura ambiente per 1,5 ore. Risciacquare tratti gastrointestinali 3 volte per 5 minuti a temperatura ambiente e quindi per 1 ora sull'agitatore oscillante. In questa fase, memorizzare i tratti GI a 4 ° C in 30% di saccarosio in 1x PBS contenente 0,1% di azide di sodio fino a quando necessario.
NOTA: In alternativa, memorizzare gli embrioni in saccarosio al 30% fino ad un anno senza alcun effetto sulla integrità dei tessuti. Conservazione dei campioni nel 30% di saccarosio consente poi l'elaborazione dei campioni sia per immunocolorazione o in ottobre per crio-sectioning. In alternativa, procedere con il protocollo di immunocolorazione descritto di seguito.
4. Immunostaining Protocol
- Se i campioni sono stati memorizzati nel 30% di saccarosio, risciacquare 3 volte per 20 minuti in 1x PBS su una piattaforma oscillante.
- Posizionare i tratti GI in una soluzione bloccante su una piattaforma oscillante per 1h a RT.
- Rimuovere la soluzione di saturazione e incubare i tratti GI con la quantità appropriata di anticorpi primari diluiti in soluzione bloccante sia per 4 ore a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C su una piattaforma oscillante. Utilizzare 1: 1.000 diluizione degli anticorpi umani contro Hu (siero ottenuto da paziente), 1: 1.000 diluizione di anticorpo pollo anti-proteina fluorescente verde (GFP) e diluizione 1: 100 di capra anticorpo anti-Chat.
NOTA: Utilizziamo un anticorpo anti-Hu umano che è stato ottenuto localmente da un paziente, tuttavia, gli anticorpi anti-Hu sono disponibili in commercio, per esempio, anti-Hu mouse (uso in diluizione 1: 500). - Sciacquare i tratti GI in 1x PBS3 volte per 5 minuti e poi per 1 ora a RT su una piattaforma oscillante.
- Sostituire la 1x PBS con anticorpi secondari diluiti 1: 500 in soluzione bloccante su una piattaforma oscillante sia per 4 ore a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C. Utilizzare asino tintura ammina reattiva anti-umano come DyLight, asino Cy2 anti-pollo e asino anti-capra Cy5. Se si utilizza il mouse anti-Hu anticorpi quindi utilizzare una diluizione 1: 500 di asino anti-topo ammina reattiva tintura 405.
NOTA: L'intensità della GFP endogena ed espressione tdTomato e la chiarezza di immunostaining aumentano con l'età evolutiva. Tipicamente immunostain viscere embrionali singolarmente in provette da 0,2 ml con 150 ml di soluzione di colorazione al fine di ridurre il volume di anticorpo utilizzato e anche per garantire la colorazione efficiente del tessuto. - Risciacquare tratti GI in 1x PBS 3 volte per 5 minuti e poi per 1 ora a RT su una piattaforma oscillante.
- Mettere qualche goccia di soluzione di montaggio a fluorescenza con DAPI su un vetrino. Immergere TRA GIct nel mezzo di montaggio fluorescenza e aggiungere un vetro di copertura direttamente sulla parte superiore del tessuto. Il mezzo di montaggio -G fluorescenza è un composto solubile in acqua che fornisce una tenuta semi-permanente.
NOTA: mezzo di montaggio Usa fluorescenza come Vectashield che è un glicerolo basato mezzo che impedisce allo sbiadimento e photobleaching di anticorpi montaggio. Entrambi i prodotti consentono tessuti per essere conservati per lunghi periodi di tempo a 4 ° C. - Catturare immagini di ciascuna di fluoroforo usando un microscopio confocale. Utilizzare le lunghezze d'onda di eccitazione per fluorofori e filtri impiegati presentati nella tabella 3.
- Eseguire l'analisi dell'immagine computerizzata con software adeguati a seconda del tipo di confocale utilizzato per catturare le immagini.
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Representative Results
Abbiamo già descritto la generazione di topi che esprimono entrambi giornalisti fluorescenti GFP e tdTomato che rilevano espressione ChAT 14. In breve, i topi Chat-Cre sono stati accoppiati con R26R: floxSTOP: tdTomato animali per produrre chat Cre; R26R: topi tdTomato (chiamati ChAT-Cre tdTomato): floxSTOP. Questi animali sono stati poi accoppiati con omozigoti topi reporter Chat-GFP. Gli embrioni sono stati isolati e tessuti sono stati sezionati prima di essere fissa e immunoistochimica come sopra, con gli anticorpi elencati nella tabella 1. L'intestino tenue distale (SI) e del colon prossimale sono stati analizzati in E11, E13.5 e E16.5
A E11, neuroni Hu-positivi sono presenti all'interno del distale SI, ma NCC non hanno ancora raggiunto il colon prossimale (Figura 1). A questo punto di tempo, la maggior parte dei neuroni Hu-positivi dimostrano immunoreattività ChAT nonché GFP positività. È interessante notare, a questo punto di tempo, esprESSIONE del tdTomato costrutto ChAT-Cre non è rilevabile. Con E13.5, la maggior parte dei neuroni Hu-positivi sono entrambi ChAT-IR e chat-GFP positivi, e un piccolo numero di neuroni ChAT-Cre tdTomato positivi sono visti. Il numero di ChAT-Cre neuroni tdTomato positivi aumenta di E16.5, ma continua ad essere una piccola frazione del numero di neuroni ChAT-IR.
Figura 1. Immagini rappresentative della colinergica neuroni nel distale dell'intestino tenue e del colon in embrionali Giorno 11. E11, nel distale SI (etichetta "SI") e del colon prossimale (etichettati "Co"), i neuroni Hu-positivi (blu) sono presenti soltanto nel SI in questa fase. La maggior parte dei neuroni Hu-positivi sono co-immunostained con ChAT-IR (bianco) e chat-GFP (green). Tuttavia, in questo punto di tempo, nessuno di questi neuroni sono ChAT-Cre tdTomato positivo (rosso). Scalabar = 100 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Immagini rappresentative della colinergica neuroni nel distale dell'intestino tenue e del colon in embrionali giorni 13.5 e 16.5. Immagine mostra neuroni colinergici nel piccolo intestino distale a E13.5 (pannelli superiori) e E16.5 (pannelli inferiori). Al E13.5 la maggior parte dei neuroni Hu-positivi erano ChAT-IR e chat-GFP (pannelli superiori) positivi. Un piccolo numero di questi co-espressi ChAT-Cre tdTomato. Da E16.5, più neuroni ChAT-Cre tdTomato sono stati trovati in gangli nascente (pannelli inferiori). Barra di scala = 100 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questo figure.
| Anticorpi Primari | |||
| Antigene | Immunogen | Diluizione | Fornitore e dettagli |
| Hu (proteina neuronale umano) | Hu proteine | 1: 1.000 | Siero da paziente umano (Madison, WI) |
| GFP (Green Fluorescent Protein) | Proteina GFP, frazione IgY | 1: 1.000 | Aves Lab, Inc. (Tigard, OR), Pollo policlonale, GFP-1020 |
| Chat (colina acetiltransferasi) | Enzima placentare umano | 1: 100 | Millipore (Billerica, MA), Capra policlonale, AB144P |
| Anticorpi secondari | |||
| Nome | Fluoroforo | Diluizione | Fornitore e dettagli |
| Donkey anti-umano DyLight 405 | 1: 500 | Jackson ImmunoResearch Laboratories (West Grove, PA), 709-475-149 | |
| Donkey anti-Pollo | Cy2 | 1: 500 | Jackson ImmunoResearch Laboratories (West Grove, PA), 703-225-155 |
| Donkey anti-Capra | Cy5 | 1: 500 | Jackson ImmunoResearch Laboratories (West Grove, PA), 705-175-147 |
Tabella 1. Dettagli di anticorpi primari e secondari utilizzati nello studio. Gli anticorpi primari e secondari utilizzati in questo studio, insieme con il proprio fornitore e le diluizioni utilizzate.
| Anticorpi Primari | |||||||
| Antigene | Diluizione | Fornitore | Anticorpo secondario | ||||
| Sox10 | 01:50 | Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX | Donkey anti-Capra | ||||
| p75 | 1: 250 | Promega, Madison WI | Donkey anti-coniglio | ||||
| PGP9.5 | 1: 1.000 | Abcam, Cambridge, MA | Donkey anti-coniglio | ||||
| BFABP | 1: 500 | Millipore, Billerica, MA | Donkey anti-coniglio | ||||
| S-100 | 1: 500 | DAKO, Carpinteria, CA | Donkey anti-coniglio | ||||
| GFAP | 1: 500 | DAKO, Carpinteria, CA | Donkey anti-coniglio | ||||
| nNOS | 1: 500-1000 | Emson, Cambridge, Regno Unito | Donkey anti-Sheep | ||||
| VIP (polipeptide intestinale vasoattivo) | 1: 500 | Epstein & Paulsen, Madison, WI | Donkey anti-coniglio | ||||
| Sostanza P | 1: 200-400 | DiaSorin, Stillwater, MN | Donkey anti-Sheep | ||||
| Anticorpi secondari | |||||||
| Nome | Diluizione | Fornitore e dettagli | Fluoroforo | ||||
| Donkey anti-umano | 1: 500-1000 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA | DyLight 488 | ||||
| Donkey anti-umano | 1: 1.000 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA | Cy3 | ||||
| Donkey anti-coniglio | 1: 500 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA | DyLight 488 | ||||
| Donkey anti-coniglio | 1: 500 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA | Cy3 | ||||
| Donkey anti-Sheep | 1: 500 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA | Cy2 | Donkey anti-Sheep | 1: 1.500 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA | Cy3 |
| Donkey anti-Capra | 1: 500 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA | Cy3 | ||||
Tabella 2. Ulteriori anticorpi primari e secondari di uso in studio dello sviluppo ENS. Gli anticorpi primari e secondari che abbiamo precedentemente impiegati nei nostri studi di sviluppo ENS.
| Eccitazione | Emissione | |||
| Linea Laser | Fluoroforo Tipo | Esempi | Fotomoltiplicatore Tubo | Opzioni filtro |
| 408 nm | Blu | Alexa Fluor 405, Cascade Blu, la cumarina 30, DAPI, Hoechst, Pacific Blue, la maggior parte dei punti quantici | 1 | BP 425-475 nm |
| 488 nm | Verde | Alexa Fluor 488, ATTO 488, Calceina, Cy2, eGFP, coniugati, Oregon Verde, YO-PRO-1 | 2 | BP 500-550 nm |
| 561 nm | Rosso | Alexa Fluor 546, 555, 568, e 594, Cy3, DII, DsRed, mCherry, ficoeritrina (PE), Iodio propidio (PI), RFP, TAMRA, tdTomato, TRITC | 3 | BP 570-620 nm |
| 638 nm | Far Red | Alexa Fluor 633 e 647, Allophycocyanin (APC), Cy5, TO-PRO-3 | 4 | BP 663-738 nm |
Tabella 3. confocale lunghezze d'onda di eccitazione di imaging, fluorofori e filtri. Le lunghezze d'onda di eccitazione, fluorofori rilevabili e filtri impiegati sono presentati. Queste informazioni possono essere utilizzate nella scelta di combinazioni di anticorpi secondari per multicolore immunofluorescenza.
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Discussion
Il nostro laboratorio e altri hanno dimostrato che i difetti intestinali in HSCR non sono limitati al colon agangliare ma esteso prossimalmente, anche nel piccolo intestino ganglionated 5,15,16. Queste alterazioni sono cambiamenti nella ENS neuronale densità e neurotrasmettitore fenotipo e possono rappresentare dismotilità che è stata osservata nei pazienti con HSCR. Abbiamo utilizzato le tecniche di cui sopra nei nostri sforzi per comprendere le determinanti della formazione ENS. In particolare, queste tecniche sono state impiegate per visualizzare neuronali ossido nitrico sintasi (nNOS) neuroni, vasoattivi neuroni polipeptide intestinale (VIP), così come la colina acetiltransferasi (ChAT) neuroni (Tabella 2) 5. Uno dei principali vantaggi di questa tecnica è la possibilità di memorizzare i campioni nel 30% di saccarosio per successivo processo, sia per immunostaining o per l'incorporamento e criosezionamento.
NCC colonizzazione dell'intestino avviene come avanzamento fronte d'onda from E9.5 a E14.5. Immunocolorazione con Hu, che identifica i neuroni, come sopra descritto, con analisi d'immagine computerizzata, consentono confronti quantitativi di densità neuronale. Riduzione della densità neuronale trovano porzioni dell'intestino ganglionated di HSCR 5, così come in altri modelli di disturbi della motilità intestinale 13. I topi con una delezione condizionale di Hand2 dimostrano cambiamenti nelle proporzioni di neuroni che esprimono neurotrasmettitori differenti così come i numeri neuronali ridotti. Inoltre, gli animali con sovraespressione di Noggin o PTEN dimostrano aumento della densità neuronale lungo il loro intestino 6,17.
Il saldo dei fenotipi neurotrasmettitore tra neuroni del ENS è strettamente regolata, con conseguente contrazione coordinata della parete intestinale per il movimento di contenuto luminale, regolazione del flusso sanguigno e l'assorbimento dei nutrienti. Una volta NCC acquisire un'identità neuronale, vi è una stretta finestra di tempo primaimpegnarsi in un fenotipo neurotrasmettitore 14. Abbiamo recentemente dimostrato che immunostaining identifica una chiacchierata neurotrasmettitore fenotipo a E10.5, una fase embrionale, prima di quanto osservato con modelli giornalista genetici (ad esempio, chat-Cre o chat-GFP) 14. Inoltre, Chat neuroni immunoreattivi raggiungono livelli adulti (in proporzione di tutti i neuroni dell'ENS) nelle prime fasi di sviluppo, un risultato che suggerisce che i neuroni ChAT possono avere un ruolo nella regolazione ulteriore differenziazione neuronale nel ENS.
Nitrico sintasi ossido (NOS) è il neurotrasmettitore relax primaria trovato nella ENS, ed è proporzionalmente aumentato in neuroni dell'ENS lungo l'intestino in HSCR 5. Inoltre, alterazioni peptide intestinale vasoattivo (VIP), un neurotrasmettitore che partecipa anche nel mediare il rilassamento muscolare e regolare il flusso di sangue lungo la parete intestinale, si trovano in modelli HSCR 5. Questi dati suggeriscono che, per comprendere come la components della ENS regolano la sua funzione, un esame sistematico dei diversi neurotrasmettitori dovrebbe essere intrapreso. Le tecniche qui presentate possono essere facilmente adattati per consentire questo tipo di analisi utilizzando anticorpi appropriati.
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Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato bythe americana Pediatric Surgical Association Foundation Award (AG) e il National Institutes of Health K08DK098271 (AG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline | Oxoid | BR0014G | |
| Sucrose | Fisher | S2 | |
| Sodium azide | Fisher | BP9221 | |
| Bovine serum albumin | Fisher | BP1605 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| 60 mm Petri dishes | Fisher | FB0875713A | |
| Fluorescence microscope | Nikon | SMZ-18 stereoscope | |
| Dissection microscope | Nikon | SMZ-18 stereoscope | |
| Fine forceps | Fine science tools | 11252-20 | |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | VWR | 20170-038 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech, Birmingham, AL | 0100-01 | |
| Glass slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Cover glass | VWR | 16004-330 | |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon A1 | |
| Nikon Elements | Nikon |
References
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