Introduction
Een functionerende enterisch zenuwstelsel (ENS), die de beweeglijkheid, de opname van voedingsstoffen, en de lokale doorbloeding controleert, is essentieel voor het leven 1. De ENS wordt gevormd door neurale cellen (NCC) die prolifereren, te migreren en koloniseren de darm, waar ze differentiëren tot ganglia neuronen en gliacellen. De ziekte van Hirschsprung (HSCR, Online Mendelian Inheritance in Man), een multigeneic aangeboren aandoening met een incidentie van 1 op 4000 levendgeborenen, kan worden beschouwd als de prototypische ziekte voor het bestuderen verstoord ENS formatie. In HSCR, NCC niet te migreren en koloniseren verschillende lengten van de distale dikke darm 2. Bovendien, andere veel voorkomende gastro-intestinale (GI) ontwikkelingsstoornissen gebreken in de pediatrische populatie, zoals anorectal misvormingen, intestinale atresias en motiliteitsstoornissen gepaard gaan met stoornissen in de basis ENS functies, en zijn waarschijnlijk geassocieerd met subtiele, ondergewaardeerde, anatomische veranderingen en functionele veranderingen inde ENS 3-6. Daarom kan technieken die ons toelaten om de ontwikkeling determinanten van ENS vorming begrijpen licht werpen op het ontstaan en de mogelijke behandeling van pediatrische maagdarmstelsel aandoeningen.
Na migratie en kolonisatie, NCC differentieert in neuronen met markers die specifiek zijn voor hun neurotransmitter fenotype. Cholinergische neuronen omvatten ongeveer 60% van enterische neuronen 7 en kan worden gedetecteerd door kleuring choline acetyltransferase (ChAT), het enzym synthetiserende de excitatoire neurotransmitter acetylcholine. Historisch gezien, probeert visualiseren cholinerge neuronen veroorzaakt werden door verschillende antigeenspecificiteit van antilichamen gericht tegen het centrale zenuwstelsel (CNS) ChAT versus perifere zenuwstelsel (PNS) ChAT 8-10. Echter, antilichamen gericht tegen ChAT placenta herkennen zowel de centrale en perifere ChAT 11-13, en we hebben onlangs beschreven technieken die het mogelijk maken voor Visuabiliseren van ENS cholinergische neuronen met een hoge gevoeligheid eerder in ontwikkeling dan is bereikt met ChAT reporter lijnen 14.
Hier presenteren we een techniek voor het ontleden, fixeren en immunokleuring van het murine embryonale spijsverteringskanaal aan ENS neurotransmitter expressie in neuronen te visualiseren. FloxSTOP:: tdTomato dieren produceren Chat Cre; R26R: Voor deze studies hebben we ChAT-Cre muizen gekruist met R26R benut floxSTOP: tdTomato muizen (gedefinieerd als ChAT-Cre tdTomato het hele manuscript). Deze dieren werden vervolgens gekruist met homozygote ChAT-GFP reporter muizen, muizen die zowel fluorescerende verslaggevers dat ChAT expressie 14 te detecteren verkrijgen. Deze twee reporter dieren zijn op een C57BL / 6J achtergrond en zijn commercieel verkrijgbaar (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De universiteit van Wisconsin Animal Care en gebruik goedgekeurd van alle procedures.
1. Voorbereiding van de Solutions
- Gebruik 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) als dissectie buffer en spoeloplossing.
- Bereid 30% sucrose door weging van 30 g sucrose en plaats in een fles. Voeg 99 ml 1x PBS en voeg 1 ml 10% natriumazide. Grondig mengen totdat alle sucrose opgelost. Bewaar bij 4 ° C totdat ze nodig waren.
- Bereid blockingbuffer door mengen 1x PBS, 3% bovine serum albumine (BSA) en 0,1% Triton-X-100. Meng goed en bewaar in de koelkast totdat het nodig is.
- Bereid 8% paraformaldehyde (PFA) oplossing in 1 x PBS door weging van de juiste hoeveelheid PFA in 1x PBS en vervolgens geïncubeerd bij 65 ° C totdat deze volledig is opgelost. Bewaren in 25 ml porties in de -20 ° C vriezer totdat het nodig is. Verdun tot 4% PFA in 1x PBS op de dag van gebruik.
2. Embryo en Gut Dissection
- In overeenstemming met de Institutional Animal Care en gebruik Comite goedgekeurd protocollen, euthanaseren getimede zwangere muis en de overdracht van de baarmoeder in een 60 mm petrischaal met ijskoude 1x PBS.
- Onder een dissectie microscoop met een scherpe schaar, knip de baarmoederwand open voor de embryo's bloot te leggen. Verwijder het embryo uit de baarmoeder en plaats in een schone 60 mm petrischaal met ijskoude 1x PBS.
- Euthanaseren elk embryo door onthoofding in ijskoud 1x PBS. Als u gebruik maakt van transgene muizen met fluorescerende eiwitten, onder fluorescentie verlichting, het identificeren van de positieve transgene embryo's.
- Ontleden het maagdarmkanaal van elk embryo met behulp van een dissectie microscoop. Met behulp van fijne tang, oriënteren het embryo zodanig dat de linkerkant naar boven is gericht en de rechterkant tegen de onderkant van de petrischaal. Verwijder de bovenste lichaamswand van het embryo naar de interne organen bloot. Plaats fijne tang tussen de dorsale lichaamswand en de inwendige organen. Cross de tang tegen elkaar in een schaarachtige snijwerking de interne organen van het embryo verwijderd.
- Verdere sub-ontleden het spijsverteringskanaal van het omliggende organen en plaats elk maagdarmkanaal in een 1,5 ml microcentrifugebuis met ijskoud 1x PBS.
3. Fixatie van GI Tracts
- Spoel elke maagdarmkanaal 3 maal met ijskoude 1x PBS en daarna vervangen door 4% PFA. Bevestig de GI traktaten in de 1,5 ml microcentrifuge buizen op een schommelende platform bij kamertemperatuur 1,5 uur. Spoel de GI stukken 3 maal gedurende 5 min bij kamertemperatuur en vervolgens gedurende 1 uur op het schudplatform. In dit stadium, bewaar de GI stukken bij 4 ° C in 30% sucrose in 1 x PBS bevattende 0,1% natrium- azide tot gebruik.
OPMERKING: U bewaar het embryo in 30% sucrose gedurende één jaar zonder dat dit de integriteit van de weefsels. Opslag van de monsters in 30% sucrose maakt latere verwerking van de monsters hetzij voor immunokleuring en in oktober voor cryo-sectioning. Als alternatief gaan met de immunokleuring protocol hieronder beschreven.
4. Immunokleuring Protocol
- Indien monsters zijn opgeslagen in 30% sucrose, spoel ze 3 keer voor 20 min in 1x PBS op een schommelende platform.
- Plaats de GI traktaten in het blokkeren van oplossing op een schommelende platform voor 1 uur bij kamertemperatuur.
- Verwijder de blokkerende oplossing en incubeer de GI stukken met de juiste hoeveelheid van primaire antilichamen verdund in blokkerende oplossing hetzij 4 uur bij kamertemperatuur of O / N bij 4 ° C op een schudplatform. Met 1: 1000 verdunning van humaan anti-Hu-antilichaam (verkregen serum van patiënt), 1: 1000 verdunning van anti-chicken green fluorescent protein (GFP) antilichaam en 1: 100 verdunning van geit anti-ChAT antilichaam.
OPMERKING: We gebruiken een humaan anti-Hu antilichaam dat lokaal is verkregen van een patiënt, maar anti-Hu antilichamen zijn commercieel verkrijgbaar, bijvoorbeeld, muis anti-Hu, (gebruik bij 1: 500 verdunning). - Spoel de GI traktaten in 1x PBS3 maal gedurende 5 min en vervolgens gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op een schudplatform.
- Vervang 1x PBS met secundaire antilichamen verdund 1: 500 in blokkerende oplossing op een schudplatform voor of 4 uur bij kamertemperatuur of O / N bij 4 ° C. Gebruik ezel anti-humaan amine-reactieve kleurstof zoals Dylight, ezel anti-kip Cy2 en ezel anti-geit Cy5. Bij gebruik van de muis anti-Hu antilichaam gebruik dan een 1: 500 verdunning van ezel anti-muis amine-reactieve kleurstof 405.
Opmerking: De intensiteit van de endogene GFP en tdTomato expressie en de helderheid van immunokleuring stijging met ontwikkelingsleeftijd. Wij doorgaans immunostain embryonale ingewanden afzonderlijk in 0,2 ml buizen met 150 gl kleuroplossing om de hoeveelheid gebruikte antilichaam verminderen en ook om efficiënte kleuring van het weefsel te verzekeren. - Spoel de GI stukken in 1x PBS 3 maal gedurende 5 min en vervolgens gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op een schudplatform.
- Plaats een paar druppels fixeermiddel fluorescentie met DAPI op een glasplaatje. Dompel de GI tract in de fluorescentie fixeermiddel en voeg een afdekglas direct op het weefsel. De fluorescentie fixeermiddel -G is een in water oplosbare verbinding die een semi-permanente afdichting zorgt.
OPMERKING: Gebruik fluorescentie montage medium zoals Vectashield dat is een glycerol gebaseerde montage medium dat verkleuring en fotobleken van antilichamen voorkomt. Beide producten kunnen weefsels worden opgeslagen gedurende lange tijd bij 4 ° C. - Beelden vastleggen van elk fluorofoor met een confocale microscoop. Gebruik excitatie golflengten fluoroforen en filters gebruikt in tabel 3.
- Voer computergestuurde beeldanalyse behulp van geschikte software, afhankelijk van het type gebruikt voor confocale beelden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We hebben eerder beschreven het genereren van muizen die zowel GFP en tdTomato fluorescerende verslaggevers dat ChAT expressie 14 te detecteren. In het kort werden Chat Cre muizen gekruist met R26R: floxSTOP: tdTomato dieren produceren Chat Cre; R26R: floxSTOP: tdTomato muizen (de zogenaamde ChAT-Cre tdTomato). Deze dieren werden vervolgens gekruist met homozygote ChAT-GFP reporter muizen. Embryo's werden geïsoleerd en weefsels voorafgaand aan vast ontleed en immuungekleurd zoals hierboven, met de in tabel 1 opgesomde antilichamen. Het distale dunne darm (SI) en proximale colon werden geanalyseerd E11, E13.5 en E16.5
Bij E11, Hu-positieve neuronen aanwezig in het distale SI, maar NCC nog niet het proximale colon (figuur 1) bereikt. Op dit tijdstip, de meeste Hu-positieve neuronen aangetoond ChAT-immuunreactiviteit en GFP positiviteit. Interessant is op dit tijdstip, exprsessieschijven van de ChAT-Cre tdTomato constructie is niet aantoonbaar. Door E13.5, de meerderheid van de Hu-positieve neuronen zijn beide ChAT-IR en chat-GFP positieve, en een klein aantal ChAT-Cre tdTomato-positieve neuronen worden gezien. Het aantal ChAT-Cre tdTomato-positieve neuronen stijgt met E16.5, maar blijft een kleine fractie van het aantal ChAT-IR neuronen.
Figuur 1. Vertegenwoordiger afbeeldingen van Cholinerge neuronen in de distale dunne en dikke darm bij embryonale Day 11. Op E11, in de distale SI (het label "SI") en proximale colon (label "Co"), Hu-positieve neuronen (blauw) alleen aanwezig in het SI in dit stadium. De meeste Hu-positieve neuronen-co immunostained met ChAT-IR (wit) en chat-GFP (groen). Echter, op dit tijdstip, geen van deze neuronen ChAT-Cre tdTomato positief (rood). Schaalbar = 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Vertegenwoordiger afbeeldingen van Cholinerge neuronen in de distale dunne en dikke darm bij embryonale dagen 13,5 en 16,5. Het beeld toont cholinerge neuronen in de distale dunne darm bij E13.5 (bovenste panelen) en E16.5 (onderste panelen). Bij E13.5 de meerderheid van Hu-positieve neuronen waren ChAT-IR en chat-GFP positieve (bovenste panelen). Een klein aantal van deze co-uitgedrukt ChAT-Cre tdTomato. Door E16.5 werden meer ChAT-Cre tdTomato neuronen gevonden in ontluikende ganglia (onderste panelen). Schaal bar = 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figur bekijkene.
| Primaire antilichamen | |||
| Antigeen | Immunogeen | Verdunning | Leverancier & Details |
| Hu (Menselijk neuronaal proteïne) | Hu eiwit | 1: 1000 | Serum van menselijke patiënt (Madison, WI) |
| GFP (Green Fluorescent Protein) | GFP-eiwit, IgY fractie | 1: 1000 | Aves Lab, Inc. (Tigard, OR), Chicken polyklonaal, GFP-1020 |
| Chat (cholineacetyltransferase) | Menselijke placenta enzym | 1: 100 | Millipore (Billerica, MA), Geit polyklonaal, AB144P |
| Secundaire Antilichamen | |||
| Naam | Fluorofoor | Verdunning | Leverancier & Details |
| Donkey anti-Human Dylight 405 | 1: 500 | Jackson ImmunoResearch Laboratories (West Grove, PA), 709-475-149 | |
| Donkey anti-Chicken | Cy2 | 1: 500 | Jackson ImmunoResearch Laboratories (West Grove, PA), 703-225-155 |
| Donkey anti-Goat | Cy5 | 1: 500 | Jackson ImmunoResearch Laboratories (West Grove, PA), 705-175-147 |
Tabel 1. Details van primaire en secundaire antilichamen gebruikt in het onderzoek. De primaire en secundaire antilichamen gebruikt in deze studie, samen met de leverancier en de verdunningen gebruikt.
| Primaire antilichamen | |||||||
| Antigeen | Verdunning | Leverancier | Secundair antilichaam | ||||
| Sox10 | 01:50 | Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX | Donkey anti-Goat | ||||
| p75 | 1: 250 | Promega, Madison WI | Ezel anti-konijn | ||||
| PGP9.5 | 1: 1000 | Abcam, Cambridge, MA | Ezel anti-konijn | ||||
| BFABP | 1: 500 | Millipore, Billerica, MA | Ezel anti-konijn | ||||
| S-100 | 1: 500 | DAKO, Carpinteria, CA | Ezel anti-konijn | ||||
| GFAP | 1: 500 | DAKO, Carpinteria, CA | Ezel anti-konijn | ||||
| nNOS | 1: 500-1000 | Emson, Cambridge, UK | Ezel anti-schaap | ||||
| VIP (Vasoactive Intestinal Polypeptide) | 1: 500 | Epstein & Paulsen, Madison, WI | Ezel anti-konijn | ||||
| Substance P | 1: 200-400 | DiaSorin, Stillwater, MN | Ezel anti-schaap | ||||
| Secundaire Antilichamen | |||||||
| Naam | Verdunning | Leverancier & Details | Fluorofoor | ||||
| Donkey anti-Human | 1: 500-1000 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA | Dylight 488 | ||||
| Donkey anti-Human | 1: 1000 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA | Cy3 | ||||
| Ezel anti-konijn | 1: 500 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA | Dylight 488 | ||||
| Ezel anti-konijn | 1: 500 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA | Cy3 | ||||
| Ezel anti-schaap | 1: 500 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA | Cy2 | Ezel anti-schaap | 1: 1500 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA | Cy3 |
| Donkey anti-Goat | 1: 500 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA | Cy3 | ||||
Tabel 2. Aanvullende primaire en secundaire antilichamen voor gebruik in het bestuderen van ENS ontwikkeling. De primaire en secundaire antilichamen die we eerder hebben gebruikt in onze studies van ENS ontwikkeling.
| Opwinding | Emissie | |||
| Laser Line | Fluorofoor Type | Voorbeelden | Fotomultiplicator | Filter Opties |
| 408 nm | Blauw | Alexa Fluor 405, Cascade Blauw, Cumarine 30, DAPI, Hoechst, Pacific Blue, de meeste quantum dots | 1 | BP 425-475 nm |
| 488 nm | Groen | Alexa Fluor 488, ATTO 488, Calceïne, Cy2, eGFP, FITC, Oregon Green, YO-PRO-1 | 2 | BP 500-550 nm |
| 561 nm | Rood | Alexa Fluor 546, 555, 568 en 594, Cy3, DII, DsRed, mCherry, fycoerythrine (PE), propidiumjodide (PI), RFP, TAMRA, tdTomato, TRITC | 3 | BP 570-620 nm |
| 638 nm | Far Red | Alexa Fluor 633 en 647, allofycocyanine (APC), Cy5, TO-PRO-3 | 4 | BP 663-738 nm |
Tabel 3. Confocale beeldvorming excitatiegolflengten, fluoroforen en filters. De golflengten, detecteerbaar fluoroforen en filters gebruikt worden. Deze informatie kan gebruikt worden bij het kiezen van combinaties van secundaire antilichamen voor multicolor immunofluorescentie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ons laboratorium en anderen hebben aangetoond dat intestinale afwijkingen in HSCR niet worden beperkt tot de aganglionic colon maar proximaal uitgebreid, zelfs tot in de ganglionated dunne darm 5,15,16. Deze veranderingen omvatten veranderingen in ENS neuronale dichtheid en neurotransmitter fenotype en kan goed zijn voor dysmotiliteit die is waargenomen bij patiënten met HSCR. We hebben de bovenstaande technieken gebruikt in onze inspanningen om de determinanten van ENS formatie te begrijpen. Specifiek zijn deze technieken zijn gebruikt om neuronale stikstofoxidesynthase (nNOS) neuronen, vasoactief intestinaal polypeptide neuronen (VIP), en choline acetyltransferase (ChAT) neuronen (Tabel 2) 5 visualiseren. Een belangrijk voordeel van deze techniek is de mogelijkheid om samples op in 30% sucrose voor latere verwerking, hetzij voor immunokleuring of inbedden en cryosectioning.
NCC kolonisatie van de darm optreedt als een voortschrijdend golffront from E9.5 naar E14.5. Immunokleuring met Hu die neuronen identificeert, zoals hierboven beschreven, in combinatie met computergestuurde beeldanalyse maakt kwantitatieve vergelijkingen van neuronale dichtheid. Verlagingen van neuronale dichtheid gevonden gedeelten van de darm van ganglionated HSCR 5, alsmede in andere modellen van intestinale dysmotiliteit 13. Muizen met een voorwaardelijke verwijdering van hand2 tonen veranderingen in de verhoudingen van neuronen die verschillende neurotransmitters evenals verminderde neuronale nummers. Daarnaast dieren met overexpressie van Noggin of PTEN die een verhoogde neuronale dichtheid langs hun darmen 6,17.
Het saldo van de neurotransmitter fenotypes tussen neuronen van het ENS wordt strak gereguleerd, wat resulteert in een gecoördineerde contractie van de darmwand voor beweging van de luminale inhoud, regulering van de bloedstroom en de opname van voedingsstoffen. Zodra NCC verwerven van een neuronale identiteit, is er een smal tijdvenster voorhet plegen van een neurotransmitter fenotype 14. We hebben onlangs aangetoond dat immunokleuring identificeert een praatje neurotransmitter fenotype op E10.5, een eerder embryonaal stadium dan waargenomen met genetische reporter modellen (bijv, chat-Cre of chat-GFP) 14. Bovendien, chat immunoreactieve neuronen bereiken volwassen niveau (als percentage van alle ENS neuronen) vroeg in de ontwikkeling, een resultaat dat suggereert dat ChAT neuronen een rol spelen in het reguleren van verdere neuronale differentiatie in de ENS kunnen hebben.
Nitric oxide synthase (NOS) is de voornaamste neurotransmitter ontspanning in de ENS en proportioneel vergroot ENS neuronen langs de darm in HSCR 5. Bovendien, veranderingen in vasoactieve intestinale peptide (VIP), een neurotransmitter die ook deelneemt bij het mediëren van spierontspanning en reguleren de bloedstroom langs de darmwand worden gevonden in HSCR modellen 5. Deze gegevens suggereren dat, om te begrijpen hoe de components van de ENS regelen zijn functie, moet een systematisch onderzoek van de verschillende neurotransmitters worden ondernomen. De hier gepresenteerde technieken kunnen gemakkelijk worden aangepast om dit type analyse mogelijk maken met behulp van de geschikte antilichamen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund byThe American Pediatric Surgical Association Foundation Award (AG) en de National Institutes of Health K08DK098271 (AG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline | Oxoid | BR0014G | |
| Sucrose | Fisher | S2 | |
| Sodium azide | Fisher | BP9221 | |
| Bovine serum albumin | Fisher | BP1605 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| 60 mm Petri dishes | Fisher | FB0875713A | |
| Fluorescence microscope | Nikon | SMZ-18 stereoscope | |
| Dissection microscope | Nikon | SMZ-18 stereoscope | |
| Fine forceps | Fine science tools | 11252-20 | |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | VWR | 20170-038 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech, Birmingham, AL | 0100-01 | |
| Glass slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Cover glass | VWR | 16004-330 | |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon A1 | |
| Nikon Elements | Nikon |
References
- Gershon, M. D. Developmental determinants of the independence and complexity of the enteric nervous system. Trends Neurosci. 33 (10), 446-456 (2010).
- Amiel, J., Sproat-Emison, E., et al. Hirschsprung disease, associated syndromes and genetics: a review. J Med Genet. 45 (1), 1-14 (2008).
- Erickson, C. S., Barlow, A. J., et al. Colonic enteric nervous system analysis during parenteral nutrition. J Surg Res. 184 (1), 132-137 (2013).
- Erickson, C. S., Zaitoun, I., Haberman, K. M., Gosain, A., Druckenbrod, N. R., Epstein, M. L. Sacral neural crest-derived cells enter the aganglionic colon of Ednrb(-/-) mice along extrinsic nerve fibers. J Comp Neurol. 20 (3), 620-632 (2011).
- Zaitoun, I., Erickson, C. S., et al. Altered neuronal density and neurotransmitter expression in the ganglionated region of Ednrb null mice: implications for Hirschsprung's disease. Neurogastroenterol Motil. , (2013).
- Margolis, K. G., Stevanovic, K., et al. Enteric neuronal density contributes to the severity of intestinal inflammation. Gastroenterology. 141 (2), 588-598 (2011).
- Qu, Z. -D., Thacker, M., Castelucci, P., Bagyánszki, M., Epstein, M. L., Furness, J. B. Immunohistochemical analysis of neuron types in the mouse small intestine. Cell Tissue Res. 334 (2), 147-161 (2008).
- Bian, X. -C., Bornstein, J. C., Bertrand, P. P. Nicotinic transmission at functionally distinct synapses in descending reflex pathways of the rat colon. Neurogastroenterol Motil. 15 (2), 161-171 (2003).
- Johnson, C. D., Epstein, M. L. Monoclonal antibodies and polyvalent antiserum to chicken choline acetyltransferase. J Neurochem. 46 (3), 968-976 (1986).
- Tooyama, I., Kimura, H. A protein encoded by an alternative splice variant of choline acetyltransferase mRNA is localized preferentially in peripheral nerve cells and fibers. J Chem Neuroanat. 17 (4), 217-226 (2000).
- Koga, T., Bellier, J. -P., Kimura, H., Tooyama, I. Immunoreactivity for Choline Acetyltransferase of Peripheral-Type (pChAT) in the Trigeminal Ganglion Neurons of the Non-Human Primate Macaca fascicularis. Acta histochemica et cytochemica. 46 (2), 59-64 (2013).
- Sang, Q., Young, H. M. The identification and chemical coding of cholinergic neurons in the small and large intestine of the mouse. Anat Rec. 251 (2), 185-199 (1998).
- Lei, J., Howard, M. J. Targeted deletion of Hand2 in enteric neural precursor cells affects its functions in neurogenesis, neurotransmitter specification and gangliogenesis, causing functional aganglionosis. Development (Cambridge, England). 138 (21), 4789-4800 (2011).
- Erickson, C. S., Lee, S. J., Barlow-Anacker, A. J., Druckenbrod, N. R., Epstein, M. L., Gosain, A. Appearance of cholinergic myenteric neurons during enteric nervous system development: comparison of different ChAT fluorescent mouse reporter lines. Neurogastroenterol Motil. 26 (6), 874-884 (2014).
- Teitelbaum, D. H., Caniano, D. A., Qualman, S. J. The pathophysiology of Hirschsprung's-associated enterocolitis: importance of histologic correlates. J Pediatr Surg. 24 (12), 1271-1277 (1989).
- Aslam, A., Spicer, R. D., Corfield, A. P. Children with Hirschsprung's disease have an abnormal colonic mucus defensive barrier independent of the bowel innervation status. J Pediatr Surg. 32 (8), 1206-1210 (1997).
- Puig, I., Champeval, D., De Santa Barbara, P., Jaubert, F., Lyonnet, S., Larue, L. Deletion of Pten in the mouse enteric nervous system induces ganglioneuromatosis and mimics intestinal pseudoobstruction. J Clin Invest. 119 (12), 3586-3596 (2009).
