Introduction
Un fonctionnement du système nerveux entérique (SNE), qui contrôle la motilité, l'absorption des nutriments, et la circulation sanguine locale, est essentiel à la vie 1. L'ENS est formé par les cellules de la crête neurale (CCN) qui prolifèrent, migrent et colonisent l'intestin, où ils se différencient en neurones des noyaux contenant et les cellules gliales. Maladie de Hirschsprung (Héritage de mendélienne HSCR, en ligne chez l'homme), un trouble congénital multigeneic avec une incidence de 1 sur 4000 naissances vivantes, peut être considéré comme la maladie prototypique pour l'étude de la formation ENS perturbé. Dans HSCR, CCN ne parviennent pas à migrer vers et de coloniser des longueurs variables de l'intestin distal 2. En outre, d'autres gastro-intestinales Fréquent (GI) les défauts de développement dans la population pédiatrique, tels que des malformations ano-rectales, atrésie intestinale et des troubles de la motilité sont associés à des perturbations dans les fonctions de base de l'ENS, et sont susceptibles d'être associées avec subtils, sous-estimés, les changements anatomiques et des changements fonctionnels dansl'ENS 3-6. Par conséquent, les techniques qui nous permettent de comprendre les déterminants du développement de la formation ENS peuvent faire la lumière sur la pathogenèse et le traitement potentiel des troubles du tractus GI pédiatriques.
Après la migration et de la colonisation, la CCN se différencie en neurones avec des marqueurs spécifiques de leur phénotype de neurotransmetteur. Les neurones cholinergiques comprennent environ 60% des neurones entériques 7, et peuvent être détectés par coloration de choline acétyltransférase (ChAT), l'enzyme de synthèse de l'acétylcholine, un neurotransmetteur excitateur. Historiquement, les tentatives de visualiser les neurones cholinergiques ont été confondus par les différentes spécificité antigénique des anticorps dirigés contre le système nerveux central (SNC) Chat contre le système nerveux périphérique (SNP) Tchat 8-10. Cependant, les anticorps dirigés contre placentaire ChAT reconnaître à la fois central et périphérique ChAT 11-13, et nous avons récemment techniques décrites qui permettent de visualisation des neurones cholinergiques ENS avec une grande sensibilité plus tôt dans le développement que ce qui a été réalisé avec des lignes ChAT rapporteurs 14.
Ici, nous présentons une technique de dissection, fixation et immunologique de la GI embryonnaire murin voies de visualiser ENS neurotransmetteur expression dans les neurones. Pour ces études, nous avons utilisé des souris Chat-Cre accouplées avec R26R: animaux tdTomato pour produire Chat-Cre; R26R: floxSTOP souris tdTomato (définis comme CHAT-Cre tdTomato au long du manuscrit): floxSTOP. Ces animaux ont ensuite été accouplées avec des souris rapporteurs de Chat-GFP homozygotes, pour obtenir des souris exprimant les deux reporters fluorescents qui détectent expression ChAT 14. Ces deux animaux rapporteurs sont sur un fond C57BL / 6J et sont disponibles dans le commerce (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME).
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Protocol
L'Université du Wisconsin protection des animaux et l'utilisation Comité a approuvé toutes les procédures.
1. Préparation des solutions
- Utilisez phosphate 1x saline tamponnée (PBS) comme tampon de dissection et la solution de rinçage.
- Préparer 30% de saccharose en pesant 30 g de saccharose et le lieu dans une bouteille. Ajouter 99 ml de 1 x PBS et ajouter de l'azide de sodium à 1 ml de 10%. Mélanger soigneusement jusqu'à ce que le saccharose est dissous. Conserver à 4 ° C jusqu'à ce que nécessaire.
- Préparer la solution de blocage par mélange PBS 1x, 3% d'albumine de sérum bovin (BSA) et 0,1% de Triton-X-100. Mélanger soigneusement et stocker dans le réfrigérateur jusqu'à ce que nécessaire.
- Préparer 8% de paraformaldéhyde (PFA) solution dans PBS 1x par pesée de la quantité appropriée de PFA en 1x PBS puis incuber à 65 ° C jusqu'à ce qu'il soit complètement dissous. Conserver dans 25 ml aliquotes à -20 ° C congélateur jusqu'à ce que nécessaire. Diluer à 4% de PFA dans du PBS 1x, le jour de l'utilisation.
2. embryon et Gut Dissection
- Conformément aux institutionnels de protection des animaux et l'utilisation Comité protocoles approuvés, euthanasier la souris enceinte chronométré et transférer l'utérus dans un 60 mm boîte de Petri contenant de la glace froide 1x PBS.
- Sous un microscope de dissection à l'aide des ciseaux pointus, couper la paroi utérine ouvert pour exposer les embryons. Retirez les embryons de l'utérus et le lieu dans une boîte de 60 mm propre Petri contenant de la glace froide 1x PBS.
- Euthanasier chaque embryon par décapitation dans glacée 1x PBS. Si vous utilisez des souris transgéniques contenant des protéines fluorescentes, sous l'éclairage de fluorescence, d'identifier les embryons transgéniques positives.
- On dissèque le tractus gastro-intestinal de l'embryon en utilisant un microscope de dissection. En utilisant des pinces fines, orienter l'embryon de telle sorte que le côté gauche est orientée vers le haut et le côté droit est contre le fond de la boîte de Pétri. Retirer la paroi supérieure du corps de l'embryon pour exposer les organes internes. Insérez une pince fine entre la paroi dorsale du corps et les organes internes. Cross forceps contre l'autre dans une action de coupe ciseaux pour enlever les organes internes de l'embryon.
- En outre sous-disséquer le tractus GI loin des organes environnants, puis placer chaque tube digestif dans un tube de 1,5 ml contenant glacée 1x PBS.
3. Fixation des GI Tracts
- Rincer chaque tractus GI 3 fois avec de la glace froide 1x PBS puis remplacer par 4% de PFA. Fixer les secteurs de GI dans les 1,5 ml microtubes sur une plate-forme à bascule à la température ambiante pendant 1,5 heures. Rincer les voies gastro-intestinaux 3 fois pendant 5 min à température ambiante puis pendant 1 heure sur la plate-forme à bascule. A ce stade, stocker les voies gastro-intestinales à 4 ° C dans 30% de saccharose dans 1 x PBS contenant de l'azide de sodium à 0,1% jusqu'à ce que nécessaire.
NOTE: Vous pouvez également stocker les embryons dans 30% de saccharose jusqu'à un an sans aucun effet sur l'intégrité des tissus. Stockage des échantillons dans 30% de saccharose permet un traitement ultérieur des échantillons soit pour un marquage ou dans octobre pour cryo-SECTIONIng. Sinon, continuez avec le protocole d'immunocoloration détaillé ci-dessous.
4. Protocole Immunocoloration
- Si les échantillons ont été stockés dans 30% de saccharose, les rincer trois fois pendant 20 minutes dans 1 x PBS sur une plate-forme à bascule.
- Placez les voies gastro-intestinales dans la solution de blocage sur une plate-forme à bascule pendant 1 h à température ambiante.
- Retirer la solution de blocage et incuber les voies gastro-intestinaux avec la quantité appropriée d'anticorps primaires dilués dans une solution de blocage soit pour 4 heures à température ambiante ou O / N à 4 ° C sur une plateforme à bascule. Utilisez 1: 1000 dilution de l'anticorps anti-Hu humaine (sérum obtenu à partir du patient), 1: 1000 dilution de poulet anti-anticorps protéine fluorescente verte (GFP) et 1: 100 dilution des anticorps de chèvre anti-ChAT.
REMARQUE: Nous utilisons un anticorps anti-Hu humain qui a été obtenue localement à partir d'un patient, cependant, les anticorps anti-Hu sont disponibles dans le commerce, par exemple, souris anti-Hu, (utilisation à dilution 1: 500). - Rincer les voies gastro-intestinales en 1x PBSTrois fois pendant 5 min, puis pendant une heure à température ambiante sur un agitateur oscillant.
- Remplacez le 1x PBS avec des anticorps secondaires dilué 1: 500 dans une solution de blocage sur une plate-forme à bascule pour soit 4 heures à température ambiante ou O / N à 4 ° C. Utilisez âne colorant amine réactif anti-humain comme DyLight, Cy2 anti-poulet âne et d'âne anti-chèvre Cy5. Si l'on utilise l'anticorps anti-souris Hu alors utiliser une dilution 1: 500 d'âne anti-souris-amine réactif colorant 405.
NOTE: L'intensité de la GFP endogène et l'expression tdTomato et la clarté de immunocoloration augmentation avec l'âge de développement. Nous typiquement immunocoloration cran embryonnaires individuellement dans des tubes de 0,2 ml avec 150 ul de solution de coloration afin de réduire le volume de l'anticorps utilisé et également efficace pour assurer la coloration du tissu. - Rincer les voies gastro-intestinales dans du PBS 1X 3 fois pendant 5 min, puis pendant 1 heure à température ambiante sur une plate-forme à bascule.
- Placez quelques gouttes de milieu de montage à fluorescence DAPI sur une lame de verre. Plonger les tra IGct dans le moyen de montage de fluorescence et ajouter un verre de protection directement au-dessus du tissu. La fluorescence moyenne de montage -G est un composé soluble dans l'eau qui fournit un joint d'étanchéité semi-permanent.
REMARQUE: Utilisez fluorescence milieu de montage tels que Vectashield qui est un milieu à base de glycérol qui empêche la décoloration et photoblanchiment d'anticorps de montage. Ces deux produits permettent tissus à être stockés pendant de longues périodes de temps à 4 ° C. - Capturer des images de chaque fluorophore de l'aide d'un microscope confocal. Utilisez des longueurs d'ondes d'excitation pour les fluorophores et les filtres utilisés présentés dans le Tableau 3.
- Effectuer l'analyse d'images assistée par ordinateur en utilisant le logiciel approprié selon le type de confocal utilisé pour capturer des images.
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Representative Results
Nous avons déjà décrit la génération de souris exprimant les deux GFP et tdTomato journalistes fluorescentes qui détectent expression ChAT 14. Bref, des souris Chat-Cre ont été accouplés avec R26R: floxSTOP: animaux tdTomato pour produire Chat-Cre; R26R: souris tdTomato (appelés CHAT-Cre tdTomato): floxSTOP. Ces animaux ont ensuite été accouplées avec des souris rapporteurs de Chat-GFP homozygotes. Les embryons ont été isolés et les tissus ont été disséqués avant d'être fixé et immunocolorées comme ci-dessus, avec les anticorps énumérés dans le tableau 1. L'intestin grêle distal (SI) et le côlon proximal à E11 ont été analysés, et E13.5 E16,5
Au E11, les neurones Hu-positifs sont présents au sein du SI distale, mais CCN ont pas encore atteint le côlon proximal (Figure 1). A ce point de temps, la majorité des neurones Hu-positifs démontrent immunoréactivité ChAT ainsi que GFP positivité. Fait intéressant, à ce point de temps, expression de la construction tdTomato Chat-Cre est pas détectable. Par E13.5, la majorité des neurones Hu-positifs sont à la fois Chat-IR et Chat-GFP positif, et un petit nombre de neurones ChAT-Cre tdTomato-positifs sont vu. Le nombre de neurones ChAT-Cre tdTomato-positifs augmente de E16,5, mais continue d'être une petite fraction du nombre de neurones ChAT-IR.
Figure 1. Images représentatifs de neurones cholinergiques dans la partie distale intestin grêle et du côlon au jour embryonnaire 11. Au E11, dans le SI distale (étiqueté "SI") et le côlon proximal (étiquetés "Co"), les neurones Hu-positifs (bleu) ne sont présents au sein du SI à ce stade. La plupart des neurones Hu-positifs sont co-immunocolorées avec Chat-IR (blanc) et Chat-GFP (vert). Toutefois, à ce point de temps, aucune de ces neurones sont Chat-Cre tdTomato positif (rouge). Échellebar = 100 um. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Images représentatifs de neurones cholinergiques dans la partie distale intestin grêle et du côlon au embryonnaires Days 13,5 et 16,5. L'image montre des neurones cholinergiques dans l'intestin grêle distal à E13.5 (panneaux supérieurs) et E16,5 (panneaux inférieurs). À E13.5 la majorité des neurones Hu-positifs étaient Chat-IR et Chat-GFP (panneaux supérieurs) positifs. Un petit nombre de ces co-exprimé Chat-Cre tdTomato. Par E16,5, plus de neurones ChAT-Cre tdTomato ont été trouvés dans les ganglions naissante (panneaux inférieurs). Barre d'échelle = 100 um. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Anticorps primaires | |||
| Antigène | Immunogène | Dilution | Fournisseur & Détails |
| Hu (protéine neuronale humaine) | Protéine Hu | 1: 1000 | Le sérum de patient humain (Madison, WI) |
| GFP (Green Fluorescent Protein) | protéine GFP, fraction IgY | 1: 1000 | Aves Lab, Inc. (Tigard, OR), poulet polyclonaux, GFP-1020 |
| Chat (choline Acetyltransferase) | Enzyme placentaire humain | 1: 100 | Millipore (Billerica, MA), de chèvre polyclonale, AB144P |
| Anticorps secondaires | |||
| Nom | Fluorophore | Dilution | Fournisseur & Détails |
| Anti-humain âne DyLight 405 | 1: 500 | Jackson ImmunoResearch Laboratories (West Grove, PA), 709-475-149 | |
| Anti-poulet âne | Cy2 | 1: 500 | Jackson ImmunoResearch Laboratories (West Grove, PA), 703-225-155 |
| Âne anti-chèvre | Cy5 | 1: 500 | Jackson ImmunoResearch Laboratories (West Grove, PA), 705-175-147 |
Tableau 1. Détails d'anticorps primaires et secondaires utilisés dans l'étude. Les anticorps primaires et secondaires utilisés dans cette étude, avec leur fournisseur et les dilutions utilisées.
| Anticorps primaires | |||||||
| Antigène | Dilution | Fournisseur | Anticorps secondaire | ||||
| Sox10 | 01h50 | Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX | Âne anti-chèvre | ||||
| p75 | 1: 250 | Promega, Madison WI | Anti-lapin d'âne | ||||
| PGP9.5 | 1: 1000 | Abcam, Cambridge, MA | Anti-lapin d'âne | ||||
| BFABP | 1: 500 | Millipore, Billerica, MA | Anti-lapin d'âne | ||||
| S-100 | 1: 500 | DAKO, Carpinteria, CA | Anti-lapin d'âne | ||||
| GFAP | 1: 500 | DAKO, Carpinteria, CA | Anti-lapin d'âne | ||||
| nNOS | 1: 500-1000 | Emson, Cambridge, Royaume-Uni | Âne anti-Mouton | ||||
| VIP (vasoactive intestinal polypeptide) | 1: 500 | Epstein & Paulsen, Madison, WI | Anti-lapin d'âne | ||||
| La substance P | 1: 200-400 | DiaSorin, Stillwater, MN | Âne anti-Mouton | ||||
| Anticorps secondaires | |||||||
| Nom | Dilution | Fournisseur & Détails | Fluorophore | ||||
| Anti-humain âne | 1: 500-1000 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA | DyLight 488 | ||||
| Anti-humain âne | 1: 1000 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA | Cy3 | ||||
| Anti-lapin d'âne | 1: 500 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA | DyLight 488 | ||||
| Anti-lapin d'âne | 1: 500 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA | Cy3 | ||||
| Âne anti-Mouton | 1: 500 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA | Cy2 | Âne anti-Mouton | 1: 1500 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA | Cy3 |
| Âne anti-chèvre | 1: 500 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA | Cy3 | ||||
Tableau 2. anticorps supplémentaires primaires et secondaires de l'utilisation dans l'étude du développement de l'ENS. Les anticorps primaires et secondaires que nous avons déjà utilisés dans nos études sur le développement de l'ENS.
| Excitation | Émission | |||
| Laser Line | Type de Fluorophore | Exemples | Tube photomultiplicateur | Options de filtrage |
| 408 nm | Bleu | Alexa Fluor 405, Blue Cascade, la coumarine 30, DAPI, Hoechst, Pacific Blue, la plupart des points quantiques | 1 | BP 425-475 nm |
| 488 nm | Vert | Alexa Fluor 488, ATTO 488, Calcéine, Cy2, eGFP, FITC, Oregon Green, YO-PRO-1 | 2 | BP 500-550 nm |
| 561 nm | Rouge | Alexa Fluor 546, 555, 568, et 594, Cy3, Dil, DsRed, mCherry, Phycoérythrine (PE), l'iodure de propidium (PI), RFP, TAMRA, tdTomato, TRITC | 3 | BP 570-620 nm |
| 638 nm | Loin Rouge | Alexa Fluor 633 et 647, Allophycocyanine (APC), Cy5, TO-PRO-3 | 4 | BP 663-738 nm |
Tableau 3. confocale longueurs d'ondes d'excitation imagerie, des fluorophores et de filtres. Les longueurs d'onde d'excitation, des fluorophores détectables, et les filtres utilisés sont présentés. Cette information peut être utilisée dans le choix de combinaisons d'anticorps secondaires multicolore pour immunofluorescence.
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Discussion
Notre laboratoire et d'autres ont montré que les défauts intestinales dans HSCR ne sont pas limitées au côlon aganglionnaire mais étendues proximale, même dans l'intestin grêle ganglionated 5,15,16. Ces modifications incluent des changements dans la densité et ENS neurotransmetteur neuronale phénotype et peuvent expliquer dysmotility qui a été observé chez les patients avec HSCR. Nous avons utilisé les techniques ci-dessus dans nos efforts pour comprendre les déterminants de la formation ENS. En particulier, ces techniques ont été utilisées pour visualiser l'oxyde nitrique synthase (nNOS) les neurones, les neurones neuronales du polypeptide intestinal vasoactif (VIP), ainsi que la choline acétyltransférase (ChAT) des neurones (tableau 2) 5. Un des principaux avantages de cette technique est la possibilité de stocker les échantillons dans 30% de saccharose pour un traitement ultérieur, soit pour une immunocoloration ou pour enrobage et cryosectioning.
CCN colonisation de l'intestin se produit un front d'onde avançant comme from E9.5 à E14.5. L'immunocoloration avec Hu, qui identifie les neurones, comme décrit ci-dessus, associée à l'analyse d'image assistée par ordinateur, permet des comparaisons quantitatives de la densité neuronale. La réduction de la densité neuronale se trouvent des parties de l'intestin ganglionated de HSCR 5, ainsi que dans d'autres modèles de dysmotilité intestinale 13. Souris avec une délétion conditionnelle de Hand2 montrent des changements dans les proportions de neurones exprimant différents neurotransmetteurs ainsi que les numéros neuronales réduits. En outre, les animaux avec sur-expression de Noggin ou PTEN démontrent augmentation de la densité neuronale le long de leur intestin 6,17.
Le solde des phénotypes de neurotransmetteurs chez les neurones de l'ENS est étroitement régulée, ce qui entraîne une contraction coordonnée de la paroi intestinale pour un mouvement de contenu luminal, la régulation du débit sanguin et l'absorption des nutriments. Une fois CCN acquérir une identité neuronale, il ya une étroite fenêtre de temps avantengageant à un phénotype de neurotransmetteur 14. Nous avons récemment montré que immunocoloration identifie un neurotransmetteur phénotype ChAT à E10.5, un stade embryonnaire antérieure à celle observée avec les modèles rapporteurs génétiques (par exemple, Chat-Cre ou Chat-GFP) 14. En outre, le chat neurones immunoréactifs atteignent des niveaux adultes (en proportion de tous les neurones ENS) tôt dans le développement, un résultat qui suggère que les neurones ChAT peuvent avoir un rôle dans la régulation de la différenciation neuronale en outre l'ENS.
L'oxyde nitrique synthase (NOS) est le neurotransmetteur de relaxation primaire trouvé dans l'ENS, et est proportionnellement augmenté dans les neurones ENS long de l'intestin dans HSCR 5. En outre, des altérations dans le peptide intestinal vasoactif (VIP), un neurotransmetteur qui participe également à la médiation de la relaxation des muscles et réguler l'écoulement de sang le long de la paroi intestinale, se trouvent dans des modèles HSCR 5. Ces données suggèrent que, dans le but de comprendre comment l'échantillononents de l'ENS régulent sa fonction, un examen systématique des différents neurotransmetteurs devrait être entrepris. Les techniques présentées ici peuvent être facilement adaptés pour permettre ce type d'analyse en utilisant des anticorps appropriés.
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Acknowledgments
Ce travail a été soutenu PAR LE American Pediatric Surgical Association Foundation Award (AG) et les National Institutes of Health K08DK098271 (AG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline | Oxoid | BR0014G | |
| Sucrose | Fisher | S2 | |
| Sodium azide | Fisher | BP9221 | |
| Bovine serum albumin | Fisher | BP1605 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| 60 mm Petri dishes | Fisher | FB0875713A | |
| Fluorescence microscope | Nikon | SMZ-18 stereoscope | |
| Dissection microscope | Nikon | SMZ-18 stereoscope | |
| Fine forceps | Fine science tools | 11252-20 | |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | VWR | 20170-038 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech, Birmingham, AL | 0100-01 | |
| Glass slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Cover glass | VWR | 16004-330 | |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon A1 | |
| Nikon Elements | Nikon |
References
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